Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Il nostro metodo privo di esogeni per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano è la risposta ai problemi di biosicurezza relativi alla terapia cellulare quando viene considerata per l'applicazione traslazionale. I nostri metodi di isolamento ed espansione sono semplici da replicare, rapidi e con requisiti tecnici ridotti, rendendoli utili a tutti. Studiamo la strategia terapeutica basata sulle cellule staminali adipose umane per la riparazione dei nervi periferici.

Tuttavia, la nostra tecnica può essere ampiamente applicata quando sono necessarie nuove cellule staminali adipose in diverse configurazioni di ricerca clinica. Abbiamo mantenuto la semplicità per conservare una più facile producibilità. La sterilità deve essere attentamente osservata dalla sala operatoria fino alla coltura cellulare.

Per la manipolazione dei campioni e dei frammenti, la microdissezione è a rischio di contaminazione. Dopo aver ottenuto il campione di tessuto adiposo dalla chirurgia plastica addominale, usando forbici sterili, tagliarlo in pezzi di circa un centimetro quadrato. Con un bisturi, micro sezionare ogni pezzo in frammenti più piccoli e disperdere cinque frammenti in una capsula di Petri di 10 centimetri.

Per l'attacco del frammento, utilizzare un bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica e trascinare ogni frammento. Delicatamente, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli e incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Monitorare quotidianamente l'espansione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano, o HASC, al microscopio ottico fino a quando le cellule non diventano confluenti.

Sostituire il mezzo con un nuovo mezzo completo ogni 72 ore per rimuovere i detriti cellulari e lasciarli crescere fino al primo passaggio. Una volta che la coltura HASC raggiunge il 70-80% di confluenza, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto usando pinzette sterili. Inoltre, scartare il mezzo esaurito evitando il distacco dell'HASC dalla capsula di Petri.

Lavare accuratamente le cellule con 10 millilitri di PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere un millilitro di tripsina senza animali e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Verificare il distacco delle cellule al microscopio ottico e incubare per altri due minuti, se necessario.

Per sostenere il distacco della cella, picchiettare delicatamente sulla superficie di plastica. Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo due millilitri di mezzo completo e raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 millilitri. Rimuovere la tripsina rimanente mediante centrifugazione.

Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le celle in un mezzo completo da cinque millilitri e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Per la crioconservazione, contare un'aliquota di cellule staccate utilizzando il contatore di cellule sotto un microscopio ottico. Centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le cellule nella miscela di congelamento ad una densità di una volta 10 alla sesta cellula per millilitro e trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una fiala di crio. Mettere le fiale criogeniche a meno 80 gradi Celsius in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di un grado Celsius al minuto e quindi spostare le fiale criogeniche in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Nell'aspetto iniziale del cluster, gli HASC mostravano una classica forma a fuso ed erano più piccoli, oltre che più allungati rispetto alle celle di controllo in presenza di FBS.

L'immunofenotipo cellulare sembrava essere simile tra gli HASC coltivati con i due integratori. Più dell'80-90% degli HASC erano positivi per CD73 e CD105 e meno del 5% espressi per CD34 e CD45. Infine, il test di proliferazione ha rivelato un aumento significativo della crescita cellulare quando il lisato piastrinico umano è stato aggiunto al terreno rispetto al controllo FBS.

Il passo più importante è la micro dissezione dei frammenti adiposi e il loro attacco con incisione a bisturi sulla piastra di Petri. Si ottiene una popolazione di cellule staminali derivate da adiposo umano pronta all'uso nel rispetto dei criteri di biosicurezza GMP, mantenendo le proprietà terapeutiche delle cellule e migliorando la proliferazione cellulare.