Siamo grati a S. Tommaso, che ha avviato questo progetto, J. Hermann e U. Burgbacher aiuto nella costruzione del setup FIM. Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SFB 629 B6).

NOTA: Qui, l&#39;uso di FIM è presentato per pratico analisi ad alta velocità di locomozione larvale per lo screening in condizioni di assenza di movimento e sotto l&#39;influenza di uno stimolo termico. Altre applicazioni quali l&#39;analisi degli stimoli olfattivi locomozione dipendente o alta risoluzione per immagini di comportamenti di laminazione o di altri potrebbe aver bisogno di piccole modifiche al protocollo, che sono disponibili su richiesta. 1. Set-up of Experiments <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzare circa 100 larve per genotipo in totale (tempo di 1 ora richiesto) per ottenere valori statisticamente significativi. NOTA: Nel caso di più genotipi devono essere confrontate e registrato in giorni diversi, registrare lo stesso numero di larve per genotipo al giorno. </li><li> Per la maggior parte delle applicazioni, record a 10 Hz per l&#39;analisi dei parametri. Per le applicazioni di imaging ad alta risoluzione, variare la velocità delle immagini, se necessario. </li><li> Per il monitoraggio di terzo stadio larve, condurre esperimenti circa 120 ore dopo la deposizione delle uova. Fai sure che le culture resa abbastanza larve nel periodo sperimentale (vedi 4.3). </li><li> Per le applicazioni non-stimolo, preparare una superficie di scansione contenente agar traslucido (vedere paragrafo 2). Per contenere le larve nella gamma di stimolo per l&#39;applicazione del gradiente termico, circondare il campo visivo con una avversiva barriera di agar sale (vedi sezione 3). NOTA: Altre applicazioni possono richiedere diverse superfici. </li><li> Assicurarsi di utilizzare una camera con condizioni costanti ambientali (temperatura, luce, flusso d&#39;aria, umidità dell&#39;aria, ecc). </li></ol> 2. Crawling Preparazione della superficie (Translucent Agar) NOTA: Nella configurazione FIM si aggiunge una superficie agar per fornire una superficie crawling umida. Inoltre, migliora anche proprietà di illuminazione. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Far bollire 0,8% commestibile agar in acqua ultrapura deionizzata. Per applicazioni di screening preparare 400 ml. </li><li> Versare agar a 50 ° C (a mano caldo) su un separato 33 centimetri x 33 cm acPiastra rylic-vetro. La tensione superficiale della agar e quindi la temperatura definiranno lo spessore della lastra agar. A 50 ° C, spessore 2 mm lastre di agar sono ottenuti. Non agitate dopo l&#39;ebollizione e versare costantemente per evitare le bolle. Preparare lastre freschi agar per ogni periodo di imaging di circa 4 ore. </li><li> Riempire piatti standard 6 centimetri di Petri con il restante soluzione agar 0,8% per ordinare, pulito e abituare le larve prima dell&#39;esperimento (1 piatto per genotipo). </li><li> Nel caso in cui è necessaria una barriera agar avversiva per l&#39;applicazione, passare alla sezione 3. </li><li> Tagliare circa 2 cm del perimetro della lastra agar per ottenere una superficie piana quadrata per la registrazione. Rimuovere l&#39;agar in eccesso. NOTA: La dimensione dipende dall&#39;applicazione. </li><li> Trasferire la lastra agar al setup FIM subito dopo il raffreddamento spingendo delicatamente l&#39;agar deltaplano sopra il bordo della lastra di vetro acrilico. </li></ol> 3. Opzionale: Aggiunta di un avversivo Agar Barriera al Crawling Surface (Salt Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Far bollire 2,5% commestibile agar con 3 M NaCl in acqua ultrapura deionizzata. Per lo screening in un gradiente termico di preparare 200 ml. NOTA: Il volume dipende dall&#39;applicazione. </li><li> Tagliare una tacca di 2 cm in precedenza versato strisciando superficie circostante il campo di vista (22 x 22 cm). NOTA: Diverse forme barriera e campi di visualizzazione possono essere necessarie a seconda dell&#39;applicazione. </li><li> Riempire la tacca con agar sale 0.1-0.3 cm rispetto alla superficie di rilevamento. </li></ol> 4. Fly Handling <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posteriore vola in 25 ° C incubatore con la luce 12 ore / buio ciclo adeguato per il tempo dell&#39;esperimento sul cibo standard di volo al 65% di umidità dell&#39;aria. </li><li> Per croci, anestetizzare 30 vergini mosche femmine e 8 maschi con CO 2 ed attraversarle in 130 flaconi di coltura ml con 35 ml di cibo. NOTA: One 130 ml cultura flacone con 35 ml cibo produrrà circa 20-30 lmangiato terzo instar larve nel giro di imaging di 4 ore. Imaging e monitoraggio opere per tutte le fasi stadio larvale. </li><li> Eliminare un po &#39;d&#39;acqua in flaconi di coltura di guidare in ritardo al terzo stadio larvale movimento e raccogliere il maggior larve dalle pareti della fiala con un piccolo pennello. </li><li> 2-5 min prima della registrazione, trasferimento larve per un video a una piastra di Petri contenente 0,8% commestibile agar in acqua ultra pura deionizzata per abituare e pulirli. </li></ol> 5. Regolazione del Setup FIM Imaging per Recordings (non Stimolo condizioni) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Regolare la macchina fotografica messa a fuoco dell&#39;obiettivo e il diaframma, se necessario. Impostare il tempo di esposizione per la rispettiva telecamera. NOTA: Queste impostazioni non hanno bisogno di essere cambiato nel corso di un esperimento. </li><li> Regolare intensità di illuminazione per ottenere un buon contrasto creando l&#39;immagine larva. </li><li> Mantenere le condizioni ambientali in costante stanza durante le registrazioni. Oscurare la stanza per non disturbare le larve con luce direzionale. </li></ol> 6. Opzionale: Regolazione della Setup FIM Imaging per Recordings (Graduale Temperatura stimolo Condizioni) NOTA: Il dispositivo di gradiente termico è un cm 3 piastra di alluminio 42 x 42 x 0,2 con una vernice nera opaca e materiale isolante sul sito principale. La piastra è perfuso con acqua da due diversi circuiti collegati ai bollitori / refrigeratori e pompe ad entrambe le estremità (vedere Figura 1B). Le temperature possono essere regolate da -5 a +50 ° C. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Accendere il gradiente termico dispositivo 1 ora prima degli esperimenti e posizionarlo sopra l&#39;installazione per consentire l&#39;elaborazione del profilo di temperatura desiderata e componenti per equilibrare. </li><li> Trasferire la scansione agar superficie con una barriera di sale al setup. </li><li> Posizionare la piastra del radiatore sulla agar e regolare la distanza tra la piastra e la superficie di scansione 2 mm (~ 1 mm sopra larve). </li><li> Stabilire un gradiente lineare dialmeno 0,8 ° C / cm da 34 ° C (circa. 2 cm dalla barriera nel campo visivo) a 18 ° C (circa. 2 cm dalla barriera al lato opposto del campo visivo) regolando la temperatura dei circuiti idrici a 1 ° C e 45 ° C. NOTA: Different proprietà gradiente della piastra metallica richiedono diverse temperature che devono essere accertata empiricamente. Queste impostazioni non devono essere cambiate durante gli esperimenti. </li><li> Regolare le impostazioni come descritto nella sezione 5. </li><li> Lasciare la superficie strisciando per equilibrare nel gradiente prima degli esperimenti per 20 min. Testare il gradiente di temperatura con un pirometro. </li><li> Procedere con la sezione 8. </li></ol> 7. Imaging FIM (non Stimulus Condizioni) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzare un piccolo pennello bagnato per raccogliere delicatamente 15 larve dalle piastre di Petri assuefazione e trasferirli al centro della superficie di tracking. Non trasferire cibo rimane o troppoacqua (vedi 7.8). </li><li> Record 1-50 larve su un 22 centimetri x 22 centimetri zona di monitoraggio. Utilizzare 15 animali per video per la maggior parte delle applicazioni di screening (per ragioni statistiche utilizzano almeno 100 individui per genotipo). </li><li> Separare delicatamente larve e attendere per circa 10-20 secondi fino a quando tutte le larve ha iniziato a muoversi subito prima della registrazione. </li><li> Registrare locomozione larvale per 2 minuti a 10 fotogrammi al secondo per le condizioni non di stimolo. Usare le immagini tif non compresse come formato di output. </li><li> Durante la registrazione, raccogliere le larve per il prossimo video da flaconi per abituare loro Critical:. Non disturbare larve registrata con la luce. </li><li> Dopo la registrazione, rimuovere le larve con un grande pennello e gettarli in conformità alle norme di sicurezza e la legislazione locale. </li><li> Dopo aver tolto le larve, utilizzare il pennello per pulire e idratare la superficie strisciante con ultra acqua deionizzata pura. </li><li> Critico: Mantenere la superficie umida in ogni momento, ma evitare un&#39;eccessiva moisture, che può essere visto come aloni o gocce larve nelle registrazioni circostanti e disturbare il monitoraggio. </li></ol> 8. Opzionale: Imaging FIM (Graduale Temperatura stimolo Condizioni) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dopo aver stabilito il gradiente di temperatura (vedi sezione 6), preparare il software di registrazione per la registrazione entro 20 sec istante dopo aver piazzato le larve sulla superficie strisciante (vedi 8.2), ad esempio, impostare il numero di fotogrammi al video e definire il percorso di salvataggio. </li><li> Sollevare la piastra del radiatore leggermente e posizionare le larve a 33 ° C 2 cm dalla barriera di sale. Fare riferimento a 6. e 7. per ulteriori istruzioni generali. Abbassare nuovamente la piastra radiatore e avviare la registrazione per 3-4 minuti subito dopo larve iniziato a muoversi subito. </li><li> Dopo la registrazione, rimuovere le larve direttamente, pulito e idratare la superficie. Non toccare l&#39;agar sale per evitare la diffusione di NaCl. </li><li> Critico: Mantenere la superficie umida in ogni momento, ma evitareeccessiva umidità, che può essere visto come aloni o gocce larve nelle registrazioni circostanti e disturbare il monitoraggio. </li><li> Lasciare la superficie agar per equilibrare di nuovo dopo idratante per 1-2 minuti, mentre il salvataggio delle immagini e la raccolta di nuovi animali prima di preparare per il prossimo video. Controllare il gradiente di temperatura con un pirometro ogni 5 video e regolare dispositivo temperatura se necessario (temperatura dell&#39;acqua, l&#39;altezza e l&#39;orientamento xy rispetto alla superficie di inseguimento). </li></ol> 9. Monitoraggio di larvale Locomotion NOTA: Per ulteriori informazioni si veda il manuale allegato per FIMTrack (supplemento). Per un diagramma di flusso del programma vedi figura 2. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Regolare i parametri di monitoraggio per i rispettivi esperimenti utilizzando l&#39;opzione di anteprima. <ol><li> Regolare pixel per cm secondo fotocamera e il campo visivo. </li><li> Regolare fotogrammi al secondo in base alle impostazioni della fotocamera. </li><li> Regolare soglie di luminosità così tha tutti gli animali vengono rilevati correttamente (le risposte sono date nell&#39;anteprima). </li><li> Regolare larvali soglie dimensionali dell&#39;area. Nota l&#39;opzione di feedback nell&#39;anteprima: singoli animali sono evidenziate in giallo, scontrandosi larve sono evidenziati in rosso e l&#39;area di ogni animale è dato in blu. </li></ol></li><li> Inizia il monitoraggio utilizzando il pulsante in basso a destra. NOTA: Dopo il successo di monitoraggio, una immagine con tracce larvali e un file CSV contenente le caratteristiche di locomozione e postura calcolato viene memorizzato nella directory delle immagini. </li><li> Utilizzare il modulo viewer Risultati FIM (Modifica&gt; Risultati Viewer ...) a rivedere e regolare manualmente i risultati di monitoraggio. Se necessario, definire regioni di stimolo per valutare i dati relativi al regime di stimolo ad esempio, strisciando orientamento rispetto al gradiente termico o la distanza di una sorgente odorizzante. Per una descrizione più dettagliata si prega di utilizzare il manuale (supplemento). </li></ol> 10. La valutazione dei dati <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importare il file CSV in Excel, Matlab o qualsiasi altro programma per ulteriori analisi statistiche. </li></ol>

<ol>
	<li>Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Vision-Based+Algorithm+for+Decision+Making+in+Flying+Drosophila.">A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila.</a> Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+loop+between+neurobiology+and+flight+behavior+in+Drosophila.">Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).</li><li>Fry, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aerodynamics+of+Free-Flight+Maneuvers+in+Drosophila.">The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila.</a> Science. 300 (5618), 495-498 (2003).</li><li>Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+3D+tracking+paradigms+for+freely+flying+insects.">Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects.</a> EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).</li><li>Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object+tracking:+A+Survey.">Object tracking: A Survey.</a> ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).</li><li>Pistori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+and+larvae+tracking+using+a+particle+filter+with+an+auto-adjustable+observation+model.">Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model.</a> Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PloS one. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+high-resolution+on-chip+optofluidic+microscopes+for+Caenorhabditis+elegans+and+cell+imaging.">Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).</li><li>Heng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+Microscopy+-+a+Method+for+Implementing+a+High+Resolution+Optical+Microscope+on+a+Chip.">Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip.</a> Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).</li><li>Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-electro-fluidic+grids+for+nematodes:+a+lens-less,+image-sensor-less+approach+for+on-chip+tracking+of+nematode+locomotion.">Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion.</a> Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).</li><li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EthoVision+video+tracking+system--a+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice.">The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li><li>Yu, C. -. C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PloS one. 8 (7), e69653 (2013).</li><li>Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sampling+and+decision+making+in+Drosophila+chemotaxis.">Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis.</a> Nature communications. 2, 441 (2011).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis.">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li><li>Risse, B., Thomas, S., Otto, N., L&#246;pmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM,+a+Novel+FTIR-Based+Imaging+Method+for+High+Throughput+Locomotion+Analysis.">FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis.</a> PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).</li><li>Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+subtle+locomotion+phenotypes+of+Drosophila+larvae+using+internal+structures+based+on+FIM+images.">Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images.</a> Comput Biol Med. 14, (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

In neuroscienze comportamentali è obbligatorio decifrare quantitativamente tratti comportamentali complessi. Sono necessari dunque, un gran numero di persone devono essere osservate ad alta risoluzione e automatizzate le procedure per l&#39;analisi statistica. Qui, l&#39;imaging FIM è descritto, un romanzo, l&#39;installazione di immagini semplice e robusto, che fornisce i mezzi per monitorare locomozione di una vasta gamma di animali. L&#39;efficacia del setup di imaging FIM è stata testata utilizzando Drosophila larve, vermi piatti planaria e C. vermi elegans. La tecnologia FIM fornisce intrinsecamente alto contrasto per rilevare anche strutture interne degli animali, come il cervello, trachea, l&#39;intestino o proventricolo. È importante sottolineare che queste strutture interne robusto sono identificati in modo che possano servire per identificare automaticamente l&#39;orientamento dell&#39;animale 19. La qualità dei film può essere influenzata dalla quantità eccessiva di acqua sulla superficie di scansione. Pertanto, è fondamentalecontrollare l&#39;umidità del agar. Troppo vecchio acqua agar o troppo sulla superficie può causare artefatti. Allo stesso modo, assicurarsi che non bolle d&#39;aria sono compresi nella superficie scansione. In generale, una superficie agar ben preparato consente la registrazione di filmati per 4 ore. A causa dei principi fisici alla base di imaging FIM genera quasi rumore registrazioni di immagini gratuito, con un conseguente qualità di immagine eccellente. Ciò consente la successiva analisi di immagini computer-based e consente un elevato throughput. Tuttavia, la metodologia è limitato all&#39;analisi di animali che contattano direttamente la superficie agar. Il software di monitoraggio è sfidato da animali che forma una forma di ciambella. Anche se un indicatore binario riconosce la forma di ciambella, una spina errato potrebbe essere calcolato. Grazie alla costruzione modulare del tavolo di monitoraggio dual e triple immagini a colori è a portata di mano. Inoltre, altri stimoli (luce, odori, stimoli elettrici o meccanici) possono facilmente essere delivered dall&#39;alto. Il programma FIMTrack progettato per abbinare il potere delle immagini FIM può essere facilmente adottato per monitorare Drosophila larve, C. elegans o planarie. Così e grazie alla sua costruzione semplice ed economico (vedi http://FIM.uni-muenster.de), l&#39;imaging FIM è fattibile per una vasta gamma di applicazioni biomediche e in particolare consente di urgenza studi elevati di throughput.

Maggior parte degli animali hanno la capacità di muoversi in modo altamente sofisticato e controllato. Per decifrare la base sottostante di controllo locomozione genetico è obbligatorio valutare quantitativamente modelli comportamentali diversi. A questo proposito, Drosophila può servire come un modello ideale. Monitoraggio di volare liberamente Drosophila è allettante 1-4 ma strisciare di Drosophila larve avviene in due dimensioni a velocità relativamente bassa e può quindi essere controllato facilmente. Setup basato su telecamera in combinazione con un&#39;illuminazione adeguata vengono utilizzati per acquisire immagini 5. Entrambi incidente o la luce trasmessa è impiegato in esperimenti comportamentali 6,7. Tuttavia, a causa del corpo semi-trasparente delle larve e possibili riflessi di luce della superficie di scansione registrazione fedele dei movimenti larvali può essere difficile. Per superare tali problemi, sono stati ideati alcuni metodi complessi. Recentemente, illuminazione campo scuro è stato introdotto per migliorare in primo piano / sfondo contRAST 8. In alternativa alla registrazione basato su telecamera, imaging ottico lente-meno e image-sensore-less on-chip sono state introdotte tecniche di acquisizione 9-11. Sono stati introdotti di recente diversi programmi di monitoraggio, includendo in commercio software 12 e personalizzate soluzioni. Esempi di programmi di monitoraggio ad elevato throughput sono il Worm Tracker Multi (MWT) 13 e Multianimal deambulazione e Track (Magat) 8. Entrambi hanno in comune, che più gli animali possono essere monitorati in un unico un&#39;arena aperta campo in modo che gli animali in collisione portano a molteplici nuove identità degli animali. Per superare questo limite, una configurazione multi-pozzo è stata introdotta la separazione 12 animali in singoli pozzetti 14. Quantificazione precisa di locomozione di singoli individui può essere ottenuto utilizzando una fase mobile di inseguimento in combinazione con un microscopio 15. Tuttavia, tutti questi approcci sono o costo inefficienti, mancanza sufficienti resoluzione o troppo tempo per alta fenotipizzazione produttività. Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato FIM (Metodo Imaging basato FTIR) basato su Frustrated Total Internal Reflection (FTIR) 16 (Figura 1). Questo nuovo approccio di imaging offre un elevato contrasto senza precedenti e permette anche la registrazione multi-colore di strisciare animali 16. Il principio alla base di questo metodo pratico ed efficace è facile. Un piatto di vetro acrilico è inondato di luce (ad esempio, 875 nm infrarosso). A causa dei diversi indici di rifrazione di vetro acrilico e aria, la luce viene riflessa totalmente al confine vetro / aria. Nessun riscaldamento del vetro acrilico è notato 16. Solo se gli oggetti con un indice di rifrazione più alto toccare il tavolo luminoso, può illuminare entrare in questi oggetti. Se gli animali toccano la superficie, luce viene riflessa e può essere catturato dal basso (Figura 1). Di conseguenza, solo il contattozona degli animali appare come un punto luminoso, che permette l&#39;imaging dettagliato con uno sfondo nero globale. Così, FIM imaging consente di registrare filmati perfetti per gli algoritmi di visione artificiale. L&#39;utilizzo semplice e robusto di FIM ora porta dettagliata analisi high throughput del comportamento animale complesso in mano e può essere utilizzato per studiare le informazioni di trasformazione: ad esempio, l&#39;olfatto 8, 16; visione 17 o thermosensation 18. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. configurazione FIM con integrazione di calore-stimolo e principi fisici sottostanti. (A) L&#39;impostazione FIM. Intensità di illuminazione può essere regolata dal pannello frontale. (B) Per fornire uno stimolo termico, una piastra di alluminio verniciato nero, perfusi con acqua calda e fredda su entrambi i lati, è disposto 2 mm dalla superficie di agar chesé è spessore 2 mm. Il gradiente è stabilito sulla piastra radiatore di calore e l&#39;agar dalle differenze di temperatura (C) Il principio fisico della riflessione interna totale. Una lastra di vetro acrilico viene illuminato da luce infrarossa. θ 1, θ 2, θ e 3 indicano gli angoli di riflessione della luce. n A, n 1, n 2 e n 3 indicano gli indici di rifrazione dell&#39;aria, vetro acrilico, agar e la larva rispettivamente e compiere la disuguaglianza n A &lt;n 1 &lt;n 2 &lt;n 3. A causa rifrazione, l&#39;angolo di riflessione cambia durante la transizione. Se l&#39;angolo è sotto l&#39;angolo critico, la luce non si riflette più, può passare attraverso gli strati e può essere catturato da sotto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La spectrum di processi che possono essere analizzati da FIM è ampio. Senza ulteriori aggiustamenti, immagini FIM può essere utilizzato per monitorare tutte le fasi larvali di Drosophila (Figura 5B) o può essere usato per seguire le impronte di piede-adulto Drosophila 19. Analogamente, le traiettorie di C. elegans o il movimento di vermi piatti planaria può essere facilmente registrati (Figura 5C). Anche l&#39;analisi della crescita ifa o radice dei capelli fungina appare fattibile 19. Nella nostra attuale configurazione FIM, 4 x 16 diodi emettitori di luce infrarossa (IR LED) sono integrati in un cm 2 lastra di vetro acrilico 32 x 32, chiamata tabella di rilevamento (Figura 1). L&#39;intensità del IR-LED viene regolata in funzione del peso degli oggetti sulla tabella di rilevamento, che può essere fatto facilmente da un microcontrollore collegato al circuito tramite modulazione di larghezza di impulso (PWM). FIM produce immagini molto alto contrasto su una vasta gamma di intensità di illuminazione. Importante, gennomiche ottimi risultati a già basso irridation infrarossi generale. Una fotocamera con un filtro a infrarossi è posto sotto la tabella di monitoraggio, che consente l&#39;integrazione di altri stimoli nel setup. Stimoli di calore possono essere facilmente applicati da una piastra radiatore di calore e stimoli luminosi sono applicati da un proiettore LCD. Anche odoranti possono essere contenuti in gradienti da coperchi semplici 8. Per gli esperimenti gradiente di calore, la piastra radiatore di calore è perfuso con acqua calda e fredda su entrambi i lati rispettivamente e disposto 2 mm dal larve (Figura 1B). La generazione di alto contrasto, filmati di alta qualità apre la possibilità per sofisticate analisi delle immagini computer basato, quindi abbiamo implementato il software FIMTrack per estrarre un grande insieme di caratteristiche da immagini (Figura 2). Primi sei caratteristiche principali sono definite dal contorno dell&#39;animale (Figura 3A). Queste caratteristiche forniscono la linea di baseper ulteriori calcoli di sei caratteristiche secondarie che descrivono la forma animali e la sua posizione in determinati stimoli in un dato punto di tempo (Figura 3B). Attualmente, nove funzioni terziarie sono calcolati che sono integrando aspetti temporali e quindi caratterizzano la locomozione dell&#39;animale insieme con le caratteristiche primarie e secondarie (Figura 3C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. Panoramica FIMTrack, il flusso di lavoro e la rappresentazione algoritmica larvale. (A) Come utilizzare FIMTrack. Le immagini vengono caricate. Grigio soglia di valore e limiti numerici larvali definiscono solo le larve devono essere impostati. L&#39;area larvale deve essere in [min-size, max-size]. Monitoraggio viene avviato dal pulsante evidenziato. Workflow (B) di inseguimento. Dopo il pulsante di avvio si fa clic, l&#39;immagine di sfondo è calculated (intensità minima nel tempo). Finché ci sono fotogrammi di sinistra, le larve sono segmentati in base alla soglia grigio e il MIN e soglia di max-size. Per tutte le segmentazioni le rappresentazioni larvali sono calcolati (confrontare (C)). Ogni nuovo modello è associato ad una determinata traiettoria se una traccia valido è disponibile. Se si raggiunge l&#39;ultimo fotogramma, finalizzando la post-elaborazione viene eseguita seguita dalla generazione di uscita. (C) rappresentazione larvale. L&#39;animale è costituito da una testa e un punto di coda (h e t). Tra questi punti un arbitrario numero dispari di punti della colonna vertebrale s i può essere impostato con un raggio r i. Inoltre, il centro di massa m ed il corpo principale piegatura γ angolari sono calcolati. Diversi parametri di movimento correlati sono delineati da linee viola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. Caratteristiche calcolati da FIMTrack. (A) le caratteristiche primarie basata sul contorno degli animali. (B) le caratteristiche secondarie, sulla base di caratteristiche primarie. (C) funzioni terziarie, sulla base di caratteristiche primarie in fotogrammi consecutivi e ulteriori ingressi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

L&#39;analisi della funzione di rete neuronale richiede una misura affidabile di tratti comportamentali. Poiché il comportamento degli animali liberi di muoversi è variabile in una certa misura, molti animali devono essere analizzati per ottenere dati statisticamente significativi. Questo a sua volta richiede un computer assistita quantificazione automatizzata di modelli locomozione. Per ottenere immagini ad alto contrasto di oggetti in movimento quasi traslucidi e piccoli, è stata sviluppata una tecnica di imaging romanzo basato sulla riflessione interna totale chiamato FIM. In questa configurazione, gli animali sono illuminate solo con luce infrarossa nella posizione molto specifico di contatto con la superficie sottostante scansione. Questa metodologia si traduce in immagini molto alto contrasto. Successivamente, queste immagini ad alto contrasto vengono elaborate utilizzando algoritmi di monitoraggio contorno stabiliti. Sulla base di questo, abbiamo sviluppato il software FIMTrack, che serve ad estrarre un numero di caratteristiche necessarie per descrivere quantitativamente una grande varietà di locomozioneCaratteristiche. Durante lo sviluppo di questo pacchetto software, abbiamo concentrato i nostri sforzi su un&#39;architettura open source che permette la facile aggiunta di ulteriori moduli. Il programma funziona piattaforma indipendente ed è accompagnata da un interfaccia grafica intuitiva che guida l&#39;utente attraverso l&#39;analisi dei dati. Tutti i valori di parametro locomozione sono espressi in forma di file CSV, per permettere ulteriori analisi dei dati. Inoltre, un visualizzatore Risultati integrato nel software di monitoraggio fornisce l&#39;opportunità di rivedere in modo interattivo e regolare l&#39;uscita, come potrebbe essere necessario durante l&#39;integrazione di stimolo. Il potere di FIM e FIMTrack è dimostrato studiando la locomozione di Drosophila larve.

Per l&#39;imaging più videocamere differenti con differenti caratteristiche di risoluzione sono stati testati (Figura 4). Tutte le telecamere dove dotati di un filtro IR adeguato. Secondo la bassa risoluzione della telecamera più basso costo in questa prova, il campo visivo è limitato a 10 cm x 10 cm. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando una 4 megapixel (MP) della fotocamera. Questo porta ad una risoluzione di 100 pixel per terzo stadio larvale lunghezza e ha permesso di riconoscere facilmente strutture interne. Inoltre, la peristalsi dell&#39;animale può essere facilmente estratto (Figura 4A). Tuttavia, si può ancora ottenere i film ad alto contrasto con fotocamere meno costosi, che possono anche essere analizzati da FIMTrack. Utilizzo di una fotocamera 1,4 MP con una profondità di 8 bit e una risoluzione di 1.392 x 1.040 pixel è circa metà del prezzo e permette una risoluzione di 45 pixel per terzo stadio larvale lunghezza nel campo visivo. La testa ma non altre strutture interne possono essere riconosciute (Figura 4B). Tracking e rilevamento della peristalsi è possibile, ma la precisione è ridotta (Figura 4B). Con una più economica 0.8 MP con una risoluzione spaziale paragonabile alla fotocamera 1.4 MP, la testa larvale non può essere riconosciuto più fedelmente (Figura 4C). Il monitoraggio e l&#39;analisi peristalsi è possibile, ma di cui più jitter sulla base della maggiore rumore. Sorprendentemente, anche a bassa risoluzione webcam USB offre film di qualità sufficienti per calcolare traiettorie larvali (0.3 MP fotocamera, sotto i 20 €, Figura 4D). La peristalsi può essere calcolata l&#39;area misurazioni sono molto rumoroso. Nella nostra messa a punto abbiamo abitualmente utilizza la fotocamera 4 MP. Per lo screening, questa fotocamera permette di monitorare un 22 centimetri x 22 centimetri arena, che offre ovviamente la possibilità di analizzare un gran numero di animali contemporaneamente, così che l&#39;analisi ad alta velocità è possibile. Con questa impostazione, la lunghezza larvale is rappresentato da 40 pixel che consente ancora la registrazione e l&#39;analisi della peristalsi. Un&#39;immagine esemplare 15 traiettorie larvali in un gradiente termico è data in Figura 5A. Inoltre, l&#39;uso di una lente macro immagine permette di larve con risoluzione molto elevata dove molti organi interni diventano visibili e riconoscimento della testa è ulteriormente migliorata (Figura 5B). Inoltre questi possono essere utilizzati per ulteriori analisi più dettagliate dei comportamenti di una vasta gamma 20. La stessa configurazione può essere facilmente utilizzato per la scansione di immagini C. vermi elegans (Figura 5C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4. di imaging e di monitoraggio dei risultati FIM per diverse fotocamere. (A) a sinistra: l&#39;imaging FIM tre larve che striscia su un palco di monitoraggio 10 centimetri x 10 centimetri acquisite utilizzando una fotocamera a 4 MP con 10 fps. Mid:Clipping e centro di traiettoria massa di una singola larva. Viene indicata la zona dell&#39;animale. A destra: Area della larva tracciato oltre 100 fotogrammi. La freccia rossa indica il punto ora dell&#39;immagine ritagliata. (B) Equivalente a (A), ma catturato con una telecamera 1,4 MP. (C) Equivalente a (A), ma catturato con una telecamera 0,8 MP. (D) Equivalente a ( A), ma acquisite utilizzando una fotocamera 0.3 MP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> Figura 5. stimolo di calore, e ad alta risoluzione applicazioni. (A) applicazione stimolo termico (confrontare la Figura 1). Traiettorie calcolati via FIMTrack. Immagine applicazione ad alta risoluzione di un terzo, secondo e primo larva instar utilizzando un obiettivo macro (B). Il terzo stadio larvale lunghezza è rappresentata da 400 pixel in un campo di vista di 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans verme catturato utilizzando immagini FIM. Barre di scala sono indicati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis at JoVE.com

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM è un nuovo sistema, il costo di imaging efficace progettato per monitorare piccoli oggetti in movimento, quali C. elegans, planaria o Drosophila larve. Il programma FIMTrack di accompagnamento è stato progettato per fornire analisi dei dati veloce ed efficiente. Insieme, questi strumenti permettono analisi high-throughput di tratti comportamentali.

FIM Imaging e FIMtrack: due nuovi strumenti che ad alta produttività e costo effettivo Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM è un nuovo sistema, il costo di imaging efficace progettato per monitorare piccoli oggetti in movimento, quali C. elegans, planaria o Drosophila larve. Il programma FIMTrack di accompagnamento è stato progettato per fornire analisi dei dati veloce ed efficiente. Insieme, questi strumenti permettono analisi high-throughput di tratti comportamentali. 

Video: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

Progettazione e Costruzione di un Headstage conveniente per simultanea Stimolazione Neurale e registrazione nel Labirinto d&#39;acqua

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Due Algoritmi per high-throughput e multi-parametrica Quantificazione degli<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

High-throughput analisi del comportamento motorio nell'analisi di Isola della drosofila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...