Ringraziamo il personale e veterinari presso il Dipartimento di Medicina comparativa, Tempio, Texas Scott &amp; White Hospital, per i loro consigli e la preziosa collaborazione durante lo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da L&#39;Istituto per la medicina rigenerativa Programma Fondi, Scott &amp; White RGP concessione # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Ringraziamo il dottor Suzanne Zeitouni per proofing il manoscritto.

NOTA: Questo protocollo è progettato per nude (Nu / J) femmine di topo (18-25 g, 6 settimane) acquisito da Jackson Laboratories. Dal momento che i ceppi di topi variano leggermente in termini di anatomia e il tasso di crescita, si consiglia che la fabbricazione dei pin è ottimizzato per il ceppo, il sesso e l&#39;età dei destinatari prima dell&#39;impianto in soggetti vivi. Se i ceppi sono accuratamente abbinati, l&#39;accoppiamento ad interferenza tra il perno e osseo cavità è altamente riproducibile. Procedure per l&#39;edilizia abitativa, la dieta e l&#39;allevamento degli animali in generale sono oltre la portata di questo protocollo, ma tutti i topi sono stati alloggiati in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° edizione) e politiche istituzionali stabilito dalla cura degli animali e Istituzionale Utilizzare Comitato (IACUC) e Dipartimento di Medicina comparativa (DCM) a Scott e White Hospital. 1. Realizzazione di pin <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot; /&gt; Figura 2: assemblaggio Pin. (A) Le fotografie del tubo d&#39;acciaio chirurgico nelle varie fasi di montaggio e un taglio cilindro di 4 mm di diametro da 5 millimetri foglio Gelfoam spessore. (B) Dopo la lucidatura il perno montato (sopra), il cilindro Gelfoam sia livellato, posizionato sopra l&#39;acciaio collare (centrale), poi autoclave, risultante in un perno sterile rivestito con Gelfoam essiccato. Questo migliora l&#39;adesione cellulare al sito di lesione e mantiene la direzione di guarigione (sotto). (C) Un femore asportato dotata del perno midollare. (D) Esempi di assiemi pin a vari spessori e lunghezze dimostrando la flessibilità di questo approccio. (E) μCT ricostruzione di un difetto femorale pin-stabilizzato illustra l&#39;interazione del perno con midollare dell&#39;osso trabecolare nella estremità prossimale e distale del femore. <ol><li> Tagliare una lunghezza 9 millimetri di 22 G tubi ipodermico acciaio, e una lunghezza di 3 mm 19 tubo G con un pesante ruota di cut-off 23,8 millimetri in fibra di vetro rinforzata di diametro montato su un utensile rotante. Utilizzare una pinza a punta fine per immobilizzare il tubo (Figura 2A, sopra). Indossare adeguata protezione per gli occhi e gestire utensile rotante con cura. </li><li> Inserire una piccola quantità (circa 10 ml) di adesivo cianoacrilato per mezzo dell&#39;albero 9 mm. Passare il Collare 3 mm su dell&#39;albero 9 mm, fino al centro e torsione di distribuire uniformemente il collante tra il collare e l&#39;albero. Misurare dimensioni con un paio di pinze digitali e confrontare con la Figura 1. Lasciare riposare per almeno 15 ore (Figura 2A, al centro). </li><li> Utilizzare un disco smeriglio impregnato grana 220 per eliminare sbavature e colla eccessivi. </li><li> Utilizzando lo strumento rotativo, lucidare il perno con un disco di lucidatura feltro. </li><li> Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con Comprearia ssed. </li><li> Integrità test inserendo un ago ipodermico smussato 19 G sull&#39;albero del perno appena fatto e spinta contro il collare. Assicurarsi che il collare può resistere a circa 25 g di peso. </li><li> Sciacquare il perno in sterile filtrata tampone fosfato (Figura 2B, in alto). Assicurarsi che l&#39;albero del perno si inserisce perfettamente nel canale midollare del femore con il filo collare contro i bordi del taglio dell&#39;osso (Figura 2C). Prototype varie configurazioni per gli scopi specifici dello studio e del destinatario (Figura 2D). Assicurarsi che le estremità del perno penetrano nel tessuto osseo trabecolare della diafisi modo da massimizzare fissazione e migliorare l&#39;interferenza (figura 2E). NOTA: Si raccomanda che l&#39;adattamento è testato su campioni ossei prima dell&#39;impianto in topi vivi (ad esempio Figura 2C). </li><li> Utilizzare un 4 mm di diametro punch-biopsia taglierina per tagliare un cilindroda un foglio di spessore 5 mm chirurgica spugna di gelatina. Utilizzare un bisturi per tagliare il cilindro 3 mm di lunghezza e passare un ago ipodermico 20 G lungo la lunghezza del cilindro per generare un foro (Figura 2A, di seguito). NOTA: Abbiamo scoperto che il posizionamento di una gelatina o collagene ponteggio nel sito del difetto migliora la ritenzione cellulare e induce la crescita lungo l&#39;asse longitudinale dell&#39;osso. </li><li> Passare il cilindro in schiuma di gelatina sul perno e allineare con il collare (Figura 2B, centro) e autoclave su un ciclo a secco a 120 ° C a 15 psi. La schiuma di gelatina si asciuga e scurire colore (Figura 2B, in basso). </li></ol> 2. Tecnica chirurgica NOTA: La seguente procedura è scritto rispettando tutte le linee guida fissate dalla Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° edizione). Si prega di osservare tutte le politiche aggiuntivefissato dal IACUC locale e garantire un protocollo di uso animale IACUC approvato (o equivalente) sia in posizione prima di procedere con le seguenti sezioni. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> Figura 3: Strumenti chirurgici. (A) Kit chirurgico. Micro-trapano (1), taglio ruota (2), sutura assorbibile (3), sutura esterna (4), lame di bisturi (5), la maniglia bisturi (6), sterili perni midollari avvolti in un foglio (7), profondimetro midollare forma fatta tubo ipodermico (8), pinza sottile naso (9), ratto-denti pinza (10), aghi alesatura smussati (11), i driver ago (12), piccoli hemostats (13), forbici sottili (14), scollaperiostio (15), pinze modificate Kern (16) (B):. Modifiche necessarie per produrre in stile Kern osso-grip per topi. <ol><li> Selezionare una sala chirurgica procedura o di laboratorio pulito con una porta chiudibile e non nel traffico. Sterilizzare un surfac lavoro adeguatoe con un detergente disinfettante a base-quaternario grado clinico. </li><li> Indossando guanti sterili monouso e vestaglia, ha istituito un campo sterile di circa 60 x 90 cm 2 sul piano di lavoro igienizzata con drappi di stoffa autoclave. NOTA: E &#39;consigliabile avere un assistente rimuovere l&#39;imballaggio esterno e presentare i materiali sterili per la creazione del campo di investigatore. </li><li> Posizionare una piastra elettrica sterilizzata montato acqua calda ri-circolatore sul telo e coprire con teli sterili monouso. Warm uno sterilizzatore tallone di temperatura di funzionamento (250-265 ° C, questo richiede fino a 30 minuti). </li><li> Sul campo sterile, organizzare kit chirurgico (Figura 3A) per fornire un comodo accesso a tutti i componenti. Inoltre, fornire garza sterile di cotone (2 x 2 cm 2), sterile Q-punte, una ciotola di acciaio sterile (500 ml) contenente soluzione fisiologica sterile (0,9% w / v) applicatori, e clorexidina disinfettanti / alcool isopropilico chirurgica. </li><li> Assemblare un piccoloUnità anestesia degli animali accanto al campo sterile con una camera di induzione e testata cono in conformità con la guida veterinaria e il manuale utente. Usare l&#39;ossigeno di grado clinico come la fornitura di gas e isoflurano, USP. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> Figura 4: Procedura chirurgica. (AC) Approccio e l&#39;esposizione del femore. (DE) Elevation e tagli. (FK) Alesaggio e dimensionamento dei canali midollari. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> Figura 5: Procedura chirurgica. (AB) Installazione di pin. (CD) Chiusura. (E) tipica immagine di posizionato correttamente pin 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. <ol start="6"><li> Collocare un mouse nella camera di induzione del sistema anestesia e set l&#39;uscita 2 L min -1 O 2 e la concentrazione isoflurano al 3% (v / v). <ol><li> Verificare che il mouse è incosciente entro 1 min; aumentare la concentrazione al 4% (v / v) se necessario. Rimuovere il mouse, posto sul campo sterile con la piastra elettrica posizionata sotto e applicare il cono. Trasferimento flusso al cono, e ridurre il isoflurano al 2,5%, attendere altri 20 secondi, e di prova per un adeguato piano chirurgico in conformità con la politica istituzionale. Tipicamente, la mancanza di un riflesso dell&#39;arto posteriore quando spremuto leggermente è adeguato per determinare l&#39;anestesia adeguata. </li><li> Durante tutto il processo, hanno un monitor assistente forte respirazione regolare e la colorazione rosa delle estremità e della regione della bocca per assicurare un adeguato livello di ossigenazione durante dell&#39;inconscio. Regolare l&#39;anestesia in conformità con la guida veterinaria e politica istituzionale, se necessario. Applicare sterile lacrime artificiali lubrificante unguento (15% (v / v) olio minerale, 83% (v / v) whpetrolato ite) per gli occhi. </li></ol></li><li> Ruotare il mouse su un lato con l&#39;arto posteriore rivolto verso l&#39;alto su un nuovo telo monouso. Se necessario, rimuovere pelliccia con un rasoio elettrico o crema depilatoria. Pulire il sito con soluzione salina sterile e rimuovere il telo supplementare con un eccesso di pelliccia. Inserire un nuovo telo fenestrato il mouse in modo da coprire tutte le parti, ma l&#39;intero arto posteriore (Figura 4A), ma mantenere vista della faccia e zampa per monitorare la colorazione e la respirazione. </li><li> Individuare le estremità prossimali e distali del femore e incidere la pelle per 5-10 mm lungo l&#39;asse longitudinale (Figura 4B). Separare lo strato di pelle dalla fascia con un # 15 bisturi, esponendo un approccio laterale al femore via bicipite femorale e vasto laterale. Individuare dove i setti di soddisfare entrambi i muscoli (che è una linea di tessuto bianco contro la colorazione rosa del muscolo). Con un bisturi, sezionare con cura lungo il confine intermuscolare finoil femore è visibile (Figura 4B). </li><li> Sviluppare l&#39;incisione con un scollaperiostio smussato in modo da esporre l&#39;intera diafisi (Figura 4C). Utilizzare l&#39;ascensore per esporre ulteriormente le centrali due terzi del femore avendo cura di preservare il fascio posteriore neurovascolare sul lato mediale (Figura 4D). Raschiare delicatamente tessuti molli fuori dell&#39;osso con un bisturi, e asciugare con un sterile Q-tip o equivalente. </li><li> Individuare il centro del femore con pinze se necessario e segnare con un bisturi sterile o pennarello, quindi segnare 1,5 millimetri prossimale e distale dal centro. Afferrare il femore con un paio di belle dal naso pinze precedentemente modellate nello stile Kern per evitare un&#39;eccessiva pressione sull&#39;osso. NOTA: Le dimensioni esatte per le modifiche sono forniti in Figura 3B. Si consiglia di testare la pinza su un campione eutanasia prima dell&#39;uso per garantire l&#39;osso non si rompe sotto pressione richieded per l&#39;immobilizzazione durante il taglio. </li><li> Utilizzando una multa trapano munito di rotella di taglio raffinato diamante a grana patinata (8 mm di diametro x 0,1 mm di larghezza), fare il primo taglio con l&#39;ascensore in atto per proteggere il tessuto al di sotto (figura 4E). Aumentare il femore taglio a 45 ° mentre tiene saldamente all&#39;estremità della diafisi, fare il secondo taglio, la rimozione di un segmento 3 mm. NOTA: Protezione viso è raccomandato in questa fase. </li><li> Con l&#39;osso immobilizzato da una pinza, risma attentamente le cavità midollare di ogni estremità con un ottuso 23 G ago ipodermico. Utilizzando un pre-made profondità calibro fatta da una lunghezza di 22 G tubo posto in 19 tubi G (Figura 3A, i TEM 8), valutare la profondità della cavità midollare alesato e assicurarsi che sia 3 mm (Figura 4F-K) . Se cavità midollare resiste profondimetro 22 G, risma di nuovo con un ottuso 22 G ago ipodermico. </li><li> Inserire con cautela il perno midollare nella prossimale distale poi midollare cavities portare femore indietro alla sua lunghezza originale e stabilire una stalla 3 mm di aria (Figura 5A, B). Se necessario, applicare una piccola quantità di stress manuale per ottenere un buon accoppiamento con interferenza dello stelo con l&#39;osso corticale del femore. Assicurarsi che il perno si inserisce perfettamente nella cavità midollare di entrambe le parti ed i bordi di taglio dell&#39;osso sono a filo con il collare. Se vi è una lacuna, alesare ancora una volta con un ago smussato 22 G. </li><li> Riposizionare il muscolo e tessuto periferico sul perno e chiudere con un continuo assorbibile 5-0 sutura (Figura 5C). Chiudi incisione cutanea con 5-7 piazza nodo nylon 5-0 punti di sutura e la tenuta con adesivo chirurgico (Figura 5D). </li></ol> 3. Procedure postoperatorie <ol><li> Dopo aver chiuso l&#39;incisione cutanea, ritirare l&#39;anestesia, ma permettono O 2 di rimanere scorre fino il mouse comincia a muoversi; questo dovrebbe richiedere meno di 1 min. Se il mouse resta immobile dopo 5 min diO 2 amministrazione, fare riferimento a politiche istituzionali in materia di intervento veterinario. </li><li> Quando il mouse comincia a muoversi, delicatamente trasferirlo ad una gabbia contenente preferibilmente secco, biancheria autoclavato. <ol><li> Inserire un igloo di tipo nido in ogni gabbia e il mouse si ritirerà in esso, riducendo il movimento. Verificare che il mouse recupera la mobilità arti posteriori 5-10 minuti dopo il recupero della coscienza. </li><li> Eseguire il monitoraggio postoperatorio quotidiana in conformità con le politiche istituzionali. Fornire idratazione gelatinizzato e cibo sul pavimento della gabbia per i primi 5-7 giorni e somministrare analgesia e il monitoraggio postoperatorio in conformità con le politiche istituzionalmente approvate. NOTA: Noi amministriamo 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 con 0,25 ml di soluzione salina per via sottocutanea, due volte al giorno per i primi 3 giorni e, successivamente, se il mouse non recuperare utility normale. </li></ol></li><li> Dopo le prime 24 ore di recupero, esibirsi dal vivo su animali di imaging a raggi X under anestesia di visualizzare il posizionamento del perno (Figura 4E). Se il perno è dislocata, prendere in considerazione un intervento chirurgico immediato di revisione. </li><li> Al giorno 7 dopo l&#39;intervento chirurgico, rimuovere punti di sutura sotto anestesia e la casa in gruppi in accordo con le politiche di allevamento istituzionale. </li><li> Dopo 2-5 settimane, umanamente euthanize animali secondo l&#39;American Veterinary Medical Association ha approvato metodi di eutanasia 25. NOTA: un&#39;iniezione intraperitoneale di commercialmente disponibile barbiturico-combinazione eutanasia cocktail è efficace e umana, ma le politiche istituzionali locali eutanasia dovrebbero essere seguite. </li><li> Sezionare con attenzione via la arti posteriori esponendo femore prossimale e il bacino dal lato mediale. Premere delicatamente il giunto verso l&#39;interno dal lato laterale dell&#39;arto, mentre staccando la testa del femore dalla dell&#39;acetabolo (la presa anca) con un bisturi. Tagliare restante muscolo e pelle con un bisturi affilato o micro-forbici, rilasciandotutto l&#39;arto formano il bacino. Con un forte paio di rongeurs o forbici pesanti, tagliare la cerva-dell&#39;arto inferiore (tibia / perone) di circa 5 mm al di sotto del ginocchio. NOTA: Si consiglia di tutti i campioni sono memorizzati in modo identico prima dell&#39;analisi. </li><li> Togliere la pelle, ma lasciare il muscolo in luogo. Fissare il tessuto in 10% formalina tamponata supplementato con 10 mM CaCl 2 fissativo per 1 settimana seguito da stoccaggio in tampone fosfato supplementato con 10 mM CaCl 2 per un massimo di 1 mese prima di imaging. Eseguire fissazione e conservazione a 4 ° C. In alternativa, eseguire la scansione di campioni immediatamente senza fissazione. </li></ol> 4. Analisi dei campioni NOTA: Osso guarigione può essere valutata da una grande varietà di metodologie che sono oltre la portata di questo protocollo. Quanto segue è un metodo che abbiamo utilizzato con successo con un esemplare microCT (μCT) imager. Si raccomanda che i seguenti parametri are testato inizialmente, quindi ottimizzata per le esigenze specifiche del progetto. <ol><li> Avvolgere provetta in un sottile strato di film plastico e posizionarlo verticalmente nella camera strumento. Assicurarsi che il femore è perpendicolare alla fase campione per l&#39;intera scansione. Impostare la scansione per i seguenti parametri; Tensione = 29 kV, corrente = 661 μA, potenza = 19 W, dimensione dell&#39;immagine pixel (micron) = 21.00; Rotazione di 360 gradi = yes; Telaio media = a (5); fase di rotazione (gradi) = 1.00, movimento casuale = on. Salva le immagini come file JPEG in una singola cartella di destinazione per scansione (ad esempio figura 6A). NOTA: La scansione deve essere completa in 57 min. </li><li> Utilizzare il software di ricostruzione per generare immagini assiali sulla base dei seguenti parametri; smoothing = a (4), la compensazione disallineamento = on, riduzione anello artefatti = a (5), fascio indurimento correzione (40%), la rotazione CS (gradi) = 0.00. Impostare uscita 2,000-15,000 unità Hounsfield. Salva le immagini come file JPEGin una sola cartella di destinazione per scansione. </li><li> Usando le immagini assiali e software analitico, definire la regione di interesse (ROI) impostando prima prossimale e distale bordi del difetto originale. Raggiungere questo selezionando le sezioni che comprendono solo il collare. Poiché il collare è più spesso del perno midollare, queste sezioni sono facilmente definiti (Figura 6B, sinistra). Escludere il collare dai calcoli disegnando una zona di esclusione intorno (con un margine di 100 micron) e trasferire la zona a ciascuna delle sezioni del ROI (Figura 6B, destra). NOTA: i momenti di inerzia polare, ricostruzioni 3D e calcoli, come il volume di nuovo osso (Figura 6C, D) possono essere facilmente raggiunti tramite il software. </li></ol>

<ol>
	<li>Brinker, M. R., O'Connor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+fractures+and+dislocations+referred+for+orthopaedic+services+in+a+capitated+population.">The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population.</a> J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).</li><li>Cheung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+bone+healing.">The future of bone healing.</a> Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).</li><li>Rosemont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , (2008).</li><li>Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+long-bone+non-unions.">Prevalence of long-bone non-unions.</a> Injury. 38, S3-S9 (2007).</li><li>Marsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+fracture+union,+delayed+union,+and+nonunion.">Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion.</a> Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).</li><li>Spicer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+bone+regeneration+using+the+rat+critical+size+calvarial+defect.">Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect.</a> Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).</li><li>Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors,+treatment,+and+outcomes+associated+with+nonunion+of+the+midshaft+humerus+fracture.">Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture.</a> J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).</li><li>Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+economics+of+the+treatment+of+long-bone+non-unions.">The health economics of the treatment of long-bone non-unions.</a> Injury. 38, S77-S84 (2007).</li><li>Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complications+following+autologous+bone+graft+harvesting+from+the+iliac+crest+and+using+the+RIA:+a+systematic+review.">Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review.</a> Injury. 42, S3-S15 (2011).</li><li>Boer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+bone+grafts.">The history of bone grafts.</a> Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).</li><li>Aro, H. T., Aho, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+bone+allografts.">Clinical use of bone allografts.</a> Ann Med. 25, 403-412 (1993).</li><li>Burstein, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+substitutes.">Bone substitutes.</a> Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).</li><li>Kao, S. T., Scott, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+bone+substitutes.">A review of bone substitutes.</a> Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).</li><li>Boden, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+biology+of+lumbar+spine+fusion+and+principles+for+selecting+a+bone+graft+substitute.">Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute.</a> Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).</li><li>Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+size+defect+as+an+experimental+model+to+test+bone+repair+materials).">The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials).</a> J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).</li><li>Key, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+local+calcium+depot+on+osteogenesis+and+healing+of+fractures.">The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures.</a> J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration).">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration).</a> J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+bone+healing+models:+standards,+tips,+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting.">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49, 591-599 (2011).</li><li>Cheung, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+externally+fixed+femoral+fracture+model+for+mice.">An externally fixed femoral fracture model for mice.</a> J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).</li><li>Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+experimental+fracture+in+the+mouse+tibia.">A standardized experimental fracture in the mouse tibia.</a> J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).</li><li>Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+closed+femur+fracture+model+in+mice.">Characterization of a closed femur fracture model in mice.</a> J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+non-union+model+in+mice.">Development of a reliable non-union model in mice.</a> J Surg Res. 147, 84-91 (2008).</li><li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relief+of+pain+in+laboratory+animals.">The relief of pain in laboratory animals.</a> Lab Anim. 18, 147-160 (1984).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines on the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice.">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li><li>Bagi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+micro-CT+to+evaluate+cortical+bone+geometry+and+strength+in+nude+rats:+correlation+with+mechanical+testing,+pQCT+and+DXA.">The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA.</a> Bone. 38, 136-144 (2006).</li><li>Hadjiargyrou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+bone+regeneration.+Insight+into+the+molecular+complexity+of+wound+repair.">Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair.</a> J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).</li><li>Clough, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+regeneration+with+osteogenically+enhanced+mesenchymal+stem+cells+and+their+extracellular+matrix+proteins.">Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins.</a> J Bone Miner Res. , (2014).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+for+age-related+changes+in+fracture+repair.">Cellular basis for age-related changes in fracture repair.</a> J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).</li><li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+patterns+of+skeletal+progenitor+cell+differentiation+and+progression+during+endochondral+bone+formation+affects+the+rate+of+fracture+healing.">Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing.</a> J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).</li><li>Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nonobese+diabetic+mice+to+understand+human+type+1+diabetes.">Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).</li><li>Jee, W. S., Yao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+animal+models+of+osteopenia+and+osteoporosis.">Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Qui, si descrive un metodo semplice per generare un difetto critico-sized pin-stabilizzato del femore murino utilizzando standard di laboratorio e veterinari. Mentre l&#39;assemblea dei perni e la procedura chirurgica in sé richiede pratica, è bene alla portata di un ricercatore biomedico ben addestrato o veterinario. Il perno è posizionato nel canale midollare senza fissazione aggiuntiva, rendendo il procedimento tecnicamente più fattibile rispetto agli approcci più complicati che impi...

Si stima che la metà della popolazione degli Stati Uniti sperimentare una frattura all&#39;età di 65 1. Per i pazienti con fratture trattate chirurgicamente, 500.000 procedure comportano l&#39;uso di un innesto osseo 2 e questo numero è destinato ad aumentare con una popolazione sempre più anziana 3 . Sebbene osso è uno dei pochi organi che ha la capacità di guarire completamente senza cicatrici, ci sono casi in cui il processo non riesce 3,4. A seconda delle circostanze e la qualità del trattamento, 2-30% delle fratture delle ossa lunghe fallire, con conseguente non-union 3,5. Mentre rimane qualche dibattito sulla definizione, pseudoartrosi, lesioni ossee critici-size o non sindacalizzati in genere si riferisce a un infortunio che non guarisce tutta la durata naturale del soggetto 6. Ai fini sperimentali, tale durata è ridotta al tempo medio necessario per la completa guarigione di una ferita di medie dimensioni delle ossa. Lesioni ossee non sindacali si verificano per nummotivi erous, ma i principali fattori includono traumi estremi conseguente gap critico dimensioni, infezione, povero angiogenesi, uso di tabacco, o la capacità osteoregenerative inibito a causa di malattie o 7 anni. Anche se non unioni sono trattati con successo, può costare oltre $ 60.000 al procedimento, a seconda del tipo di lesione e gli approcci impiegati 8. In casi moderati, innesto osseo autologo è impiegato. Questa strategia comporta il recupero di osso da un sito donatore e l&#39;impianto nel sito di lesione. Mentre questo approccio è estremamente efficace, il volume di osso disponibile donatore-derivato è limitata e la procedura prevede un ulteriore intervento chirurgico, che si traduce in dolore persistente in molti pazienti 9,10. Inoltre, l&#39;efficacia dell&#39;innesto osseo autologo dipende della salute del paziente. Sostituti ossei in materiali sintetici o di osso da cadavere elaborati sono disponibili in abbondanza 11-13, ma HAve significative limitazioni, tra cui scarse proprietà di adesione della cellula ospite, ridotto osteoconduttività, e la possibilità di rigetto immunitario 14. Vi è quindi un urgente bisogno di tecnologie di rigenerazione ossea che sono sicuri, efficaci e ampiamente disponibile. La nostra capacità di migliorare le strategie di rigenerazione dell&#39;osso è criticamente dipendente dalla capacità di imitare gravi traumi ossei in animali da laboratorio, ma la generazione e la stabilizzazione di grandi lesioni ossee è tecnicamente impegnativo. Nella maggior parte dei casi, gravi traumi delle ossa lunghe è imitato sperimentalmente stabilendo un difetto che non guarire naturalmente. Anche se può variare con specie 15, questo si ottiene la rimozione completa di un segmento osseo che è maggiore di 1,5 volte il diametro dell&#39;osso sezione 16. L&#39;osso viene poi stabilizzato con un impianto metallico per mantenere il corretto orientamento dei bordi di frattura e consentire la mobilità. A causa della loro piccola dimensione e la fragilitàle ossa lunghe, la creazione di tali lesioni nei topi sono oltre le capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. Come tale, i modelli difettosi delle ossa lunghe sono limitati a ratti e animali più grandi. Tuttavia, i topi offrono notevoli vantaggi di ricerca in quanto possono essere geneticamente modificati e allevati come ceppi immunocompromessi che non rifiutano le cellule e tessuti umani. Per le applicazioni basate sulle cellule umane, i topi immunocompromessi sono attraenti per lavorare con perché sono fisiologicamente ben caratterizzati, facile da casa, redditizio, e facilmente analizzati radiologicamente e istologicamente. Di fondamentale importanza è che i topi immunocompromessi non rifiutano le cellule di specie diverse, tra cui l&#39;uomo. Le loro piccole dimensioni permette anche la sperimentazione di un numero esiguo di cellule o volumi di ponteggi sperimentali in applicazioni ortopediche. Diversi modelli murini ortopedici sono stati segnalati che offrono vari gradi di stabilità ossea 17,18. Quelli systems che si traducono in livelli molto elevati di stabilità, come fissatori esterni e piastre di bloccaggio prevalentemente guarire da ossificazione intramembranosa anche se la guarigione endochondral è stato segnalato 19. Al contrario, quelli che permettono alcune micro e / o macro-motion, come quelle che impiegano i perni midollari non fissati o parzialmente fissi, in genere guariscono con una predominanza di encondrale 20,21. Unione ritardata o difetti non sindacali di ossa lunghe sono particolarmente difficili da realizzare nei topi a causa del livello extra di stabilizzazione necessaria. Tuttavia, una serie di approcci sono stati segnalati, tra cui i perni midollari con chiodi ad incastro, piastre di bloccaggio e fissatori esterni 22. Questi sistemi generalmente funzionano bene, ma data la loro progettazione complicata possono essere tecnicamente difficile da installare. Ad esempio, Garcia et al. 23 escogitato un elegante sistema pin incastro per l&#39;uso nei topi, ma la procedura prevede due incisioni a sito separatos ed una sostanziale modifica del femore per accogliere i perni. Queste procedure sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione. Qui, descriviamo un semplice perno midollare femorale con un collare centrale progettata per impedire la chiusura di un deficit ossea 3 mm e anche delineare i bordi originali del difetto. Mentre il perno non è stato fissato all&#39;osso stesso, accurato dimensionamento del diametro del perno e alesatura dei risultati cavità midollare in interferenza sufficiente a minimizzare il movimento torsionale (Figura 1). Con un&#39;attenta selezione di età inbred, genere e topi ceppo corrispondenza, il risultato è un altamente riproducibile ipertrofica non uniondefect 22 che può essere facilmente valutata radiologicamente. Inoltre le regioni di interesse possono essere definite in modo riproducibile dopo micro-tomografia computerizzata (μCT) per la misura di de novo formazione ossea e parametri istomorfologici. I perni sono stati prototipati nel nostro laboratorio utilizzando strumenti facilmente reperibili.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> Figura 1: principio sperimentale sintesi schematica del modello di difetto segmentale.. Il segmento centrale 3 mm un femore murino 9-10 mm viene asportato chirurgicamente (a sinistra). A, 19 calibro tubo di acciaio chirurgico, lunga 3 mm, è passata sopra a 9 mm di lunghezza, 22 G tubo di acciaio inox e fissato con adesivo al centro esatto (a destra). Il perno risultante è montato nei canali midollari dei restanti porzioni prossimali e distali del femore con il collare 19 G sostituzione del segmento 3 mm dell&#39;osso (di seguito, al centro).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Name of Equipment/Material*</td>
			<td style="width:207px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog or model</td>
			<td style="width:179px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pin Assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dremel rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heavy duty cut off wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 19G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8LY</td>
			<td>OD 1.07mm, ID 0.889mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 21G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8YQ</td>
			<td>OD 0.82mm, ID 0.635mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 22G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMYLZS</td>
			<td>OD 0.719mm, ID 0.502mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 23G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FN0SY0</td>
			<td>OD 0.643mm, ID 0.444mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emery disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rubber polishing point</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Felt polishing disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin sponge</td>
			<td>Surgifoam/Ethicon</td>
			<td>1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punch biopsy cutter</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgery/post-operative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm pad and circulator pump</td>
			<td>Stryker/Thermocare</td>
			<td>TP700, TP700C, TPP722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverage quaternary spray</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1429-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bead sterilizer</td>
			<td>Germinator/CellPoint Scentific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip Inc</td>
			<td>901806 or 901807/901809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isofluorane anesthetic</td>
			<td>VETone/MWI</td>
			<td>501017, 502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical disinfectant</td>
			<td>Chloraprep/CareFusion</td>
			<td>260449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>various</td>
			<td>recommend German made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Face protection</td>
			<td>Splash Shield</td>
			<td>4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rechargable high speed drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diamond cutting wheel</td>
			<td>Strauss Diaiond</td>
			<td>361.514.080HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbable sutures&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>UM-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Outer sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>668G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydration gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diet gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt and Benckser</td>
			<td>12496-0757-01</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse igloos</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>K3328, 3570,3327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Euthanasia cocktail</td>
			<td>Euthasol/Virbac</td>
			<td>710101</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live animal imager&#160;</td>
			<td>Orthoscan</td>
			<td>FD Pulse</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT unit and software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan1174</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sealing film/Parafilm M</td>
			<td>VWR or Fisher</td>
			<td>100501-338, S37441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple critical-sized femoral defect model in mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Mice tipicamente recuperare coscienza e arti posteriori mobilità 5-10 minuti dopo la sospensione di anestesia. Durante i primi 5 giorni, è consigliabile ospitare topi singolarmente e introdurre arricchimento ambientale per impedire l&#39;utilizzo eccesso dell&#39;arto. A questo scopo, igloo di tipo nidi riducono la necessità di costruzione del nido e incoraggiare riposo. Abbiamo anche osservato che la fornitura di cibo e idrogel sul pavimento della gabbia riduce la probabilità di dislocamento pin. Durante il periodo...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice at JoVE.com

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

a-simple-critical-sized-femoral-defect-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Views.  Texas A&M Health Science Center. Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice. 

Video: A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Ricerca

Medicina

Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

Creare fratture rigidamente stabilizzati per la Valutazione ossificazione intramembranosa, osteogenesi per distrazione, o guarigione di difetti critici Sized

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. Adipose-derived stromal cells (ASCs) have proven to be an abundant source of multipotent stem cells capable of undergoing osteogenic, chondrogenic, adipogenic, and myogenic differentiation. Many studies have explored the osteogenic potential of these cells in vivo with the use of various scaffolding biomaterials for cellular delivery. It has been demonstrated that by utilizing an osteoconductive, hydroxyapatite-coated poly(lactic-co-glycolic acid) (HA-PLGA) scaffold seeded with ASCs, a critical-sized calvarial defect, a defect that is defined by its inability to undergo spontaneous healing over the lifetime of the animal, can be effectively show robust osseous regeneration. This in vivo model demonstrates the basis of translational approaches aimed to regenerate the bone tissue - the cellular component and biological matrix. This method serves as a model for the ultimate clinical application of a progenitor cell towards the repair of a specific tissue defect.

This protocol describes the isolation of adipose-derived stromal cells from lipoaspirate and the creation of a 4 mm critical-sized calvarial defect to evaluate skeletal regeneration.

Riparazione di un critico di dimensioni modello Difetto cranica Usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modello murino di dall&#39;arteria femorale Wire Injury con impianto di una Perivascolare Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to atherosclerotic plaque development or the rupturing of established plaques, interrupts normal blood flow leading to various morbidities such as myocardial infarction and stroke. In the clinic endovascular procedures such as angioplasty are commonly performed to reopen the lumen. However, these treatments inevitably damage the vessel wall as well as the vascular endothelium, triggering an excessive healing response and the development of a neointimal plaque that extends into the lumen causing vessel restenosis (re-narrowing). Restenosis remains a major cause of failure of endovascular treatments for atherosclerosis. Thus, preclinical animal models of restenosis are vitally important for investigating the pathophysiological mechanisms as well as translational approaches to vascular interventions. Among several murine experimental models, femoral artery wire injury is widely accepted as the most suitable for studies of post-angioplasty restenosis because it closely resembles the angioplasty procedure that injures both endothelium and vessel wall. However, many researchers have difficulty utilizing this model due to its high degree of technical difficulty. This is primarily because a metal wire needs to be inserted into the femoral artery, which is approximately three times thinner than the wire, to generate sufficient injury to induce prominent neointima. Here, we describe the essential surgical details to effectively overcome the major technical difficulties of this model. By following the presented procedures, performing the mouse femoral artery wire injury becomes easier. Once familiarized, the whole procedure can be completed within 20 min.

The mouse femoral artery wire injury model of restenosis is technically challenging. In this protocol we show the key technical details essential for successfully performing wire injury to induce consistent&#160;neointima for studies of restenosis.

Un modello murino di restenosi arteriosa: aspetti tecnici del femore Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

Un ripetitivo Concussive trauma cranico Modello nei topi

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...