Gli autori desiderano ringraziare Verlene Henry e Lindsay Holmes per l&#39;assistenza nello sviluppo di questo modello. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Fondazione S. James McDonnell (# 220020173).

1. Linee cellulari <ol><li> U87MG cellule di glioma sono coltivate in contenitori di grandi dimensioni coltura tissutale con DMEM-F12 integrato con 5% di siero fetale bovino (FBS). </li><li> Le cellule vengono raccolte mediante lavaggio fiaschi due volte con fosfato caldo Soluzione salina tamponata (PBS) e l&#39;incubazione a 37 ° C per 5 minuti con 10 ml di PBS contenente 0,25% tripsina e 0.05% EDTA. Una volta che le cellule sono alzata, sono posti in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di terreni di coltura e centrifugati (300 X g per 4 min). </li><li> Dopo il lavaggio, le cellule sono risospese ad una concentrazione di 10 x 10 6 / ml in terreni di coltura, che ha consentito una inoculazione di 50.000 cellule / 5 microlitri. </li><li> Le cellule sono tenuti in ghiaccio fino ad iniezione intracranica. </li></ol> 2. Guidavite intracranica bullonatura Questa procedura può essere effettuata alcuni giorni prima l&#39;iniezione di cellule. Tutte le procedure qui descritte sono state effettuate sotto stretto condizioni sterili. <ol><li> Topi (BALB / c nu / nu femminile; 5-6 settimane, circa 18g) sono numerati a scopo di identificazione, pesati e anestetizzati con un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). </li><li> La pelle è pulito con una soluzione di iodio e di una piccola incisione (2-3 mm) è realizzato lungo il lato destro della linea mediana e anteriore alla linea interaurale. Ciò espone le suture coronale e sagittale del cranio. Il bregma è posizionato alla confluenza di questi due punti di sutura. </li><li> La vite di punto di ingresso guida viene poi segnato in un punto 2.5 mm lateralmente e 1 mm anteriormente al bregma. Questo punto si trova direttamente sopra il nucleo caudato 1. </li><li> A x 1 1 foro mm di profondità si è esercitato con una mano sterile tenuta punta elicoidale attraverso il cranio alla dura. </li><li> Una vite guida sterilizzato che si estenderà 1,6 millimetri sotto la superficie teschi in la dura viene quindi montata nel foro con un cacciavite fino a filo con il cranio (Figura 1A). </li><li> Un mandrino sterili o manichino vite viene poi inserito nel foro centrale della vite guida per chiudere l&#39;apertura (Figura 1B). </li><li> La ferita è chiusa con adesivo tissutale Vetbond (n-butil-cianoacrilato) e il mouse sono un&#39;iniezione intraperitoneale di reversine (piccoli animali) (0,1 ml / kg) e il carprofen (5 mg/kg/100 microlitri) per l&#39;analgesia. I topi sono poi permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento (36 ° C) che possono accogliere fino a 20 minuti. I topi sono spesso monitorati e osservati durante questo periodo di recupero fino a quando non sono pienamente consapevoli. </li></ol> 3. Intracranica attecchimento cellulare <ol><li> Una siringa sterile ammanettato Hamilton è preparato mediante l&#39;applicazione di un piccolo anello di plastica per la punta dell&#39;ago consentendo solo 2 mm di estendere l&#39;ago sotto la guida all&#39;uscita della vite (Figura 1B). Il punto di inoculazione finale è quindi 3,5 millimetri sotto la superficie del cranio. </li><li> Quattro giorni dopo l&#39;intervento vite di guida, i topi sono di nuovo anestetizzati come sopra (2,1) e una piccola incisione è fatta sulla vite guida per rimuovere il mandrino. </li><li> La siringa Hamilton ammanettato viene poi riempito con 5 ml di cellule in comune, tenendo bene le precauzioni per non creare o elaborare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> La siringa è fissata alla pompa di perfusione e l&#39;ago viene inserito la vite di guida (Figura 1C). Le cellule sono poi infuse ad una velocità di 30 microlitri per ora. </li><li> L&#39;apparecchio automatico (Figura 1D) ci ha permesso di iniettare fino a 10 animali in un momento ad un flusso costante. Le cellule possono anche essere iniettato manualmente utilizzando la siringa ammanettato hamilton o in alternativa la siringa può essere ammanettato da una punta di 200 microlitri pipetta che è stato tagliato di 3 mm per consentire la punta dell&#39;ago di estendere oltre la vite di guida da 2 mm. L&#39;iniezione deve essere eseguita con un ritmo costante costante. </li><li> Quando l&#39;infusione è completa, la siringa è accuratamente rimosso e il mandrino è sostituito nella vite di guida. La ferita è incollato chiuso ei topi sono dati farmaci recupero come prima (2,7) e ha permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento. </li></ol> 4. Sfida terapeutica <ol><li> Quattro giorni dopo l&#39;inoculazione di cellule U87MG, i topi sono pesati e divisi casualmente in gruppi di controllo e trattamento. </li><li> Il gruppo di controllo è dato un intraperitoneale (IP) l&#39;inserimento di PBS (100 l), mentre il gruppo di trattamento è dato una iniezione di AMG102 IP (100 mg in 100 ml di PBS). </li><li> Le iniezioni vengono ripetute ogni due giorni per 14 giorni, per un totale di 6 iniezioni (Figura 2). </li><li> Dopo l&#39;ultima iniezione, i topi sono monitorati quotidianamente e pesati tutti i giorni secondo. </li><li> Quando i topi cominciò a mostrare notevoli disfunzioni neurologiche (disturbi dell&#39;equilibrio, paralisi), disidratazione, o perdita di peso superiore al 10% o moribondi, erano umanamente eutanasia. Questi umano end-point giorni sono stati poi registrati sulla curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza. </li></ol> 5. Valutazione di efficacia terapeutica </p&gt; <ol><li> La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza è stata generata utilizzando GraphPad Prism 4.03 per Windows; Software GraphPad, San Diego California USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Euthanizations morti o sono stati contrassegnati come end-point eventi e segnato come 1. Gli animali che sono rimasti vivi alla fine di questo esperimento sono stati registrati come non-eventi e segnato come 0. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Animali di controllo ha iniziato a mostrare segni di disturbi neurologici e perdita di peso 23 giorni dopo l&#39;inoculo iniziale di cellule. Questo è stato significativamente ritardato nel gruppo AMG102 trattati per 35 giorni. Infatti di giorno 35, il 77% (n = 7 / 9) del gruppo di controllo era stata eutanasia. La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza dimostra chiaramente l&#39;aumento significativo della sopravvivenza in risposta al AMG102 trattamento (Figura 3). Dal giorno 70, l&#39;88% dei topi di controllo era stata eutanasia (n = 8 / 9) rispetto al 37% (n = 3 / 8) di AMG102 gruppo trattato. L&#39;analisi istologica del cervello hanno confermato che tutti i 9 gli animali del gruppo di controllo sviluppato tumori rispetto a solo 3 delle 8 AMG102 topi trattati (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> Figura 1: Immagine (A) mostra vite intracranica guida posizionato in una zona situata direttamente al di sopra del nucleo caudato. Il ammanettato hamilton siringa (pre-caricato con le cellule) viene poi inserito all&#39;interno della vite guida in modo che 2 mm di aghi si estende oltre la guida e le cellule vengono iniettate 3,5 millimetri all&#39;interno del nucleo caudato. La siringa viene poi rimosso e sostituito da uno stiletto (B). Il dispositivo di infusione automatica (C) può iniettare fino a 10 animali alla volta. Qui sono cinque iniezioni simultanee (D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> Figura 2: Schema del protocollo di studio. Le cellule sono state iniettate al giorno 0 con il trattamento a partire dal giorno 4. Animali di controllo hanno ricevuto una iniezione di PBS (100 l) IP, mentre il gruppo di trattamento hanno ricevuto una iniezione di AMG102 (100 μg/100 microlitri) IP. Queste iniezioni sono state somministrate ogni secondo giorno per 10 giorni. Un totale di 6 iniezioni sono state eseguite. Gli animali sono poi stati monitorati per 70 giorni per eventuali segni di disturbi neurologici e fisici. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> Figura 3: curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza confronto controllo e AMG102 topi trattati. Sopravvivenza significativo è stato ottenuto dopo trattamento con AMG102 (p = 0,005). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> Figura 4: microfotografie di sezioni coronali del cervello dimostrando sviluppo di tumori negli animali di controllo (A) e non lo sviluppo del cervello tumore nel AMG102 animali trattati (B). Barra di scala è di 1 mm.

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	<li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals.">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li><li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMG+102,+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+neutralizing+antibody,+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts.">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li><li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+oncogene+addiction:+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases.">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li><li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102.">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li><li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+(rilotumumab)+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li><li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model.">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li><li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+tumor+model:+functional+and+histopathological+characterization.">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li><li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels,+activation+status,+and+heterodimerization.">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li><li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors.">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li><li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma.">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li></ol>

Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca da Amgen Inc.

Il metodo intracranica vite guida qui presentata consente la creazione rapida e riproducibile di xenotrapianti intracranica e nelle mani di un tecnico animale addestrato, questa procedura è eseguita molto facilmente senza la necessità di un dispositivo stereotassico. Il nostro metodo combina l&#39;uso di una vite di guida, per individuare con precisione la regione del cervello più adatto per lo sviluppo del tumore in vivo, e una pompa per infusione automatizzata che permette l&#39;inoculazione simultanea di un massimo di 10 animali alla volta. La vite procedura guida aumento richiede meno di 5 minuti per eseguire. L&#39;infusione di cellule automatizzati a 30 microlitri / h richiede solo 10 minuti per un volume 5 microlitri. Questo assicura un dosaggio preciso ad un tasso costante e riduce il rischio di espulsione delle cellule nella zona extra-craniche a causa di aumento della pressione intracranica. Abbiamo anche eseguito questa procedura con 10 microlitri volumi e non hanno osservato alcun extra-craniche la crescita del tumore a causa di reflusso cellulare. Come la pompa di infusione automatica permette anche più animali per essere inoculati contemporaneamente siamo in grado di iniettare fino a 60 animali per ora rispetto ad una procedura stereotassica che è limitata a circa 15 animali ogni ora. La fase più critica in questa procedura è la posizione della vite di guida nel cranio come la sua posizione determina la posizione finale della massa tumorale. Se la vite di guida è troppo centrale, le cellule verranno iniettate in una regione tra i due emisferi cerebrali, mentre se la guida è posto a in avanti, le cellule non sarà iniettato nel cervello a tutti. E &#39;quindi essenziale per essere il più precisi possibile nel trovare da 2,5 mm lateralmente guida e 1 mm anteriore al bregma 1. In questo studio abbiamo utilizzato una vite guida in acciaio, anche se le viti guida in plastica sono disponibili anche per quegli studi che necessitano di imaging cerebrale come la risonanza magnetica o PET 6. Anche se la pompa di infusione automatica è il costo proibitivo per alcuni gruppi, le cellule possono ancora essere iniettato manualmente in modo più rapido rispetto agli approcci stereotassica. In generale, questo metodo rapido, preciso e riproducibile può essere utilizzato per studiare glioma, il medulloblastoma e tumori del tronco cerebrale 7. Questa procedura è stata effettuata su oltre 500 topi tra i nostri due laboratori con i decessi dovuti a reazioni inaspettate anestetico (&lt;1%). I topi che sono stati avvitata con la vite di guida e, successivamente, infuso con le cellule non sono morti o subito alcun complicazioni neurologiche come risultato della procedura. Gli animali sono sopravvissuti ultimi 100 giorni senza complicazioni. Anche se abbiamo preferito utilizzare un mouse senza peli, un immuno-compromessi topo con i capelli come le SCID sarebbe altrettanto appropriato fornito i capelli cranio è stato rimosso prima della chirurgia per mantenere il sito pulito e per evitare che i capelli interferire con vite di guida. Ci sono nuove terapie diverse in fase di sviluppo per il trattamento dei gliomi 8-10. Recentemente abbiamo dimostrato che per via sottocutanea U87MG xenotrapianti glioma può essere inibita dal trattamento con AMG102 3; un anticorpo umanizzato diretto a HGF attualmente sottoposto a valutazione clinica negli glioma 5. Abbiamo usato il metodo descritto qui di stabilire i tumori intracranici U87MG nel cervello dei topi nudi. Il nostro studio mostra chiaramente l&#39;utilità del metodo e dimostra che AMG102 inibisce significativamente la crescita di xenotrapianti U87MG ortotopico. Noi continueremo ad utilizzare questo modello per determinare quali altre terapie possono essere utilizzati in combinazione con AMG102 per ottenere inhibition più efficace della crescita tumorale.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFB </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c nu / nu topi </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vite di Holder </td><td> Un materie plastiche </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Drill Holder </td><td> Un materie plastiche </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Punta </td><td> Un materie plastiche </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Vite di guida (metallo) </td><td> Un materie plastiche </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Vite di Dummy (stilo) </td><td> Un materie plastiche </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Siringa (10 microlitri ago 26g cementati) </td><td> Grazia Divisione Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 pompa di infusione </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> Opzionale </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

L&#39;innesto di cellule tumorali nel cervello di topi immunodepressi è un metodo consolidato per lo studio dei tumori cerebrali tra cui glioblastoma (gliomi) e il medulloblastoma. L&#39;approccio stereotassico ampiamente utilizzato consente solo per l&#39;iniezione di un singolo animale in un momento, è laborioso e richiede attrezzature altamente specializzate. Il metodo di vite guida, sviluppato inizialmente da Lal et al., 1 è stato sviluppato per eliminare le procedure stereotassiche ingombrante. Ora descrivere un approccio modificato vite guida che è rapido e straordinariamente sicura, entrambi i quali sono fondamentali considerazioni di carattere etico. In particolare, la nostra procedura ora incorpora una pompa per infusione che consente fino a 10 animali per essere iniettati contemporaneamente con le cellule tumorali. Per dimostrare l&#39;utilità di questa procedura, abbiamo stabilito cellule umane di glioma U87MG come xenotrapianti intracranica nei topi, che sono stati poi trattati con AMG102, un anticorpo completamente umano diretto a HGF / fattore di dispersione attualmente sottoposto a valutazione clinica 2-5. Iniezione sistemica di AMG102 prolungato in modo significativo la sopravvivenza di tutti i mouse con xenotrapianti U87MG intracranica e ha portato un certo numero di guarigioni complete. Questo studio dimostra che il metodo vite di guida è un poco costoso, approccio altamente riproducibili per stabilire xenotrapianti intracranica. Inoltre, fornisce un modello fisiologici di rilievo per la convalida nuove strategie terapeutiche per il trattamento dei tumori cerebrali.

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Al fine di valutare nuovi paradigmi terapeutici per il trattamento del glioma, fisiologica modelli pertinenti sono essenziali. Utilizziamo uno impiantabile procedura vite di guida per la creazione di modelli di xenotrapianto intracranica che è più rapido e più sicuro rispetto agli approcci stereotassica.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K Views.  Monash Institute of Medical Research. Al fine di valutare nuovi paradigmi terapeutici per il trattamento del glioma, fisiologica modelli pertinenti sono essenziali. Utilizziamo uno impiantabile procedura vite di guida per la creazione di modelli di xenotrapianto intracranica che è più rapido e più sicuro rispetto agli approcci stereotassica.

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Guida cateterizzazione filo assistita e colorate iniezione Colorante per la mappatura vascolare di placente monocoriali Gemelle

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

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Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Epidurale Misurazione della pressione intracranica in ratto utilizzando una fibra ottica trasduttore di pressione

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is required. In most cases, the preferred route of administration is via oral delivery. At the present time, oral delivery is mostly accomplished using an oral gavage procedure, in part, because it can achieve consistent and precise dosing in the animal model. Although this method is well established it does have complications that can result in a high rate of animal attrition. To this end, the procedure introduced here describes an alternative to the oral gavage method in which the desired drug is incorporated into a tastant, orally dissolving strip (ODS) that can simply be presented to the test animal where it is then rapidly taken up with minimal manipulation of the test subject. Herein, we demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

The following protocol describes a novel method for chronic oral drug administration using an orally dissolving strip (ODS) in lieu of the more commonly used oral gavage method. We demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

Utilizzando una dissoluzione Striscia via orale per gli studi farmacologici e tossicologici: un&#39;alternativa semplice e Humane a Oral Gavage per gli animali

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Un metodo per la quantificazione degli arti superiori performance nella vita quotidiana che utilizzano accelerometri

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Methods Article

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi