Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come il modo in cui il flusso di fluido altera la crescita e lo sviluppo del biofilm fungino. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di valutare quantitativamente gli effetti del flusso sulla crescita e lo sviluppo del biofilm in tempo reale. Iniziate questo esperimento con l'assemblaggio dell'apparato di flusso, come descritto nel protocollo di testo.
Il giorno dell'esperimento, attaccare la trappola a bolle, la sonda di temperatura e tutti i componenti a uso singolo. Per assemblare il filtro, rimuovere lo stantuffo da una siringa da un millilitro per renderlo un adattatore. Forzare il tubo dal flacone filtrante a questa estremità e attaccare un filtro da 2 micron al tubo che porta al pallone di crescita.
Applicare grasso sottovuoto in silicone intorno alla spina dell'adattatore di scorrimento prima di collegarlo, in quanto ciò aiuta a prevenire perdite d'aria nel sistema. Riempire il pallone di fissaggio con 100 millilitri di YPD e riempire il pallone in crescita con 200 millilitri di YPD. Assicurarsi che il tubo laterale verde raggiunga il supporto in ogni pallone.
Assicurarsi che tutte le valvole siano aperte. Attaccare la trappola a bolle a un vuoto e collegare la pompa al tubo laterale verde a valle della trappola a bolle. Pompare il fluido a una portata di 3,3 millilitri al minuto per riempire completamente il lato verde.
Quindi, erogare e scartare circa uno o due millilitri del supporto, perché i primi due millilitri spesso contengono cellule morte o detriti casuali. Assicurarsi che il lato verde del tubo sia riempito di supporti e non abbia bolle a valle della trappola a bolle prima di procedere. Riempire lo scivolo del canale e il serbatoio con YPD, facendo attenzione a non introdurre bolle.
Collegare la diapositiva all'apparato di flusso. Quindi pompare più fluido per creare un tampone di circa 5 metri sul lato arancione. Questo per evitare di intrappolare accidentalmente l'aria nello scivolo in caso di riflusso.
Ora, preparare l'apparato di flusso per il trasporto al microscopio piantando prima l'ingresso e l'uscita della trappola a bolle chiusa. Quindi bloccare le valvole del pallone di fissaggio laterali verdi e arancioni chiuse. Assicurarsi che i tappi a vite per lo smorzatore di pulsazione e il flacone del filtro siano stretti, in quanto possono allentare durante la placcatura automatica.
Scollegare la pompa dal tubo per facilitare il trasporto. Quindi spostare tutti i componenti, incluso l'agitatore a piastra calda, in un contenitore secondario vicino al microscopio. Attaccare la sonda di temperatura all'agitatore a piastra calda e iniziare a riscaldare il pallone di fissaggio a 37 gradi Celsius.
Mescolare il supporto a 300 giri/min e mantenerlo per l'intero esperimento. Montare la diapositiva al microscopio e, se necessario, utilizzare il nastro adesivo per fissarla saldamente. Quindi attaccare la trappola a bolle a un vuoto.
Ora, collegare la pompa all'apparato di flusso. Avviare la pompa a una portata di 3,3 millilitri al minuto e consentirgli di funzionare per circa cinque-10 secondi. Quindi, rimuovi la trappola per bolle nel clan dei coperchi let-out.
Lasciare che la pompa continui a funzionare mentre il pallone di fissaggio si riscalda. Una volta che il pallone di fissaggio e la camera di incubazione sono entrambi a 37 gradi Celsius, aggiungere abbastanza coltura notturna delle cellule fungine al pallone di fissaggio per raggiungere un milione di cellule per millilitro. Attendere 15 minuti per consentire alle celle di acclimatarsi.
Aprire le valvole del pallone di fissaggio laterali sia verdi che arancioni chiudendo entrambe le valvole del pallone di crescita per avviare il flusso delle celle. Attendere circa cinque minuti per consentire alle celle di raggiungere la diapositiva. Durante questo periodo, focalizzare il microscopio e regolarlo agli stessi parametri di imaging utilizzati negli esperimenti precedenti.
Iniziare l'acquisizione dell'immagine per la fase di attacco. Controllare dopo circa cinque e 10 minuti per assicurarsi che la messa a fuoco sia stata mantenuta. In caso meno, prova a regolare lo stato attivo immediatamente dopo l'acquisizione dell'immagine successiva.
Immediatamente dopo il termine della fase di attacco, salvare il file. Quindi aprire le valvole del pallone di crescita lato verde e arancione chiudendo entrambe le valvole del pallone di fissaggio. Fare attenzione a non urtare il palco se alcune valvole si trovano all'interno della camera di incubazione.
Scollegare la sonda termometrica e sostituire il pallone di fissaggio con il pallone di crescita. Ora, configura il software per acquisire un'immagine ogni 15 minuti in 22 ore e inizia l'acquisizione di immagini per la fase di crescita. Una volta terminata l'acquisizione della fase di crescita e salvato il file, aprire le valvole di fissaggio laterali verdi e arancioni, che possono fare rumore quando la pressione si rilascia sul lato arancione.
Tirare su sui tubi laterali verdi provenienti da entrambi i contenitori multimediali, fino a quando non sono almeno diversi centimetri sopra il supporto. Quindi, far funzionare la pompa ad alta velocità per rimuovere tutti i supporti dal tubo, il che rende la pulizia molto più semplice. Infine, quantifica i video come descritto nel protocollo di testo.
Questo video di microscopia a campo scuro time lapse mostra l'attaccamento di cellule albican di tipo selvaggio Candida al sottoflusso del substrato durante la fase di attacco, seguito dalla successiva crescita e sviluppo durante la fase di crescita che porta alla formazione di biofilm. I dati di questi video possono essere analizzati per i tassi di attacco cellulare e distacco e biomassa nel tempo, mostrati qui è la biomassa totale all'interno della regione di imaging come determinato dall'analisi densitometrica. Vengono mostrati anche il tasso cumulativo di attacco cellulare e la percentuale di distacco della biomassa nel tempo.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le stesse condizioni di imaging in tutti gli esperimenti, in quanto ciò consente di effettuare confronti quantitativi tra di essi.
