Name: Video: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00
Duration: 20 min

MA è stato sostenuto da una borsa di studio di Schrödinger Fondo austriaco della scienza (FWF, J3086-B11) e ringrazia il Max-Planck-Società per il sostegno finanziario e amministrativo. GS è stato sostenuto dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS13-030). JH è stata sostenuta dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS14-031).

1. Generazione e funzionalizzazione di Planar SLB <ol><li> Miscelazione dei lipidi <ol><li> Per arrivare a un DGS NTA-Ni / 90% Composizione POPC lipidi 10% sciogliere 45 mg di POPC e 6,9 ​​mg di DGS NTA-Ni in cloroformio in 250 ml pallone da fondo. Mantenere il volume di cloroformio bassa (solo alcuni ml) per evaporare nel passaggio successivo. Per un DGS NTA-Ni / 99% Composizione POPC lipidi 1% usa 49,5 mg POPC e 0,69 mg di DGS NTA-Ni. </li><li> Rimuovere il cloroformio mediante un evaporatore rotante lentamente - un aumento di sopra della temperatura ambiente non è necessaria. In alternativa, soffiare fuori all&#39;interno di una cappa chimica in una corrente di gas inerte quale azoto o argon. Nel fare questo girare costantemente la beuta per uniformare la deposizione del lipide essiccazione sulla metà inferiore del pallone a fondo tondo. </li><li> Una volta che la maggior parte del cloroformio è evaporato, collegare il pallone aspirare O / N per rimuovere il cloroformio quantitativamente. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per evitare la contaminazionedi proteine ​​e cellule con cloroformio tossico nelle fasi successive e per assicurare doppio strato lipidico fluidità. </li></ol></li><li> Generazione di piccole vescicole unilamellari (SUV) da lipidi secchi NOTA: piccole vescicole unilamellari (SUV) sono tra i 20 nm e 100 nm di diametro e possono essere facilmente prodotti da bagno di sonicazione. Lipid estrusione, un metodo alternativo, può dar luogo a SUV e, a seconda della dimensione dei pori del filtro applicato per estrusione, anche grandi vescicole unilamellari (Luvs), che sono 100 nm a 1000 nm in dimensioni. Tuttavia, i SUV sono più adatti per la formazione di SLB. <ol><li> SUV attraverso il bagno ultrasuoni (mostrato nel video): <ol><li> Degassare PBS. Sospendere la miscela secca lipidica con 250 ml pallone basso in 10 ml di PBS degasato. </li><li> Riempire il pallone con gas inerte quale azoto o argon, chiudere con un tappo e sigillare il matraccio con nastro autoclave. </li><li> Porre il pallone chiuso in un bagno sonicatore e sonicare la sospensione lipidica unt 120 a 170 W fino a quando si è rivelato chiaro. Questo richiede tra i 30 ei 60 minuti. </li><li> Monitorare l&#39;avanzamento di vescicole formazione spettro-fotometricamente: derivare che l&#39;assorbimento di emulsione non diluito rispetto a PBS resta costante a 234 nm (come indicatore approssimativo per la concentrazione di lipidi) ma dovrebbe diminuire sensibilmente a 550 nm (a causa della ridotta diffusione della luce tramite particelle più grandi). </li><li> Per pellet pesanti vescicole non unilamellari, che interferiscono con la formazione di un SLB contigua, la sospensione di vescicole pellet per centrifugazione, a 150.000 xg per 1 ora a 25 ° C e poi per 8 ore a 288.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa con un diametro dei pori di 0,2 micron. </li><li> Misurare la densità ottica a 234 nm e 550 nm per monitorare la chiarezza della preparazione vescicole e la quantità di lipidi sinistra. </li><li> Conservare le vescicole a 4 ° C in atmosfera di argon o azoto. Facoltativamente, utilizzare sospensione vescicola per la preparazione doppio stratoper parecchi mesi. </li></ol></li><li> SUV attraverso lipidi estrusione: <ol><li> In breve, passare la sospensione lipidica più volte attraverso un filtro con dimensione dei pori di 0,1 micron. Indipendentemente dal metodo di fabbricazione, centrifugare la sospensione vescicole due volte (1h, 150,000g, 25 ° C, poi 8h, 4 ° C, 288.000 g) a pellet vescicole non unilamellari più pesanti. NOTA: Se conservato a 4 ° C sotto gas inerte, vescicole possono essere utilizzate per la preparazione doppio strato per parecchi mesi. </li></ol></li></ol></li><li> La formazione di una SLB e ricarica con proteine <ol><li> Trattare 24 x 50 mm # 1.5 vetrini con un 3: 1 miscela di acido solforico concentrato e 30% di perossido di idrogeno per 30 min. NOTA: A causa della natura aggressiva della miscela prestare particolare attenzione, vale a dire indossare un camice da laboratorio e occhiali di protezione, come mostrato nel video! </li><li> Sciacquare vetrini sotto un flusso di DDH 2 O da una bottiglia spruzzo. Mettetele su un supporto di Teflon e lasciarli asciugareda 10 a 30 min. </li><li> Rimuovere il vetrino fondo 8 o 16 camere così, riempire il fondo con colla epossidica e posizionare accuratamente un vetrino pulito ed asciutto sul fondo della camera colla-coperto. Lasciate che la colla indurire per circa 10 min. Rimuovere la colla in eccesso dal fondo. NOTA: La tenuta stagna tra il vetrino e la camera può essere facilmente ottenuto con l&#39;uso di un dentale bicomponente modellazione pasta siliconica, che indurisce entro 10 a 30 min. Questo sigillo non è duro come colla epossidica ma resiste regolare sforzo fisico. Dopo l&#39;esperimento può essere facilmente rimosso dalla camera, che è poi riutilizzabile in esperimenti futuri. </li><li> Pipettare 120 microlitri (60μl) di una sospensione lipidica 10 volte PBS diluito in ciascun pozzetto di una 8 (16) - ben camera (preparato come descritto sopra) e lasciare che il modulo doppio strato per 20 min. Sciacquare accuratamente il doppio strato due volte con 15 ml di PBS. Una volta che il doppio strato è formato, deve sempre essere immerso in tampone e mai esposto all&#39;aria. </li&gt; <li> Riempire ogni pozzetto tutta la strada con PBS, poi togliere 330μl (camera 8-bene) o 165μl (camera 16 pozzetti). Ci sono 350μl (175μl) lasciato nel pozzo. Aggiungere 50μl (25μl) di cocktail contenenti proteine ​​His-tag diluito in PBS ad ogni pozzetto (400 o 200 ml finale) ed incubare a temperatura ambiente per 60 minuti al buio. La densità proteina di superficie può essere regolata variando la concentrazione di proteine ​​durante questa fase di incubazione. </li><li> Sciacquare ogni pozzetto due volte con 15 ml di PBS. NOTA: Tipicamente, SLB deve essere usato in esperimenti non più di 6 ore dopo la loro carica con proteine. Durante questo periodo, il recupero dopo photobleaching fluoroforo rimane fino al 95% e nessuna perdita di proteine ​​bistrato-associato può essere rilevato. La densità di proteine ​​deve essere determinata prima dell&#39;esperimento (vedere sotto). </li><li> Passaggio facoltativo: Per verificare i legami non specifici della proteina del DGS NTA-Ni contenenti SLB, lavare la SLB una volta con PBS contenente imidazolo mm 300. Il proTEIN dovrebbe venire fuori completamente. </li></ol></li></ol> 2. Microscopio Setup <ol><li> Per la costruzione di un sistema di microscopia in grado di rilevare la fluorescenza di singoli fluorocromi riferimento alle raccomandazioni indicati in premessa. </li></ol> 3. Misure di potenza NOTA: Fluorofori possono essere facilmente saturi di luce di eccitazione in eccesso. Questo accelera photobleaching senza ulteriori guadagno in emissione e dovrebbe quindi essere evitata. Per ottimizzare l&#39;illuminazione di esempio la densità di potenza di eccitazione deve essere misurata direttamente il campione. Tali misure possono anche servire come riferimento per futuri esperimenti. Inoltre, conoscendo il rapporto tra ingresso e uscita di potenza del laser è utile nel valutare dove la luce si perde nel sistema di imaging. <ol><li> Spostare il fascio di eccitazione in posizione verticale in modo da lasciare l&#39;obiettivo in un angolo di 90 °. </li><li> Posizionare la testa del misuratore di potenza sopra of il raggio e misurare la potenza del fascio (= P). Documentare il risultato. </li><li> Utilizzando il periscopio, ruotare il fascio in posizione TIRF e l&#39;immagine di un doppio strato fluorescente omogeneo intatto. Per evitare lo sbiancamento e la saturazione del segnale del CCD posto una densità neutra (ND) filtro con una densità ottica (OD) di 2-3 nel percorso ottico di eccitazione. <ol><li> Misurare i conti integrati di tutto il campo illuminato (= I totali). Inoltre, misurare la dimensione dell&#39;area illuminata (A = totale). Misurare i conteggi integrati (= I Center) del punto centrale massimo illuminata e la dimensione del punto (= Un centro). </li></ol></li><li> Misurare il segnale di fondo per pixel (= B) o al di fuori della zona illuminata o senza illuminazione del campione. </li><li> Sottrarre il segnale di fondo dai risultati misurati in 3.). A tale scopo, moltiplicando il numero di pixel della zona in questione (tutta la zona illuminata o posto al centro) con lo sfondoconteggi per pixel. (= I totale - Un .B totale e mi concentro - Un centro .B). </li><li> Dividere il integrato e lo sfondo del segnale del punto centrale corretto dal segnale integrato e lo sfondo corretta di tutto il settore dell&#39;illuminazione. NOTA: Il risultato indica la frazione della potenza totale situato all&#39;interno del punto centrale (= (centro I - Un centro .B) / (I totale - A .B totale)). Moltiplicazione di questo risultato con la potenza P misurata in 2.) determina la potenza della luce che illumina il punto centrale. </li><li> Determinare la dimensione del punto Un centro in μm². Per questo divide la dimensione pixel della fotocamera in micron per l&#39;ingrandimento dell&#39;obiettivo, prendere la piazza del risultato come μm² per pixel. <ol><li> Alternativamente misurare la dimensione dei pixel all&#39;interno dell&#39;immagine con l&#39;uso di una slitta micrometrica posta sul microscopio e prendere il quadrato del risultato come area per pixel. Multiply questo valore per il numero di pixel situati all&#39;interno del punto centrale per arrivare alla zona illuminata posto. </li></ol></li><li> Dividere la potenza P illuminando il punto centrale dalla dimensione del punto centrale Un centro, μm² per calcolare l&#39;intensità di illuminazione a 2 micron. Un esempio è riportato nella figura 6. </li><li> Valori di densità di potenza misurata in non-TIRF illuminazione sono tipicamente inferiori a quelle presenti nel TIRF illuminazione 13, che dipendono anche l&#39;angolo esatto in cui la luce laser viene riflessa totalmente. Per arrivare a densità di potenza presenti sotto illuminazione TIRF, immagine calibrata perline fluorescenti di diametro 0.1μm sia in non TIRF e TIRF. Il rapporto di intensità di fluorescenza misurata tallone in TIRF e non TIRF modalità equivale al fattore di conversione C, che permette la conversione dei valori di densità di potenza misurati in quelle efficaci sotto illuminazione TIRF (equazione 1). densità di potenza </em&gt; TIRF = C • densità di potenza non TIRF (equazione 1) con C = intensità tallone T IRF / intensità tallone non TIRF </li></ol> 4. Misure di densità <ol><li> Determinare il segnale media dei singoli fluorofori situati su un doppio strato. Bilayer-attached MHC molecole caricate con peptidi fluorescenti sono ideali per questo scopo poiché la proteina: label stechiometria è esattamente uno. Se necessario candeggina tutte le etichette sul doppio strato nel campo visivo e lasciare che la fluorescenza recupero di visualizzare singoli fluorofori. <ol><li> Registrare le immagini in rapida successione (ad esempio, applicare una acquisizione Streaming Protocol) e monitorare singole molecole mobilità su più fotogrammi. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla figura 7. </li></ol></li><li&gt; Segnare il punto centrale di illuminazione all&#39;interno del doppio strato come ROI. Misurare la ROI, la varianza nella densità di potenza di illuminazione (che è proporzionale all&#39;intensità della fluorescenza) dovrebbe essere idealmente inferiore al 15%. <ol><li> Determinare singola molecola e fluorescenza massa solo all&#39;interno di questa ROI. Integrare il segnale di una ROI, che è abbastanza grande per catturare il 99% o più delle funzioni di diffusione di punto del singolo emettitore. Quando si impiega una fotocamera con una dimensione di pixel di 16-20 micron (indicato nelle specifiche del costruttore della telecamera), un obiettivo con ingrandimento di 100 volte e una apertura numerica pari o superiore a 1,45, prendere una regione 7 di 7 pixel con il massimo di intensità situato nel centro della piazza. </li><li> Per determinare il segnale di fondo, integrare i conti di una vicina piazza 7 da 7 pixel, che non contiene un segnale di fluorescenza. Sottrarre il fondo dal segnale singola molecola per determinare il valore corretto per la singola molecola fluorescence. Selezionare solo i segnali, che sono ancora visibili nella seguente telaio. </li></ol></li><li> Ripetere il punto 4.2 cinquanta a diverse centinaia di volte. In media il segnale di fondo corretta. Se lo si desidera, tracciare i singoli valori di intensità molecola come un istogramma. Opzionale: approfittare di un plugin adatto di pacchetti software open-source (ad esempio ImageJ) o elaborare i dati utilizzando un software commerciale (ad esempio, Metamorph, Molecular Devices). Gli utenti esperti possono scrivere il proprio programma di analisi in Matlab o pacchetti software simili. </li><li> Mettere un filtro a densità neutra di 2 o superiore nel percorso di eccitazione e prendere le immagini di un doppio strato fluorescente contenente proteine ​​marcate con la stessa fluoroforo. Registrare l&#39;intensità media dei pixel all&#39;interno dello stesso ROI utilizzata per le singole misure di intensità molecola. Registrare il tempo di esposizione delle misure di fluorescenza di massa. Misurare lo stesso punto senza illuminazione per sottrazione del fondo. </li><li> Per determinare la densità proteine ​​all&#39;interno della bistrato, moltiplicare la massa di fluorescenza intensità pixel media sfondo corretta determinato al punto 4 per il numero di pixel per piazza micron (ad esempio 41,5), da 100 (se un filtro ND con un diametro esterno di 2 è stata impiegata) o 1.000 (se ND filtro con un diametro esterno di 3 è stata utilizzata) e il tempo di esposizione utilizzato nel passaggio 2 e dividerlo per il segnale medio singola molecola determinato nella fase 3, il tempo di esposizione utilizzato nel passaggio 2 e il numero di fluorofori per proteine. </li></ol> 5. verificare l&#39;integrità del doppio strato <ol><li> Preparare un doppio strato fluorescente e posizionarlo sul palco microscopio come descritto sopra. </li><li> Regolare la messa a fuoco e scattare una foto del doppio strato in modalità TIRF. Applicare un breve ma intenso impulso candeggina non TIRF modalità per l&#39;ablazione della fluorescenza in un piccolo ROI a forma di disco. </li><li> Acquisizione di un&#39;immagine del doppio strato in modalità a bassa intensità TIRF subito dopo lo sbiancamento e poi ogni cinque a dieci secondi per monitorare la velocità di recupero fluorescenza. </li><li> Momentove ad una zona diversa sul doppio strato e seguono passo 2 e 3. Prendere un&#39;altra immagine a bassa intensità modalità TIRF 5 minuti dopo l&#39;impulso di candeggina. Determinare l&#39;intensità inserisco candeggina nella zona candeggiante e confrontarlo con l&#39;intensità prima candeggio I 0 all&#39;inizio dell&#39;esperimento (nessun imbianchimento dovrebbe essersi verificato) per calcolare la frazione immobile (IF) come segue: Frazione Immobile IF (%) = (I 0 - I post candeggina) / (I 0 - sfondo) x 100, con background = intensità misurata all&#39;interno del ROI, senza luce di eccitazione applicata L&#39;IF deve essere inferiore al 10% (idealmente meno del 5%). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Microscopia molecola singola offre l&#39;opportunità unica di studiare il comportamento delle proteine ​​all&#39;interno del loro ambiente cellulare nativo. L&#39;imaging molecolare diventa quindi sempre più attraente per una vasta comunità scientifica, ma molti scienziati di vita ancora evitano l&#39;investimento iniziale in tecnologia e know-how. Il principale vantaggio derivante dall&#39;assemblaggio di un proprio sistema di imaging è che può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche di chiunque. Come suggerito qui un non TIRF-fascio di eccitazione può essere facilmente implementato in oltre ad un percorso di luce TIRF esistente, Se si desidera una rapida e definita fotometabolismo (o -Attivazione) di fluorofori e leganti, ad esempio quando si esegue FRAP o ligando esperimenti uncaging 14 . L&#39;introduzione di un divisore di fascio di emissione consente la registrazione simultanea di almeno due e, in alcuni casi fino a quattro canali fluorescenti. L&#39;elenco delle estensioni è essenzialmente limitata solo dallala propria immaginazione. Ad esempio, l&#39;attuazione di una ruota portafiltri motorizzata emissione nel percorso di emissione consente la commutazione rapida tra un massimo di dieci canali fluorescenti differenti. Quando si combinano due ruote portafiltri emissione motorizzate (tutte dotate di asole 10 filtro) in serie, fino a 18 canali fluorescenti può essere letto. L&#39;imaging basato TIRF-può essere completata con misure di mobilitazione calcio e interferenze Riflessione Microscopia (IRM), dopo l&#39;integrazione di un percorso lampada allo xeno di eccitazione o Mercurio. IRM è il metodo di scelta per visualizzare il grado in cui le cellule sono attaccate alla superficie di vetro o un SLB e possono quindi fornire informazioni critiche per l&#39;interpretazione di dati di immagini basato TIRF-. Stabilire un fascio di eccitazione allargata con l&#39;uso di un semplice specchio dicroico e un laser supplementare di 405 nm permette conduzione microscopia localizzazione fotoattivazione (PALM) o stocastico microscopia ottica ricostruzione (STORM), vale a dire due superresolutmetodologie di ioni con una precisione di posizionamento al di sotto del limite di diffrazione di luce visibile 15,16. Tuttavia, il successo sperimentale non è solo una questione di hardware. Per trarre il massimo vantaggio di imaging basato TIRF-rumore ridotto, cellule devono entrare in contatto su una superficie in un modo che non impone vincoli sulla superficie cellulare o che interferisce con la fisiologia della loro membrana plasmatica. SLB funzionalizzato con le proteine ​​appropriate per l&#39;adesione cellulare stanno superando adatto per questo scopo, perché tutti i ligandi SLB-incorporati sono lateralmente mobili e regolare la loro posizione laterale all&#39;interno del doppio strato in risposta i recettori della dinamica vincolanti e segregazione. Per produrre SLB in maniera riproducibile, è meglio iniziare con i SUV di elevata purezza. Come descritto qui, è quindi essenziale per rimuovere vescicole multilamellari, anch&#39;essi prodotti durante sonicazione, in due fasi ultracentrifugazione come questi interfere con la formazione di SLB contigui caratterizzati elevata fluidità. SLB di modulo di alta qualità solo su superfici di vetro puliti. Una volta vetrini puliti dovrebbero essere utilizzate immediatamente o conservate nel vuoto. È importante sottolineare che, SLB non devono mai essere esposte all&#39;aria come questo avrebbe portato alla loro distruzione. SLB lavaggio comporta, come mostrato, buffer di risciacquo con l&#39;uso di una pipetta sierologica, poiché questo non è solo una procedura di salvataggio ma anche risparmio di tempo. Durante la raccolta e la purificazione di proteine ​​SLB residenti dovrebbe essere evitato l&#39;uso di detergenti. Questo perché il detersivo ridurrà in modo significativo la mobilità di proteine, anche se presenti in tracce. Per aggirare la necessità di detersivo tutti insieme, espressione solubile di polyhistidine secreta ligandi tag attrezzato è raccomandato in cellule di mammifero o di insetti. Se ripiegamento da corpi di inclusione di E.coli è necessaria, la cautela deve essere applicato per rimuovere detergenti efficacemente dai corpi di inclusione prima della loro disoccupazione e ripiegamento. Un importante vantaggio di impiegare SLBS deriva dalla loro natura modulare e di ricostituzione, che permette di sezionare specificamente il ruolo di un dato recettore-ligando per l&#39;attivazione delle cellule e l&#39;adesione cellulare. A questo proposito è importante ricordare che DGS NTA-Ni dovrebbe essere presente al 10% entro il SLB, al fine di evitare che le proteine ​​in competizione per i siti di legame NTA-NI. Quando si impiegano SLB ospitano solo l&#39;1% o 2% DGS NTA-Ni, una riduzione della associazione dei una specie di proteine ​​polyhistidine-tag si può notare, soprattutto quando co-incubazione quantità crescenti di una seconda specie di proteine ​​polyhistidine-tagged (inedito osservazione). Questo fenomeno non si osserva quando si lavora con SLB che caratterizzano il 10% DGS NTA-Ni. Mentre non abbiamo mai osservato legame non specifico di qualsiasi proteina polyhistidine-tagged testato per SLB contenenti DGS NTA-Ni, tale possibilità dovrebbe essere messa alla prova quando l&#39;introduzione di una proteina per la prima volta,A tal fine si consiglia l&#39;uso di SLB privi di DGS NTA-Ni (la proteina non dovrebbe vincolare). In secondo luogo, quando si utilizza un SLB contenente DGS NTA-Ni, la proteina dovrebbe venire fuori completamente dopo il lavaggio del SLB con PBS contenente imidazolo 300 mm. Un altro vantaggio significativo di impiegare SLB è che le interazioni transitori e gli eventi di segnalazione possono essere monitorati con una maggiore risoluzione spazio-temporale 17-19. Questo è almeno in parte perché un processo vincolante tridimensionale è sostanzialmente ridotto a due dimensioni di imaging, soprattutto durante la registrazione in modalità TIRF rumore attenuato. L&#39;uso di SLB è compatibile con rilevazione del segnale singola molecola, un prerequisito per la foto-attivati ​​localizzazione microscopia (PALM) o stocastico microscopia ottica ricostruzione (STORM), ovvero la microscopia SuperResolution con una risoluzione al di sotto del limite di diffrazione 15,16. Queste modalità particolari di imaging consentono di singola molecola Förster Resonance Energy Traesperimenti nsfer progettati per visualizzare i singoli interazioni proteina-proteina in un ambiente sinaptica 20. Questo approccio è spiegato in modo molto dettagliato in una pubblicazione JoVE chiamato 21 &quot;Misurare vincolante che utilizzava un test FRET-microscopia test TCR-pMHC&quot;. Nell&#39;interpretare esperimenti basati-SLB si dovrebbe sempre tenere a mente che non tutte le proprietà di una membrana plasmatica di una cellula vivente si caratterizzano per SLB, e che alcune delle qualità mancanti potrebbero influenzare la fisiologia sotto inchiesta. Dopo tutto, le proteine ​​SLB-incorporati vengono liberamente diffondendo e non organizzati in microdomini di membrana come la maggior parte dei loro omologhi cellulari sono 5,6,22. Fogli membrana plasmatica immobilizzata derivate da cellule aderenti, che conservano l&#39;architettura membrana plasmatica delle cellule viventi in una certa misura, sono stati impiegati con successo per studiare l&#39;assorbimento da antigeni di membrana-embedded dai linfociti B 23. Tuttavia, anche talemembrane non interagiscono con un citoscheletro altamente dinamico e presentano alcuna flessibilità in quanto sono supportati da una superficie di vetro rigida. Alla luce di queste discrepanze vi è chiaramente la necessità di SLB ingegneria, che offrono i mezzi per compartimenti stagni proteine ​​in modo definito e che sono supportati da superfici di flessibilità regolabile o da superfici che cambiano la loro rigidità in risposta agli impulsi luminosi applicati localmente.

La comprensione dei meccanismi attraverso i quali le proteine ​​di membrana adempiono la loro funzione cellulare spesso può essere un compito impegnativo, perché le loro modalità d&#39;azione sono spesso definiti da interazioni a bassa affinità, che sono difficili da individuare e valutare da metodologie biochimiche convenzionali. Le proteine ​​di membrana potranno essere altamente arricchito in domini di membrana specifici 5,6 o formare strutture di ordine superiore dinamiche, che possono in linea di principio alterare la loro attività biologica 7. Non invasiva laser assistita singola molecola fluorescenza microscopia è così diventata la metodologia di scelta per studiare il comportamento delle proteine ​​cellulari in ambienti complessi. Questo vale in particolare per i processi biochimici che avvengono a livello della membrana plasmatica, in quanto questi possono in linea di principio essere monitorati in modalità rumore ridotto Total Internal Reflection (TIRF). Qui illuminazione campione è limitata a un massimo di 200 nm fetta sottile in prossimità di un vetro surface, che si traduce in una significativa perdita sfondo cellulare e, a causa delle caratteristiche della luce di eccitazione evanescente, anche in un notevole aumento della fluorescenza dell&#39;intensità del segnale 8,9. Entrambi gli aspetti sono importanti quando si mira per alta risoluzione posizionale e temporale nella rilevazione singola molecola. Planar SLB non sono compatibili solo con il microscopio TIRF. Quando funzionalizzati con ligandi opportuni ma anche fornire un accesso diretto allo studio delle dinamiche molecolari di riconoscimento cellula-cellula che si verificano nelle cellule immunitarie o altre cellule. Possono anche essere utilizzati semplicemente per posizionare cellule mobili e altrimenti non aderenti abbastanza vicino al vetrino in modo che tali cellule possono essere esposte in TIRF illuminazione, che è altamente desiderabile quando esperimenti di conduzione coinvolgono inseguimento molecola singola o singola SuperResolution basato molecola. A tal fine le proteine ​​devono essere caricati su un SLB altamente mobile. Un vantaggio intrinseco della li utilizzati<html> pid sono che non c&#39;è legame non specifico di proteine ​​affatto. Inoltre, SLB possono essere considerati come liquidi bidimensionali con una capacità intrinseca di guarire se stessi; illeciti di supporto di vetro vengono compensate fino ad un certo grado. Un protocollo passo-passo è prevista per generare bistrati altamente mobili cariche di proteine ​​di interesse. La formazione di SLB planari è descritto, contenenti 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) come ingrediente principale (90-99%) e sintetici e funzionalizzata lipidi 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3 - {[N (5-ammino-1-carbossipentil) iminodiacetico acido] succinil} nichel sale (DGS NTA-Ni) in condizioni di scarsa abbondanza (1-10%). POPC trasporta un acido grasso saturo e un acido grasso monoinsaturo e forma doppi strati lipidici di alta fluidità anche a temperatura ambiente. DGS NTA-Ni lega con la sua headgroup di coda poli-istidina e serve come ancoraggio per le proteine ​​poli-istidina-tag di scelta (Figura 1). &quot;&gt; È importante sottolineare che l&#39;hardware microscopio deve includere un numero di periferiche che sono descritte di seguito. Con le informazioni fornite e alcune conoscenze di base nel campo dell&#39;ottica e della fisica del laser, qualsiasi biologo dovrebbe essere in grado di costruire una sola configurazione di imaging molecola. Eccitazione del campione dovrebbe essere idealmente eseguita su un microscopio invertito in modalità Total Internal Reflection (TIRF) come questo regime riduce la luce spuria e sfondo eccessivo risultante diversamente da cellulare auto-fluorescenza 9. Per questo, uno speciale obiettivo TIRF-grado (vedi sotto) e l&#39;illuminazione laser sono necessari. Alcuni esperimenti richiederanno tempi di illuminazione all&#39;interno dei millisecondi e gestito in rapida successione. Per risparmiare tempo di illuminazione o per evitare sbiancamento inutili causate dall&#39;illuminazione ripetitiva è spesso utile per dividere la luce emessa in due o più canali spettrali. Questo permette la lettura simultanea di due o più profili di emissione, che può diventare un fattore significativo quando conducEsperimenti ting coinvolgono trasferimento Förster Resonance Energy (FRET). Qui l&#39;emissione risultante dal singolo impulso luce di eccitazione può essere registrato sia dal donatore FRET e FRET accettore (come emissioni sensibilizzati). La fotocamera dovrebbe catturare abbastanza fotoni con sufficientemente basso sfondo di visualizzare singoli fluorofori durante il tempo di illuminazione. Software dovrà essere all&#39;altezza del compito di sincronizzare eccitazione chiusura e l&#39;acquisizione delle immagini. Una panoramica completa è riportata qui sotto e nella figura 2: Obiettivo TIRF-grado: Per illuminazione basata su obiettivi TIRF l&#39;apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo deve essere uguale o superiore a 1,4 utilizzando vetrini normali (n = 1.515) 9. Ingrandimento può variare tra 60x a 150 volte. L&#39;obiettivo dovrebbe essere cromaticamente corretto per consentire parafocalità quando l&#39;imaging differenti fluorofori. Laser: Il numero dei disponibili laseOpzioni r è notevolmente aumentata negli ultimi anni. I moderni modulabili elettronicamente laser a onda continua a diodi sono economicamente efficienti e possono essere utilizzati con frequenza e velocità senza precedenti. Più costoso laser ioni gas eccellere in qualità del fascio laser, ma richiedono chiusura esterna (vedi sotto) e spesso esteso (acqua) di raffreddamento. Persiane Eccitazione: modulatori acusto-ottico (AOM) consentono veloce chiusura in rapida successione 10. Per stretto chiudendo la combinazione di un AOM con persiane meccanici è raccomandato. In questo modo forte surriscaldamento della OMA dovuto all&#39;esposizione luce continua è evitata e la luce fuoriesce dal AOM in bassa posizione viene annullato. Le lenti vengono usati per allargare raggi laser e di concentrarsi loro sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo. In questo modo, la luce di eccitazione lascia l&#39;obiettivo come un fascio parallelo (figura 3), che è richiesto per l&#39;illuminazione di TIRFil campione. Spostando il punto focale sul piano focale posteriore dal centro alla periferia del obiettivo cambierà l&#39;angolo al quale il fascio lascia l&#39;obiettivo, ma non la posizione del punto laser al campione (figura 3), che è una funzione della geometria complessiva del fascio. Illuminazione TIRF consegue ad un angolo critico, che può essere regolata tramite una serie di specchi che funzionano come un periscopio per tradurre il punto focale del laser nel piano focale dell&#39;obiettivo. Lenti devono essere cromaticamente corrette e possono essere utilizzati in un insieme di due o tre lenti. Un sistema a tre lenti costituito da due lenti agiscono come un telescopio per allargare il fascio laser (e quindi il punto di illuminazione al campione) e una terza lente per focalizzare il fascio allargato nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo (Figura 4). Entrambe le funzioni (telescopio e focalizzazione) possono essere ottenuti anche con una combinazione di soli due lenti (vedere Figura 4). Specchi dovrebbe essere almeno il 95% di riflessione per evitare la perdita di luce laser. Per ogni regolazione fascio un insieme di due specchi viene solitamente applicato come tale disposizione è sufficiente regolare precisamente ogni angolo e la posizione di un fascio laser. Sovrapposizioni dicroici riflettono e trasmettono la luce di diverse lunghezze d&#39;onda determinate e sono utilizzati per sovrapporre o dividere i fasci di due laser. Filtri Polychroic sono più complessi di filtri dicroici e sono necessari per riflettere la luce di eccitazione in ingresso e in uscita trasmettere emissione di luce dal campione. Essi sono posti nel cubo filtro tra l&#39;obiettivo e la lente tubo del microscopio. Pulire filtri: A seconda del tipo di laser employe d laser pulire filtri con una banda stretta di trasmissione deve essere collocato nel raggio laser destra dopo che lascia il laser. Filtri notchsono progettati per assorbire efficacemente la luce laser con una larghezza di banda stretta e trasmettere ogni altra luce. Essi sono posti all&#39;interno del percorso di emissione per filtrare qualsiasi luce eccitazione laser spuria. Tuttavia, i filtri notch funzionano solo a 0 ° angolo di entrata. Se la larghezza di banda del filtro notch è molto forte, i diversi angoli in arrivo non possono essere riflessi più. Blocco di luce laser laser collimato non è interessato, ma la luce di back-sparsi potrebbe non essere efficiente impedito di raggiungere la fotocamera. Ruote portafiltri motorizzate dotati di filtri appropriati ruote possono essere facilmente inseriti nel eccitazione ed emissione percorso e permettono un semplice passaggio tra le diverse intensità di luce (se dotato di filtri ND) o canali fluorescenti (quando posto di fronte a una lampada allo xeno o di mercurio per raziometrico Calcio Imaging o davanti alla telecamera per selezionare per il fluoroforo che emette). 50:50 cubo beam splitter cun utilizzato per dividere in due fasci laser percorsi ottici distinti eccitazione e anche di combinarli davanti periscopio. Separatore di fascio (percorso di emissione): Per una rapida acquisizione immagine senza necessità di modifiche filtri fisici, il fascio di emissione è suddiviso in un canale blu spostata e spostata verso il rosso. In linea di principio, divisori di fascio può essere costruito impiegando un cuneo dicroico o un insieme di specchi e di uno specchio dicroico per separare il fascio di emissione in un modo dipendente dalla lunghezza d&#39;onda. Due filtri di emissione sono necessari per ripulire i canali emessi. Filtro spaziale: il filtraggio spaziale del fascio di eccitazione a volte è necessario per rimuovere i raggi di luce non parallele emesse da raggi laser di bassa qualità. Un filtro spaziale costituito da un telescopio a due lenti con un piccolo foro stenopeico collocato esattamente nel punto focale di entrambi gli obiettivi. Questa luce spuria modo risultante da porzioni non paralleli del raggio laser viene efficacemente bloccata. Sucondizioni ch devono essere soddisfatte al momento di stabilire la microscopia a base di TIRF. Aumenta filtraggio spaziale con fori più piccoli, che sono più difficili da posizionare nel punto focale, e con lunghezze focali minori della prima lente. Per ridurre gli effetti causati da aberrazioni è vantaggioso impiegare al posto delle lenti semplici di alta qualità e obiettivi del microscopio Infinity corretta con basso ingrandimento (10x o 20x). Periscope: Una configurazione periscopio è necessario tradurre il fascio laser focalizzato sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo, un prerequisito per l&#39;imaging TIRF. Può essere facilmente costruito da due specchi due pollici, una fase traslazionale per la regolazione del primo specchio ed un posto per posizionare il secondo specchio per riflettere il fascio luminoso focalizzato allargata e di eccitazione nel microscopio (Figura 5). Fotocamera: retroilluminato Electron-Moltiplicando Charge Coupled Devices (EMCCD) sono comunemente usate perla registrazione di segnali di singola molecola. Questo è a causa della loro elevata efficienza quantica (fino al 95%), ad alta velocità di acquisizione (fino a 30 MHz) e relativamente a basso rumore. Raffreddamento fino a -80 ° C riduce il rumore termico ed è supportato da una serie di telecamere EMCCD attualmente disponibili. Una limitazione della tecnologia EMCCD è che il rumore fotocamera aumenta linearmente con il sia il guadagno della telecamera e il segnale che viene catturato. Questo non è il caso con scientifici CMOS (sCMOS) telecamere, che sono significativamente meno costosi e operano grazie alla particolare architettura del chip sCMOS anche molto più veloce di telecamere EMCCD. Tuttavia un problema associato con la tecnologia CMOS è che l&#39;acquisizione immagine presenta ancora un certo grado di un&#39;indicazione quantitativa su un unico livello molecola, perché ogni pixel dotato sensibilità di rilevamento diverso. In linea di principio può essere compensata tramite pixel normalizzazione, ma questa procedura non è affatto banali 11. Questo è il motivo per cui abbiamo ancora esitato a rielogiare telecamere sCMOS per singolo microscopio molecola, ma in vista del rapido sviluppo di questa tecnologia, le macchine fotografiche sCMOS potrebbero presto diventare la fotocamera di scelta. Lento telecamere telecamere CCD a scansione evitare l&#39;amplificazione legati rumore e pixel varianza tutti insieme e sostenere più veloci velocità di acquisizione se possono essere utilizzati in una cosiddetta modalità &#39;cinetica&#39;. In questo modo l&#39;intero chip fotocamera eccezione di una regione di interesse (ROI) è mascherato, che rende possibile impiegare chip stesso come dispositivo di memorizzazione. Dopo la ROI viene esposta per la prima volta, i costi risultanti sono spostati nell&#39;area mascherata della linea di chip pixel per riga di pixel, in cui l&#39;immagine è protetta da un&#39;ulteriore esposizione alla luce. Una volta che lo spostamento di tutte le linee della ROI nella regione mascherato è completata (nel range sub-millisecondo), il ROI stessa è pronta per l&#39;esposizione successiva. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando tutte le linee di pixel del CCD pagano. Il chip viene poi letta lentamente con marcatamente redurumore di lettura ced. Ad esempio su un chip 1000 x 1300 pixel, 20 ROI di 50x50 pixel possono essere registrati in rapida successione. Poiché le immagini rimangono sul chip per un tempo considerevole prima di essere letta, è fondamentale garantire mascheramento di alta qualità e per raffreddare la telecamera (ad esempio con azoto liquido) come mezzo per ridurre il rumore termico eccessivo. Alcune videocamere EMCCD supportano anche la modalità cinetica. Software: Timing dei laser, persiane, AOMS e di esposizione della fotocamera, così come la memorizzazione delle immagini corretto sono parte integrante di qualsiasi esperimento di imaging di successo. In linea di principio molte operazioni definite possono essere programmati con i pacchetti software disponibili che vengono con la macchina fotografica. Pacchetti software commerciali supportano un gran numero di periferiche hardware, che possono essere attuate con scarso know-how tecnico. Generatore di impulsi, di acquisizione dati (DAQ) (con canali di uscita analogici e digitali) e oscilloscopio: Un generatore di impulsi è unscelta eccellente per convertire impulsi di comando in impulsi di tempo e di tensione definita. In questo modo i laser possono essere controllati con precisione per la potenza di uscita e cronometrate in millisecondi per gamma sub-millisecondi. Schede DAQ con uscite analogiche a raggiungere lo stesso e sono facilmente integrabili nella scheda madre del computer tramite slot PCI. Durata impulso, ampiezza e frequenza vengono verificati con un oscilloscopio. Allegato dell&#39;intero percorso del fascio di eccitazione: Per evitare fluttuazioni nel profilo di eccitazione a causa convezioni aria l&#39;intero percorso del fascio di eccitazione deve essere racchiuso dal suo ambiente di laboratorio. Questa misura è particolarmente importante per lo svolgimento di microscopia TIRF. Componenti ottici sono protetti da polvere e l&#39;occhio umano dall&#39;esposizione luce laser. Le custodie possono essere facilmente costruire da cartone nero, che possono essere acquistati nei negozi di arti. Per determinare la fluidità del Recovery SLB fluorescenza dopo PhotobleacHing (FRAP) misurazioni 12 vengono eseguiti. Per FRAP l&#39;esistenza di due percorsi ottici eccitazione è consigliabile (vedere Figura 3). Il primo percorso ottico è progettato per l&#39;immagine di fluorescenza del doppio strato. Questo può essere fatto in configurazione TIRF e con bassa intensità luminosa. Il secondo percorso ottico dovrebbe consentire un breve ma intenso impulso candeggina e deve essere configurato in modo non TIRF, in modo che lasci l&#39;obiettivo lungo l&#39;asse ottico. Una apertura rotonda può essere inserito nel percorso del fascio di eccitazione (vedi Figura 8) per proiettare un profilo di candeggina perfettamente rotonda con bordi definiti. Per questa immagine apertura sul piano oggetto, la sua posizione ottimale sia nel piano focale della lente 3 (vedi Figura 3). Tuttavia, a causa della lunghezza focale di questa lente, un&#39;immagine un&#39;apertura di qualità sufficiente può anche essere generato, quando l&#39;apertura è posto in posizioni leggermente spostata. Dopo aver eseguito tegli l&#39;imaging esperimento i dati grezzi devono essere analizzati in modo appropriato. Diversi protocolli passo-passo sono offerti, che coprono la regolazione delle impostazioni principali (ad esempio potenza di illuminazione e di tempo, angolo TIRF), l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ml round bottom flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-1357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50:50 beam splitter cubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BS013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>-</td>
			<td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>489-1312</td>
			<td>or any other heat-stable sticky tabe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>alternative to the bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator QSONICA Q700</td>
			<td>QSONICA</td>
			<td>Q700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beam splitter</td>
			<td>Cairn</td>
			<td>P280/210/MLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;chi rotary evaporator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>531-0837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td>see manuscript text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentarted hydrogenperoxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9683.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X944.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy glue</td>
			<td>Uhu</td>
			<td>45705</td>
			<td>Uhu plus sofortfest 2min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter wheel</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek chambers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser&#160;</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>-</td>
			<td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens</td>
			<td>Thorlabs, Newport</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGS NTA-Ni (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>790404C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical filters</td>
			<td>AHF, Chroma, Semrock</td>
			<td>-</td>
			<td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>BK Precision&#160;</td>
			<td>2120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>degas before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periscope</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picodent twinsil 22</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13001000</td>
			<td>alternative to the epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power meter Lasermate-Q</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>-</td>
			<td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse generator</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SRS DG535&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatial filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KT310/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440782-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloromethane/chloroform</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3313.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>45237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RC M150GX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S120-AT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

L&#39;architettura del sistema di microscopia a fluorescenza singola molecola è descritto in considerevole dettaglio in figura 2. Parti individuali, come componenti ottici e altri componenti hardware sono illustrati nell&#39;introduzione. I percorsi ottici del fascio di eccitazione, che generano in maniera definita TIRF e non TIRF illuminazione, vengono presentati e descritti nelle figure da 3 a 5. Nota la posizione del fascio splitter 50:50 di fronte allo specchio prima periscopio posizionato sulla una fase traslabile micrometri (Figura 5). Questo divisore di fascio sovrappone fascio TIRF utilizzata per l&#39;imaging (indicato in verde) e il fascio non TIRF (indicata in rosso) usato per sbiancare o l&#39;attivazione campione luce mediata apertura definito locale (come illustrato in figura 3). I percorsi combinati luce (Figura 5, indicati in arancione) si riflettono attraverso il secondo specchio periscopio nella porta posteriore del micr invertitooscope. Come spiegato in figura 4 e indicato in figura 2, la realizzazione di due o tre lenti convesse allarga i profili fascio laser e concentra i raggi laser sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo per dare origine a due fasci collimati illuminando il campione in TIRF e rispettivamente, in non-TIRF. Un esempio di valori di intensità misurati necessari per calcolare la densità di potenza sul provino è mostrato in Figura 6. Il segnale di fondo media da sottrarre intensità misurate nella zona illuminata e centrale (utilizzata per l&#39;imaging), è determinato in una regione all&#39;interno del campo visivo, che non è illuminato dal fascio laser (qui 7089 conteggi). Lo sfondo corretta dell&#39;intensità media delle illuminati (1684 conteggi) e la zona centrale (4830 conteggi) vengono poi moltiplicati per le dimensioni corrispondenti regione per dare origine a intensità integrate (1.471x 10 8 conteggi per la zona illuminata e 3.424 x 10 7 conteggi per la zona centrale). Il rapporto tra le intensità integrati all&#39;interno delle regioni centrali e illuminati produce la frazione della potenza complessiva illuminare la zona centrale (0,23 o 23%). Come mostrato nel film, la potenza complessiva deve essere determinata in oggettivo con l&#39;uso di un misuratore di potenza nel modo di illuminazione non TIRF. Nel nostro esempio viene regolato a 5 mW, dando così luogo ad una potenza di 5 mW x 0,23 = 1,15 mW nella zona centrale. Poiché 41.5 pixel quantità nel nostro esempio a 1 micron 2, la zona centrale ha una dimensione di 7089 pixel /41.5 pixel x 2 = 170,8 micron micron 2. Dividendo la potenza della luce che illumina l&#39;area centrale (1,15 mW) di ​​questa area (170,8 micron 2) produce una potenza mediadensità di 0,7 kW / cm 2 nella zona centrale. Figura 7 presenta immagini corrispondenti risultati di intensità dei singoli fluorofori acquisite in rapida successione (100 fotogrammi al secondo, vale a dire con un arco di tempo di 10 msec). Per la quantificazione intensità del segnale medio di una regione rettangolare di sette a sette (= 49) pixel, che copre il segnale di fluorescenza, è determinata. Inoltre il segnale media dello sfondo è determinato all&#39;interno di una regione rettangolare di sette a sette pixel in prossimità del segnale singola molecola. Il segnale media di fondo corretta viene moltiplicato per il numero di pixel all&#39;interno della regione (= 49) per dare origine a segnali di singola molecola (in grassetto). Un esperimento rappresentativo FRAP progettato per valutare la mobilità delle proteine ​​fluorescenza-etichettato SLB-associata è mostrato nella Figura 8. Nota nella Figura 8A del repetitiva uso di una bassa intensità del fascio di imaging ampliato e l&#39;uso singolo di un secondo più stretta e diaframmi definito fascio ad alta intensità per una rapida ablazione fluorocromo al secondo punto tempo zero. Intensità media background-sottratto all&#39;interno del cerchio giallo, che sono stati normalizzati per il valore medio iniziale di intensità prima dell&#39;impulso di candeggina, sono riportati nella Figura 8B contro il tempo per registrare la velocità e la misura in cui la fluorescenza ha recuperato. Come mostrato, più del 90% (indicato dalla linea verde) dell&#39;intensità doppio strato iniziale recuperato entro 75 secondi dopo l&#39;ablazione fluorocromo. Come conseguenza meno del 10% delle proteine ​​incorporate nel SLB mostrato sono immobili. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Figura 1. schema schematica di un sistema di SLB. (A) SLB sono fatti di POPC (90-99%) e la lipidi sintetici DGS NTA-Ni (1-10%). Essi formano spontaneamente quando le superfici di vetro pulite sono accusati di SUV, comprensivi di lipidi corrispondenti. (B) Una volta formate, queste SLB possono essere facilmente decorato con proteine ​​solubili estesi o con un C o tag N-terminale contenente dodici istidine (12H, per esempio la molecola co-stimolatore B7-1 e la molecola di adesione dimeri ICAM-1) o proteine ​​esteso con due tag contenente sei istidine ciascuno (2x6H, per esempio, un dimero αβMHC classe II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Laser Figura 2. Presentazione dei percorsi di eccitazione e di emissione del fascio di ioni. Gas (es Ar + o Kr +) può essere azionato per chiusura rapida con l&#39;uso di acusto mo ottica<html> dulators. Laser diodi sono oggi disponibili in molte lunghezze d&#39;onda e rappresentano un&#39;ottima alternativa in quanto possono essere modulati elettronicamente in microsecondo-rabbia. Si noti che i raggi laser possono essere facilmente regolati con due (dicroiche) specchi e dividere e combinato con l&#39;uso di semplici divisori di fascio per dare origine a due o più percorsi ottici. In questo esempio, un fascio di imaging TIRF (per monitorare gli eventi) e un fascio candeggina (per entrambi fluorofori candeggina o foto-attivare molecole gabbia in modo un&#39;apertura definita) sono utilizzati. Entrambi i percorsi di eccitazione possono essere azionati indipendentemente l&#39;uno dall&#39;altro tramite l&#39;uso di persiane aggiuntivi. Il periscopio permette di tradurre i raggi laser focalizzato nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo di generare TIRF illuminazione del campione. L&#39;immagine fluorescente può essere diviso spettralmente con l&#39;uso di un divisore di fascio di emissione prima acquisizione con l&#39;utilizzo di una telecamera ultrasensibile (es EM-CCD o scientifiche fotocamera CMOS)..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figura 3. Regolazione illuminazione TIRF traducendo il fascio focalizzato sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo. Come mostrato il punto focale del fascio laser viene spostato nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo dal centro alla periferia attraverso traslocazione del fascio (utilizzo di una specchio periscopio). Come risultato un fascio parallelo lascia l&#39;obiettivo in un&#39;illuminazione inclinato fino a raggiungere un angolo critico oltre il quale avviene riflessione interna totale. Il campo evanescente è generato a livello di interfaccia di vetro-media in cui si verifica la riflessione totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questo fi</a><html> figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figura 4. sistemi ottici semplici a fuoco il raggio laser nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo. Tre o due lenti sono necessari per ampliare il raggio laser e di concentrarsi sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo TIRF. Due sistemi di lenti contengono meno errori lenti associata rispetto ai sistemi a tre lenti e potrebbe essere più adatto per la generazione del fascio di imaging TIRF. Tre lenti potrebbero essere preferibili quando si mira per l&#39;ampliamento del fascio definito e un luogo illuminazione con bordi taglienti, come sarebbe necessario per gli studi che impiegano foto-attivazione o -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Annotated fotografia del percorso del fascio sul retro del microscopio a fluorescenza. Come già illustrato in figura 2 una canna facilmente implementare due fasci di eccitazione, una in TIRF (indicato in verde) l&#39;altra in modalità non TIRF (indicato in rosso). Questi diventano sovrapposti con l&#39;uso di un divisore di fascio 50:50 (BS). Lenti convesse (L1 e L2) sono posizionati nei rispettivi fasci di concentrarsi loro sul piano focale posteriore dell&#39;obiettivo (non mostrati). Un periscopio costituito da due specchi (M1 e M2) guida entrambi i fasci attraverso la porta di ingresso nel microscopio. Il primo specchio (M1) può essere spostato con l&#39;uso di una fase di traduzione (TS) (girando una vite micrometrica come indicato) per spostare una delle travi in ​​posizione TIRF. Una volta TIRF è stata stabilita, il secondo fascio (usato per fotometabolismo o -Attivazione, qui indicata in rosso) può essere regolata indipendentemente dal fascio TIRF lasciare l&#39;obiettivo in non-TIRFmodalità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Figura 6. Misurazione della potenza nella zona centrale del punto di illuminazione. Come è indicato scelto appropriate regioni di interesse, che riflettono sfondo, l&#39;intera area illuminata (IA) e la zona centrale (CA), dove saranno successivamente registrati eventi. Sottrarre valori di fondo da quelli registrati per IA e CA ed integrare le intensità moltiplicando corretti dell&#39;intensità media con il numero di pixel presenti in ciascuna zona (= intensità integrate). Dividere l&#39;intensità integrata del CA da quello di IA per arrivare alla percentuale della potenza del fascio illuminante il CA (in questo esempio: 23%). Determinare la potenza della luce che illumina il CA moltiplicando la potenza complessiva del fascio (qui: 5 mW) e la percentuale illuminando il CA (qui: 0.23). Per determinare la dimensione della zona centrale moltiplicare la zona (qui: 7089 pixel) con un fattore da pixel a un&#39;area di conversione di formato (qui: 1 / 41.5 micron 2 pixel -1). Per arrivare alla densità media di potenza della luce di eccitazione che illumina il CA, dividere il potere (qui: 1.15 mW) per la dimensione della CA. (Qui: 170,8 micron 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Figura 7. La quantificazione dei segnali di singola molecola. (A) corso Tempo di singoli fluorofori su una SLB. Una regione 7 x 7 pixel di dimensioni di interesse (ROI, giallo) è collocato intorno il segnale per la quantificazione. Sfondo è determinato dalla una vicina 7 x 7 pixelsono elencati roi (verde). (B) quantificata dell&#39;intensità media dei pixel. Per determinare il segnale di singola molecola, valori di fondo (ROI verde) vengono sottratti dai valori del segnale (ROI gialla) e moltiplicati per 49. (C) intensità singola molecola di un fluoroforo sono rilevate in tempo. Si noti che il punto di tempo msec 90 viene omesso il fluoroforo è nel processo di sbiancamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Figura 8. Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) analisi per determinare l&#39;integrità del SLB. (A) FRAP è stata eseguita su un doppio strato che trasportano IEK / MCC-Alexa Fluor 647. è mostrato ogni 10 immagine dell&#39;esperimento. (B) FRAP quantificazione dell&#39;esperimento mostrato in (A). Valori medi indicano intensità (I) all&#39;interno della ROI giallo mostrato in (A) divisa per l&#39;intensità iniziale (I) prima o candeggio. Punti dati vengono visualizzati in rosso (A), la linea verde indica 0,9 recupero di intensità originali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

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