The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

1. Preparazione del campione e liofilizzazione <ol><li> Dializzare il volume necessario di soluzione madre Mb contro un tampone adatto e filtro attraverso un filtro sterile 0,22 micron. </li><li> Preparare il volume richiesto di eccipienti e foto-leucina (acido L-2-amino-4,4-azi-pentanoic; pLeu) soluzioni madre a tampone adatto. Filtrare le soluzioni madre attraverso un filtro sterile 0,22 micron. </li><li> Preparare formulazioni come mostrato nella Tabella 1 usando le soluzioni di stock di proteine, eccipienti, pLeu, e buffer. </li><li> Filtrare i campioni attraverso un filtro sterile 0,22 micron per rimuovere eventuali particelle al punto 1.3. Riempire i campioni separatamente come 0,2 ml in fiale di vetro 2 ml. Utilizzare fiale di vetro che sono trasparenti alla luce UV (365 nm) per attivare pLeu negli studi SSPL-MS. </li><li> Fiale di carico in un liofilizzatore e avviare liofilizzazione per la progettazione di un ciclo di liofilizzazione appropriata. <ol><li> Qui, congelarli a -40 ° C, seguitamediante essiccazione sotto vuoto primaria (70 mTorr) a -35 ° C per 12 ore ed essiccamento secondario a 25 ° C per 12 ore. Altro cicli di liofilizzazione e metodi di essiccazione (pe, spray drying) può anche essere usato. </li></ol></li><li> Backfill i flaconi contenenti campioni liofilizzati con azoto prima del livellamento. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Formulazioni </td><td colspan="5"> Composizione (mg / ml) prima liofilizzazione </td></tr><tr><td> Mb </td><td> Trealosio </td><td> Sorbitolo </td><td> pLeu c </td><td> Potassio, fosfato, pH 7.4 </td></tr><tr><td> MbT un </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Mbs un </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MbT + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14,3 x 10 -3 a 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MBS + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14,3 x 10 -3 a 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr></tbody></table> Tabella 1:... Composizione di formulazioni Mb liofilizzati a formulazioni utilizzate per lo studio ssHDX-MS Formulazioni B utilizzati per lo studio SSPL-MS c L-2-ammino-4,4-azipentanoic acido o foto-leucina (pLeu). pLeu a cinque concentrazioni diverse (14,3 x 10 -3 a 1,43 mg / ml) corrispondenti a 1x, 10x, 20x, 50x e 100x eccesso molare rispetto al Mb sono stati co-liofilizzato con MBT e Mbs formulazioni. 2. ssHDX-MS per Protein Intact <ol><li> Aggiungere una quantità saturante (~ 440 g) di K 2 CO 3 a 200 ml di D 2 O precedente ay collocato nel vano inferiore di un essiccatore. Sigillare la tenuta d&#39;aria essiccatore e lasciarlo equilibrare a 5 ° C fino a una umidità relativa stabile (RH) del ~ 43% è raggiunto. Altri valori RH di interesse possono essere ottenuti selezionando differenti soluzioni saline sature 23,24. </li><li> Avviare reazioni ssHDX posizionando fiale contenenti la proteina non ridotti liofilizzato nel vano superiore del essiccatore. Sigillare l&#39;essiccatore a tenuta d&#39;aria e incubare a 5 ° C per permettere HDX avvenga (Figura 2A). </li><li> Raccogliere campioni ssHDX in vari momenti in triplice copia. Per formulazioni Mb, raccogliere campioni a nove punti di tempo 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 e 144 hr. </li><li> Tappare le fiale immediatamente dopo il ritiro dal essiccatore e placare le reazioni da Flash congelamento le fiale in azoto liquido. Conservare le fiale a -80 ° C fino a spettrometria di massa. </li><li> Analizzare i campioni con un adeguato cromatografia-massa Spectrom alta risoluzione liquidoMetodo metria (LC-MS). Progettazione o acquistare un sistema idoneo LC refrigerato per minimizzare back-scambio durante l&#39;analisi del campione. Utilizzare l&#39;impostazione del gruppo frigorifero colonna e il metodo LC-MS precedentemente segnalato 25. NOTA: Poiché il tasso di ammide scambio protonico dipende dal pH e dalla temperatura, deuteroni incorporati nella proteina possono scambiare con idrogeno presente nella fase mobile (&quot;scambio back&quot;), causando una perdita di informazioni. Sebbene un pH acido (pH 2,5) di tampone quench e solventi HPLC può minimizzare back-scambio in larga misura, riducendo la temperatura (≤0 ° C) per mezzo di un sistema di refrigerazione colonna adatto può proteggere ulteriormente la proteina da back-scambio . </li><li> Collegare il loop del campione e intrappolare proteine ​​per la valvola che controlla automaticamente il processo di dissalazione e eluizione. Calibrare lo spettrometro di massa iniettando una TOF bassa concentrazione mix di sintonia nello spettrometro di massa nel range m / z di 200-3,200. Il immobilizzatoColonna pepsina e la colonna analitica non sono necessari per l&#39;analisi delle proteine ​​intatte. </li><li> Impostare la temperatura nel sistema refrigerato per ≤0 ° C e attendere che il sistema raggiunga una temperatura di funzionamento stabile di ~ 0 ° C. </li><li> Trasferire rapidamente i campioni da -80 ° C in azoto liquido per la spettrometria di massa. Utilizzando pinze, estrarre con attenzione ogni flaconcino da azoto liquido e ricostituire il campione aggiungendo un volume specifico di ghiaccio freddo quench tampone contenente acido formico al 0,2% (FA) (pH 2,5) e 5% di metanolo in acqua per flaconcino. </li><li> Programmare una HPLC e metodo adatto spettrometria di massa utilizzando il software di controllo. Per formulazioni Mb, desalt campione contenente 20 pmol Mb nella trappola proteine ​​per 1,7 min con 5% di acetonitrile, 95% di acqua e 0,1% acido formico (FA), ed eluire utilizzando un gradiente aumentato al 80% acetonitrile, 20% di acqua e 0,1 % FA in 3.3 min. Raccogliere spettri di massa nel range m / z 200-3,200. </li><li> Per determinare la massa di intattoproteine, acquisire dati per un campione undeuterated proteine ​​(cioè, proteina non sottoposto a ssHDX) in soluzione acquosa con il metodo del punto 2.9. </li><li> Ottenere le masse di campioni undeuterated e deuterati dai deconvoluting gli spettri prime utilizzando il software di analisi dei dati. Qui, impostare l&#39;intervallo di massa al 15,000-18,000 Da, la risoluzione di massa di 1,0 Da, e l&#39;altezza del picco a 90% per il calcolo della massa di Mb. </li><li> Calcolare il numero di deuteroni incorporati nella proteina intatta (qui, Mb) sottraendo la massa di proteine ​​undeuterated dalla massa di proteine ​​deuterato ad ogni tempo di cambio. </li><li> Calcolare la percentuale di deuterio assorbimento rispetto al massimo teorico utilizzando la seguente equazione (Equazione 1) <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> dove totale numero di amidi intercambiabili = numero totale di amminoacidi - numero di residui di prolina - 2 (&quot;2&quot; conti per l&#39;N-gruppo terminale amino e ammide idrogeno che subiscono un rapido back-scambio). </li><li> Montare i dati cinetici ssHDX utilizzando un&#39;equazione esponenziale adeguato. Un&#39;equazione biesponenziale (Equazione 2) è di solito la più semplice che fornisce una misura ragionevole i dati ssHDX. In questo studio, per MbT e Mbs, adattare i dati a un modello biesponenziale che assegna deutoni a &quot;veloce&quot; e &quot;lento&quot; scambio di piscine. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> dove N veloce e lento N è il numero di ammidi intercambiabili nel &quot;veloce&quot; e &quot;lento&quot; scambio piscine, rispettivamente, e k veloce e lento k sono le costanti di velocità di primo ordine associati alle due piscine. </li></ol> 3. ssHDX-MS per proteine ​​a Peptide Level <ol><li> Eseguire ssHDX seguendo i passaggi da 2.1 a 2.8, con le seguenti modifiche al punto 2.6. Collegare il colle di pepsina immobilizzatoumn colonna analitica e alla valvola come riferito in precedenza 25 e sostituiscono la trappola proteina collegata alla valvola con una trappola peptide. Calibrare lo spettrometro di massa impostando la massa per caricare rapporto compreso tra 100 e 1.700. NOTA: Durante la fase di ricostituzione (passo 2.8), un agente riducente e denaturazione agente può essere inclusa nel tampone di raffreddamento per facilitare la pepsina digestione delle proteine ​​con legami disolfuro (ad esempio, anticorpi monoclonali). </li><li> Un programma HPLC appropriata e il metodo di spettrometria di massa con il software di controllo. Per formulazioni Mb, digerire campioni contenenti 20 pmol Mb online con 0,1% FA, trappola e desalt peptidi per 1,7 minuti con il 10% acetonitrile, 90% di acqua e 0,1% FA in una trappola peptide. Eluire i frammenti sulla colonna analitica con un gradiente di aumento al 60% acetonitrile, 40% di acqua e 0,1% FA in 4,0 min. Acquisire spettri di massa nel range m / z 100-1,700. </li><li> Identificare i frammenti peptiche mediante analisi MS / MS di uncampione di proteine ​​undeuterated. Utilizzare software spettrometria di massa per confrontare masse sperimentali di ioni frammento peptide alle masse previsti di frammenti peptidici in un database personalizzato. Impostare un punto materiale cut-off (ad esempio 10 ppm) per identificare masse con basso errore. Per peptidi abbinati, preparare una lista che comprende (i) sequenza peptidica, (ii) stato di carica, e (iii) tempo di ritenzione. </li><li> Utilizzare l&#39;elenco generato al punto 3.3 per mappare e determinare il numero medio di deutoni incorporati per ogni pepsina digerire frammento. Ciò può essere ottenuto impiegando adatto software di analisi dati HDX-MS 24. </li><li> Per calcolare la percentuale di deuterio assorbimento e per adattare i dati cinetici ssHDX per ognuno dei frammenti peptica, seguire i passi 2.13 e 2.14. In questo studio, HDX dati cinetici per ciascuno dei sei pepsina non ridondante digerire frammenti da MBT e Mbs formulazioni sono stati montati su un modello di associazione biesponenziale (Equazione 2). </li></ol> 4. SSPL-MS per Pro IntactTEIN <ol><li> Per iniziare la reazione di marcatura fotolitico, prima accendere il reticolante UV e permettere le lampade per scaldare per 5 min. Verificare che la sorgente UV è dotato di lampade di lunghezza d&#39;onda 365 nm per attivare il gruppo di diazirine pLeu. ATTENZIONE: Non aprire mai la porta del reticolante UV quando le lampade sono accese. Proteggere gli occhi e la pelle dall&#39;esposizione ai raggi UV se la fonte non è racchiuso da una porta di vetro UV-protezione. </li><li> Spegnere il reticolante UV prima di aprire la porta. Una volta che le lampade sono spente, uncap fiale contenenti la formulazione liofilizzata e metterli all&#39;interno della camera reticolante UV come mostrato nella Figura 2B. Irradiare l&#39;campioni con luce UV per 40 min. </li><li> Effettuare esperimenti di controllo seguendo passo da 4.1 a 4.3 per (i) campioni liofilizzati senza pLeu e (ii) i campioni liofilizzati con pLeu ricostituito in acqua. </li><li> Cap e conservare le fiale a -20 ° C fino a spettrometria di massa. </li><li> Reconstitute campioni solidi aggiungendo un volume adeguato di acqua distillata grado spettrometria di massa per portare la concentrazione di 2 mM. </li><li> Per iniziare l&#39;analisi del campione, seguire i passi 2.6 e 2.9. NOTA: Dal back-scambio non è un problema con l&#39;etichettatura covalente, SSPL-MS non richiede uno speciale sistema LC refrigerato. </li><li> Per determinare la massa della proteina nativa, acquisire dati per un campione proteina che non è stato sottoposto a SSPL seguendo passo 2.9. Ottenere le masse di campioni non etichettati e marcati dalla deconvoluting spettri grezzo come spiegato al punto 2.11. </li><li> Calcolare il numero di pLeu inserite utilizzando la seguente formula: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> dove M L è la massa di proteina marcata, M N è la massa di proteina nativa e 115 è la massa media (Da) aggiunto alla proteina nativa seguente singola incorporazione pLeu. Si noti che la reazione di marcatura avviene con the perdita di N 2 (28 Da). La massa monoisotopico di pLeu è 143,07. </li><li> Calcolare le percentuali di popolazioni della proteina con un diverso numero di etichette utilizzando altezze del picco dei cromatogrammi ionici estratti. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> dove &quot;i&quot; indica il numero di etichette, PH i denota l&#39;altezza di picco per etichettato proteina L i e PH u denota l&#39;altezza di picco della proteina non marcato come osservato mediante spettrometria di massa. </li></ol> 5. SSPL-MS per proteica a livello Peptide <ol><li> Eseguire SSPL seguendo i passaggi da 4.1 a 4.4. </li><li> Per l&#39;analisi livello di peptide, ricostituire campioni solidi in tampone di bicarbonato di ammonio (100 mM, pH 8,0). </li><li> Dopo ricostituzione, miscelare la soluzione di proteina marcata con tripsina a 10: 1 rapporto molare di proteine ​​di tripsina e incubare a 60 ° C per 16 ore. </li><li> Placare la reazione aggiungendo 0,1% FAin acqua al campione di cedere concentrazione finale di 2 mM proteine. </li><li> Collegare il loop del campione, trap peptide e colonna analitica alla valvola collegata al sistema HPLC. </li><li> Programmare una HPLC e metodo adatto spettrometria di massa utilizzando il software di controllo. Per formulazioni Mb, iniettare 20 pmol della proteina digerita nel circuito di campionamento e desalificare i peptidi in una trappola peptide per 1,5 min con 5% di acetonitrile, 95% di acqua e 0,1% FA, seguita da una eluizione in colonna analitica con gradiente aumentare fino a 55% di acetonitrile, 45% di acqua e 0,1% FA in 22 min. Raccogliere spettri di massa nel range m / z 100-1,700. </li><li> Preparare una lista teorica di massa per peptide-pLeu addotti utilizzando uno strumento online come ExPASy 26 con i numeri di pLeu precedentemente calcolati dall&#39;analisi delle proteine ​​intatte. Includi almeno 4 perse divisioni. Si noti che la reazione di marcatura si verifica con la perdita di N 2. Pertanto, la massa del peptide-pLeu addotto = massa di prova non marcatopeptide PTIC + n (massa pLeu) - n (massa di N 2), dove &quot;n&quot; è il numero di pLeu incorporato. NOTA: Se l&#39;analisi di massa di proteine ​​intatte mostrato fino a tre popolazioni etichettati di proteine, in considerazione fino a tre possibili etichette pLeu per peptide. Per un peptide con massa di 1000 Da, la massa teorica di peptide-pLeu addotto con 1 pLeu incorporazione sarebbe 1.000 + 1 (143) - 1 (28) = 1.115 Da. Analogamente, le masse teoriche di peptide-pLeu addotti con 2 pLeu, 3 pLeu, ecc sarebbe 1.230 Da, 1.345 Da, ecc rispettivamente. </li><li> Utilizzare il software di analisi di massa in modo che corrisponda alla lista massa teorica generata al passo 5.7 con le masse osservati sperimentalmente. Impostare un punto materiale cut-off (ad esempio, 50 ppm) per identificare masse con basso errore. </li><li> Per peptidi abbinati, determinare il numero effettivo di pLeu incorporato usando la formula di cui passo 4.8 (Equazione 3), dove M e L M N sono le masse di etichettae peptide nativo, rispettivamente. </li></ol>

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Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li><li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying.">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders.">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).</li><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H/D+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics:+is+there+a+need+for+a+top-down+approach.">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li><li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis.">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids.">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Diversi studi hanno suggerito che l&#39;ambiente locale in campioni liofilizzati colpisce proteine ​​degrado 5,29,30. Tuttavia, stabilendo una relazione diretta tra struttura proteica e stabilità allo stato solido non è possibile a causa della mancanza di metodi analitici ad alta risoluzione. L&#39;applicazione di metodi di risoluzione elevate esistenti come HDX e PL di polveri liofilizzate richiede la modifica dei protocolli di soluzioni e un&#39;attenta interpretazione dei dati. HDX-MS e PL-MS sono stati successivamente adottati per monitorare conformazioni di proteine ​​nello stato solido. I risultati qui presentati e altrove 27,28,31-33 hanno dimostrato la capacità di questi metodi per monitorare conformazione proteica con alta risoluzione in ambiente solido. Anche se i passaggi critici in analisi dei dati non si discostano da etichettatura in soluzione 34-36, importanti considerazioni durante l&#39;installazione sperimentale e l&#39;interpretazione dei dati sono necessari per chemi a stato solidoetichettatura cal. Selezione del reagente etichettatura deve essere basata sulla dimensione e il meccanismo di etichettatura. Le piccole dimensioni del deuterio permette al backbone peptidico per tastare facilmente, considerando le dimensioni relativamente maggiore di pLeu limita etichettatura alle catene laterali. Sia ssHDX e SSPL mostrano alcuna preferenza per qualsiasi amminoacido, in modo che l&#39;etichettatura dipende solo backbone e catena laterale esposizione alla matrice. Per sondare efficacemente conformazioni di proteine ​​a stato solido, i fattori esterni che influenzano il processo di etichettatura devono essere controllati attentamente. L&#39;importo totale e la distribuzione spaziale di agente etichettatura in solidi liofilizzati è diverso da soluzioni acquose. In ssHDX, la quantità di D 2 O nella matrice solida può influenzare la velocità di svolgimento proteine ​​(o parziale dispiegamento), ripiegando e cambio deuterio. Questo non è il caso con la soluzione HDX, in cui il campione di proteine ​​è normalmente diluito con un ampio volume di D 2 O.Proiezione accurata degli effetti di idratazione sul tasso ssHDX può informare la selezione di condizioni ideali RH. Per controllare la velocità di assorbimento di umidità ed evitare il collasso della polvere in formulazioni contenenti eccipienti igroscopici (ad esempio saccarosio e trealosio), ssHDX può essere effettuata in condizioni refrigerate (2-8 ° C). Il nostro studio precedente sugli effetti di idratazione ha mostrato un aumento dei tassi e l&#39;entità di scambio con aumento del contenuto di umidità, come previsto. In gran parte del nostro lavoro, un RH intermedio del 43% a 5 ° C si è dimostrata ideale distinguere formulazioni in un tempo ragionevole 24. La reazione viene solitamente effettuata fino a raggiungere un plateau. Questo assicura che assorbimento di umidità e la diffusione nel solido non controllano il tasso HDX. L&#39;uso di piccole dimensioni dei campioni solidi con volume di pre-liofilizzazione di ≤2 ml aiuta anche a garantire che D 2 O vapore assorbimento è sostanzialmente completo all&#39;inizio del periodo di scambio. Anche se ssHDX-MS fornisceinformazioni quantitative sulla conformazione della proteina in stato solido, ci sono alcune condizioni in cui l&#39;interpretazione dei dati non può essere interamente basato sullo studio ssHDX solo. È possibile che l&#39;assorbimento di deuterio diminuzione osservata in un campione (in confronto al controllo) può essere dovuta alla maggiore ritenzione della struttura proteica o la notevole quantità di aggregati proteici presenti nel campione. In tal caso, l&#39;interpretazione dei dati ssHDX richiede risultati ottenuti con altri metodi complementari. Ampliamento Peak in spettri di massa deuterato è stato osservato per diverse formulazioni Mb 27,28. Questo potrebbe essere dovuto a vari fattori come la presenza della popolazione proteine ​​parzialmente unfolded, eterogeneità spaziale nel campione oppure i gradienti spaziali nella concentrazione D 2 O. Tuttavia, questi fattori non sono stati distinti in ssHDX-MS e necessita di ulteriori indagini. Come SSPL-MS è relativamente nuovo rispetto ad altri metodi, ab apprendimento continuole sue applicazioni e le limitazioni è necessario. In SSPL, foto-cross-linker viene liofilizzata con la proteina. La mancanza di umidità limita la mobilità dei componenti all&#39;interno della matrice solida, e il rilassamento strutturale parziale che può verificarsi con assorbimento di umidità in ssHDX non è un fenomeno in SSPL. Questo limita etichettatura SSPL alle immediate vicinanze della foto-cross-linker. Tuttavia, a differenza HDX-MS, analisi MS / MS della proteina covalentemente etichettato può fornire livello residuo informazioni strutturali. Dal momento che l&#39;etichettatura SSPL è covalente e irreversibile, di nuovo cambio non si verifica e campioni può essere preparato e analizzato senza preoccupazione per la perdita di etichetta. Per facilitare la diffusione dell&#39;agente etichettatura e migliorare l&#39;efficienza di etichettatura in solido-matrice, SSPL può essere eseguita con l&#39;aumentare% RH. pLeu assorbimento può essere migliorata aumentando la concentrazione dell&#39;agente fotoreattivo. Il rapporto molare di proteine ​​per pLeu può essere variato come desiderato. In generale, un eccesso 100x molare di pLeu a proTEIN garantirà un&#39;adeguata etichettatura. Tuttavia, alta concentrazione pLeu può causare la perdita di proteine ​​struttura terziaria nella matrice solida. Quindi, Oltre a cinetiche di etichettatura e composizione formulazione, selezione di concentrazione pLeu deve basarsi sul mantenimento proteine ​​integrità strutturale. Come pLeu etichette non selettivamente XH (dove X = C, N, O) gruppo, è possibile che gli eccipienti con siti di etichettatura simili possono influenzare notevolmente il livello di etichettatura proteine. L&#39;interferenza degli eccipienti nella disponibilità di pLeu per l&#39;etichettatura proteina è ancora da caratterizzare. È noto che la carbene generato dall&#39;attivazione diazirine non è specifica residui tuttavia uno studio riporta propensione Asp e Glu 36. Mentre è bene conoscere interazioni specifiche residui, informazioni peptide-livello è anche utile e può essere utilizzato per progettare eccipienti di bloccare regioni con elevata esposizione matrice allo stato solido. SSPL-MS fornisce informazioni qualitative dettagliate, tuttaviaha bisogno di dati quantitativi che si vuole ottenere e metriche robuste devono essere sviluppate per analizzare le differenze di formulazione attraverso una varietà di sistemi di liofilizzati. L&#39;uso di un&#39;etichetta specifico residuo combinato con analisi MS / MS può migliorare ulteriormente risoluzione al livello amminoacido. Reagenti Etichettatura quali 2,3-butanedione di etichettare Arg, N derivati ​​-hydroxysuccinimide per Lys e N derivati ​​-alkylmaleimide per Cys può essere utilizzato per mappare con precisione le interazioni molecolari in polvere liofilizzata. Tuttavia questi reagenti sono pH-dipendenti e le reazioni non possono essere così controllati, come l&#39;etichettatura fotolitico in stato solido. Un approccio alternativo è di incorporare la foto-cross-linker nella sequenza proteica con l&#39;uso di linee cellulari auxotrofi, mutagenesi sito-diretta o catena laterale derivatizzazione. I nostri precedenti studi ssHDX-MS e SSPL-MS hanno dimostrato che l&#39;etichettatura delle proteine ​​dipende dalla natura e la quantità degli eccipientiutilizzato 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS di Mb co-liofilizzato con guanidina cloridrato (Gdn.HCl) hanno mostrato maggiore assorbimento di deuterio di Mb co-liofilizzato a basso peso molecolare zuccheri 32. In uno studio SSPL-MS separato, Mb co-liofilizzato con Gdn.HCl ha mostrato una maggiore protezione da etichettatura fotolitico di Mb con saccarosio 33. Inoltre, le misure quantitative da ssHDX-MS sono stati fortemente correlati con la stabilità di proteine ​​durante la conservazione a lungo termine 28. Questi studi suggeriscono che ssHDX o SSPL di proteine ​​riflette il grado di ritenzione strutturale della proteina in polvere liofilizzata. Noi crediamo che il mantenimento della struttura secondaria in polveri liofilizzate fornisce un ambiente favorevole per l&#39;etichettatura catena laterale con pLeu e la protezione di ammide idrogeno da cambio deuterio. Tuttavia, confronto dettagliato del contenuto informativo di questi metodi deve essere eseguita in futuro. Sebbene stabilire l&#39;utilità di ssHDX-MS e SSPL-MScome strumento di screening formulazione alla fine richiederà che essere applicato a molte proteine, i risultati dei nostri studi recenti supportano l&#39;adozione più ampia. Con un ulteriore sviluppo, questi metodi dovrebbero essere ampiamente utile per caratterizzare formulazioni di proteine ​​a stato solido nel settore biofarmaceutico.

Farmaci proteici sono il settore in più rapida crescita del settore biofarmaceutico e offrono promettenti nuovi trattamenti per le malattie precedentemente incurabili, tra cui disturbi ormonali, tumori e malattie autoimmuni 1. Nel 2012, il mercato globale ha raggiunto biotherapeutics 138.000 milioni dollari e si prevede di raggiungere i 179 miliardi dollari entro il 2018 2. Le proteine ​​sono più grandi e più fragile rispetto ai tradizionali farmaci a piccole molecole e così sono più sensibili a molti tipi di degrado 3. Per assicurare un&#39;adeguata shelf-life e stabilità, farmaci proteici sono spesso formulati come liofilizzato (cioè, liofilizzato) polveri solide. Tuttavia, una proteina può ancora subire degradazione allo stato solido, in particolare se la sua struttura nativa non viene mantenuto durante il processo di liofilizzazione 4,5. Assicurare che la struttura è stata mantenuta è possibile solo se ci sono metodi analitici che possono sondare conformazione proteica nello stato solido con sufficienRisoluzione t. Spettroscopia NMR 6 e cristallografia a raggi X 7 sono i metodi ad alta risoluzione comunemente usati per valutare la struttura delle proteine ​​in soluzione e cristalline solidi 8. A causa della natura degli eccipienti e metodi di trasformazione utilizzati, formulazioni proteiche liofilizzati sono solitamente amorfi anziché cristallina 9. La mancanza di omogeneità e di ordine microscopico rende le tecniche sopra menzionate impraticabile per le proteine ​​nei solidi amorfi. Spettroscopia in trasformata di Fourier (FTIR) 10, spettroscopia Raman 11 e spettroscopia vicino infrarosso (NIR) 12 hanno regolarmente utilizzati dall&#39;industria biofarmaceutica di confrontare proteina struttura secondaria in polveri liofilizzate a quello della struttura in soluzione-stato nativo. Tuttavia, questi metodi sono a bassa risoluzione e in grado di fornire solo informazioni sui cambiamenti globali nella struttura secondaria. Solid-state caratterizzazione strutturale mediante FTIRha dimostrato sia debole 13,14 o poveri 15 correlazione con la stabilità di archiviazione a lungo termine. Queste limitazioni mettono in evidenza la necessità di metodi ad alta risoluzione adatte per identificare proteine ​​perturbazioni strutturali nello stato solido. Etichettatura chimica accoppiato con proteolisi e della spettrometria di massa è emerso come un approccio efficace per il controllo struttura delle proteine ​​e le interazioni molecolari in soluzione acquosa. In sviluppo farmaceutico, HDX-MS è stato utilizzato per la mappatura degli epitopi nelle interazioni antigene-anticorpo 16,17, per mappare le interazioni recettore-droga 18, per monitorare gli effetti delle modificazioni post-traslazionali sulla conformazione dei farmaci proteici 19, e per confrontare lotto a lotto variazione sviluppare biosimilari 20. Analogamente, ligandi fotoattivabile sono stati utilizzati per identificare bersagli farmacologici e determinare l&#39;affinità di legame e la specificità delle interazioni farmaco-recettore 21,22. Per inviarextend l&#39;applicazione di questi metodi a formulazioni liofilizzati, il nostro gruppo ha sviluppato a stato solido spettrometria di massa di scambio idrogeno deuterio (ssHDX-MS) e allo stato solido spettrometria di massa etichettatura fotolitico (SSPL-MS) per studiare conformazioni di proteine ​​e le interazioni eccipiente in campioni liofilizzati con alta risoluzione. In entrambi ssHDX-MS e SSPL-MS, la proteina è etichettato in condizioni di reazione ideali in solidi liofilizzati, ei campioni sono poi ricostituito e analizzato mediante spettrometria di massa con o senza digestione proteolitica. ssHDX-MS fornisce informazioni sulla catena principale di esposizione al vapore di deuterio, mentre SSPL-MS fornisce informazioni sull&#39;ambiente delle catene laterali (Figura 1). I due metodi possono perciò fornire informazioni complementari su conformazione proteica in stato solido. Qui, forniamo un protocollo generale per lo studio delle proteine ​​nei solidi liofilizzati utilizzando ssHDX-MS e SSPL-MS (figura 2), utilizzando come Mbun modello della proteina. Noi mostriamo la capacità dei due metodi per distinguere differenze di formulazioni con due diversi eccipienti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> Figura 1:. SsHDX e SSPL struttura proteica misura in solidi liofilizzati attraverso diversi meccanismi di etichettatura (A) In HDX, l&#39;ammide backbone idrogeni scambio con deuterio in funzione della struttura delle proteine ​​e D 2 O accessibilità. Nello stato solido, la velocità ed il grado di conversione di deuterio dipendono dal livello di D 2 O assorbimento, la mobilità della proteina (e sulla ripiegatura eventi) e la natura degli eccipienti presenti nella matrice solida. (B) In PL, irraggiamento UV a 365 nm inizia la formazione di un intermedio reattivo carbene dal gruppo funzionale diazirine di pLeu ed è inserito in modo non specifico in nessuna legame XH (X = qualsiasi atomo), o added attraverso un legame C = C nelle sue immediate vicinanze. Nello stato solido, la velocità e l&#39;entità etichettatura dipendono dalla concentrazione locale dell&#39;agente etichettatura, tempo di irradiazione, struttura proteica e la natura degli eccipienti presenti nella matrice solida. Pannelli A e B mostrano l&#39;etichettatura teorica massima che può verificarsi su backbone e catene laterali rispettivamente di proteine. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> Figura 2: Schema a stato solido che mostra HDX-MS (A) e PL-MS (B) per la proteina nella formulazione liofilizzata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Name of Material/ Equipment</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equine myoglobin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0630-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Photo-leucine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#22610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td >#DLM-4-PK</td>
			<td>Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilized pepsin</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >#2-3132-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td >#V511A</td>
			<td>Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water, Optima LC/MS grade</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >#7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-TOF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >#G1969-85000</td>
			<td>Highly flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25108/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptide microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25109/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >Zorbax 300SB-C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freeze dryer</td>
			<td>VirTis AdVantage Plus</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stratalinker equipped with five 365 nm lamps</td>
			<td>Stratagene Corp.</td>
			<td >Stratalinker 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >1200 series LC</td>
			<td>Refrigerated LC system for HDX-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-qTOF MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >6520 qTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HDExaminer (HDX-MS data analysis software)</td>
			<td >Sierra Analytics</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders

Amide idrogeno / scambio di deuterio (ssHDX-MS) e della catena laterale fotolitico etichettatura (SSPL-MS), seguita da spettrometria di massa possono essere utili per caratterizzare formulazioni liofilizzate di proteine ​​terapeutiche. Etichettatura seguita da adeguata digestione proteolitica permette la struttura delle proteine ​​e le interazioni da mappare con una risoluzione a livello di peptide. Poiché la proteina elementi strutturali sono stabilizzate da una rete di legami chimici dalle principali catene e catene laterali di aminoacidi, etichettatura specifica degli atomi nei residui amminoacidici permette di comprendere meglio la struttura e la conformazione della proteina. In contrasto con i metodi di routine utilizzati per studiare le proteine ​​in solidi liofilizzati (ad esempio, FTIR), ssHDX-MS e SSPL-MS fornisce informazioni quantitative e specifiche del sito. Il grado di incorporazione di deuterio e parametri cinetici può essere correlato a scambiare rapidamente e lentamente piscine ammide (N veloce, N lento) e riflette direttamente le degree di protein folding e struttura in formulazioni liofilizzati. Etichettatura fotolitico Stabile non subisce back-cambio, un vantaggio rispetto ssHDX-MS. Qui, forniamo protocolli dettagliati sia per ssHDX-MS e SSPL-MS, utilizzando mioglobina (Mb) come modello di proteine ​​in formulazioni liofilizzati contenenti sia trealosio o sorbitolo.

Qui, ssHDX-MS e SSPL-MS sono stati utilizzati per studiare l&#39;effetto degli eccipienti sulle interazioni di conformazione e dello stato solido di formazioni Mb liofilizzati. Le concentrazioni di proteine ​​e eccipienti utilizzati in questo studio sono riportati in Tabella 1. I risultati rappresentativi dall&#39;analisi ssHDX-MS e SSPL-MS di Mb liofilizzati ottenuti seguendo i protocolli di cui sopra sono presentate. Deuterio assorbimento a livello proteico intatto ssHDX-MS è in grado di distinguere tra le formulazioni Mb a livello intatto. Gli spettri di massa deconvoluto di Mb intatte seguito 144 ore di ssHDX da MBS formulazione ha mostrato maggiore assorbimento di deuterio di formulazione MbT (Figura 3A). In media, MBS ha mostrato il 46% maggiore assorbimento di deuterio di MbT (Tabella 2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; Figura 3: ssHDX-MS per Mb intatte: (A) deconvoluzione massa spettri Mb intatte deuterati da formulazioni MbT (linea continua) e MBS (linea tratteggiata) dopo 144 ore di ssHDX. Lo spettro di massa deconvoluto di Mb intatte undeuterated è anche mostrato (linea tratteggiata). (B) cinetica ssHDX per Mb intatti a formulazioni MbT (linea continua) e MBS (linea tratteggiata). La durata di ssHDX è stato montato ad un&#39;equazione a due fasi associazione esponenziale utilizzando software Graph Pad Prism versione 5 (n = 3, ± SD). La cinetica deuterazione per Mbs intatti e MBT sono simili in momenti iniziali (1-4 hr), ma MBS hanno mostrato un aumento di scambio di deuterio con aumento del tempo (8-144 ore) (Figura 3B). Ciò suggerisce l&#39;importanza di selezionare i punti di tempo più lungo per ssHDX a basse RH e temperatura condizioni. Inoltre, il processo di assorbimento e diffusione D 2 O può influenzare il tasso di ssHDX all&#39;epoca po precoceint. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che assorbimento di umidità in ssHDX è completa in un periodo di ore, e ha minimo contributo di scambiare cinetiche oltre questo tempo. Il tasso osservato e l&#39;estensione dello scambio, pertanto, non sono semplicemente misure di D 2 O adsorbimento 27,28. Le piccole barre di errore in Figura 3B, indicano le deviazioni standard di tre campioni ssHDX-MS indipendenti, mostrano che l&#39;esperimento è altamente riproducibile. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Deuterio assorbimento (%) b </td><td> N veloce c </td><td> k veloce c </td><td> N lento c </td><td> k lento c </td></tr><tr><td> MbT un </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0,43 (0,03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> Mbs un </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15,4 (0,7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % Variazione d </td><td> 46% </td><td> 18% </td><td> 14% </td><td> 75% </td><td> 26% </td></tr></tbody></table> Tabella 2:. Le misure quantitative di deuterio assorbimento negli studi ssHDX di formulazioni Mb per la composizione di una Vedi tabella 1 b percentuale di deuterio assorbimento rispetto al massimo teorico per Mb intatti dopo 144 ore di HDX a 5 ° C, 43% di umidità relativa (n = 3. , Parametri media ± SD). c determinati dalla regressione lineare dei dati cinetici ssHDX-MS. Naturalmente il tempo di cambio di deuterio per intatto Mb è stato montato su un modello di associazione biesponenziale (Eqn. 2). I valori tra parentesi sono errori standard dei parametri di regressione. Ð la variazione percentuale misurazioni erano calculATED come 100 x [(valore da MBS - valore da MBT) / (valore da MBT)]. I parametri di regressione (N veloce, lento N, k veloce e lento k) per la cinetica di assorbimento di deuterio MBT e Mbs sono riportati nella tabella 2. Anche se il N valori veloci e N lenti sono più grandi di MBS di MBT, le differenze di N lento valori erano superiori alle differenze nei valori veloci N. In particolare, il valore veloce N è solo il 18% più grande in MB che in MbT, mentre il valore lento N è il 75% più grande in MB che in MBT. Questo suggerisce che i più piccoli N valori lenti a MbT può essere dovuto alla maggiore ritenzione di struttura di Mb o di protezione di gruppi ammidici da eccipienti che sono esposti a D 2 O in MB. Tuttavia, i meccanismi dettagliati non sono ancora chiaramente definiti. Le costanti di velocità (K veloce e K lento) per entrambe le formulazioni sono molto simili. deuterio assorbimento a livello peptide Dopo digestione con pepsina, un totale di 52 peptidi sono stati identificati. Sei frammenti non ridondanti corrispondenti al 100% della sequenza Mb sono stati utilizzati per l&#39;analisi qui riportato. Ulteriori informazioni possono essere ottenute utilizzando frammenti sovrapposti, come riportato dal nostro gruppo in precedenza 24. L&#39;assorbimento percentuale di deuterio per ciascun peptide è stato calcolato e i risultati di 144 campioni hr tracciata (Figura 4A). Cinetica HDX per i sei frammenti peptiche hanno mostrato comportamenti biesponenziale (Figura 4B), in linea con sottopopolazioni di idrogeno amidici sottoposti &quot;veloce&quot; e &quot;lento&quot; scambio. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> Figura 4: ssHDX-MS per Mb a livello peptide: (A) uptake Percent deuterio per 6 non reduframmenti peptica ndant di Mb in formulazioni MbT (grigio) e Mbs (bianco) dopo 144 ore di HDX. cinetica (B) ssHDX per sei frammenti peptiche non ridondanti di Mb in formulazioni MbT (linea continua) e MBS (linea tratteggiata). La durata di ssHDX è stato montato ad un&#39;equazione a due fasi associazione esponenziale utilizzando software Graph Pad Prism versione 5 (n = 3, ± SD). Parametri di regressione per i peptidi non ridondanti sono presentati nella Figura 5. Come le costanti di velocità a muro per frammenti peptidici non sono la costante tasso medio per i singoli amidi, le costanti di velocità osservati per i frammenti peptica non possono essere linearmente correlati a quelli per la proteina intatto. I N valori veloci per la maggior parte dei frammenti peptica (tranne frammento 56-69) in formulazioni MBS sono leggermente superiori a quelli ottenuti MbT (Figura 5A). Allo stesso modo, i valori veloci k generalmente mostrato poca differenza tra formulations e in diverse regioni della molecola Mb (Figura 5B). Tuttavia, i valori N lenta lenta e K per MBS sono significativamente maggiore in tutti i frammenti che per MbT (Figura 5C e 5D). Il notevole incremento in N k lento e lento per Mbs può riflettere una maggiore mobilità di gruppi ammidici nelle &quot;lenti&quot; piscine scambio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> Figura 5: parametri cinetici ssHDX per Mb peptidi peptica: N veloce (A), k veloce (B), N lento (C) e k valori lento (D) ottenuti dalla regressione lineare dei dati cinetici ssHDX-MS per sei peptidi peptica non ridondanti di Mb in formulazioni MbT (grigio) e MBS ( bianco) (n = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; Etichettatura fotolitica a livello proteico intatto Mb irradiato in presenza di eccesso 20x pLeu formata multipli Mb-pLeu addotti, come rilevato da LC-MS (Figura 6A). Gli spettri deconvoluzione per MbT irradiato per 40 min con 20x pLeu ha mostrato fino a 3 etichette con l&#39;aggiunta di 115, 230 e 345 Da alla massa di Mb senza etichetta. Mbs irradiati simile con 20x pLeu mostrato meno pLeu assorbimento a livello intatto, con un massimo di 2 popolazioni etichettati rilevati da LC-MS. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> Figura 6: SSPL-MS per Mb intatte: (A) deconvoluzione spettri di massa per MbT (linea continua) e MBS (linea tratteggiata) etichettati con 20x eccesso (5% w / w) pLeu. Spettro di massa deconvoluto nativo Mb (Mb liofilizzata e irradiata in assenza di pLeu) è indicata come la linea tratteggiata. U </em&gt; indica una popolazione di proteine ​​che rimane senza etichetta dopo l&#39;irradiazione. Le popolazioni di proteine ​​che trasportano 1, 2 e 3 etichette pLeu sono rappresentati come 1L, 2L e 3L rispettivamente. cinetica (B) SSPL-MS per Mb intatti a formulazioni MbT (circoli chiusi) e MBS (cerchi aperti) in funzione della concentrazione pLeu. Tutti i campioni sono stati irradiati per 40 min. Le barre di errore sono all&#39;interno dei simboli. (C) cinetica SSPL-MS per Mb intatti a formulazioni MbT (circoli chiusi) e MBS (cerchi aperti) liofilizzati e irradiate in presenza di 100x eccesso pLeu (20,7% w / w) in funzione del tempo di irradiazione. Le barre di errore sono all&#39;interno dei simboli. In studi cinetici, la percentuale di proteina marcata aumentato esponenzialmente sia MbT e MBS all&#39;aumentare del tempo di irraggiamento (Figura 6B). Mbs mostrato meno assorbimento pLeu di MbT in ogni tempo di irradiazione. Entrambe le formulazioni sembravano raggiungere un plateau a 40 min. Così, uno studio cinetico può essere noi<html> eful per determinare la durata di irradiazione necessaria per ottenere la completa attivazione pLeu. Cinetiche etichettatura sono stati studiati come funzione della concentrazione pLeu (figura 6C). La percentuale di proteina marcata è aumentato con la concentrazione pLeu sia MbT e Mbs. Tuttavia, al 20,7% w / w pLeu, MbT mostrato una diminuzione pLeu assorbimento. Questo può essere dovuto ad esclusione pLeu dalla superficie della proteina ad alta concentrazione pLeu. Quindi, uno studio con vari concentrazione di pLeu deve essere eseguita per selezionare la concentrazione pLeu appropriato che consenta la un&#39;etichettatura adeguata sulla superficie proteica senza esclusione di superficie. In questo studio, 20x eccesso pLeu stato selezionato per ulteriori studi di livello peptide. La complessiva diminuzione etichettatura osservato per MBS suggerisce poveri della catena laterale accessibilità alla matrice contenente pLeu. Questo è coerente con un cambiamento conformazionale in presenza di sorbitolo che provoca etichettatura ridotta. content &quot;&gt; etichettatura fotolitica a livello peptide Sulla base degli studi in materia di etichettatura di proteine ​​intatte, 20x eccesso pLeu è stato scelto per confrontare MbT e Mbs a livello peptide. Campioni marcati sono stati digeriti con tripsina e analizzati da LC-MS. Un totale di 40 peptidi corrispondenti al 100% della sequenza Mb stati rilevati per MBT e Mbs campioni. In alcuni casi, la digestione con tripsina può fornire una copertura limitata sequenza proteica se Lys e / o Arg residui sono fortemente etichettati. Per migliorare la copertura sequenza, una miscela di tripsina e chimotripsina può essere utilizzato per digerire la proteina marcata. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> Figura 7: SSPL-MS per Mb a livello peptide: Rappresentazione fumetto di Mb etichettato con 20x eccesso pLeu (5% w / w) in presenza di trealosio (A) e sorbitolo (B). La proteina marcata è stato digerito con trypsin e peptidi marcati sono stati mappati al struttura cristallina di Mb (PDB ID 1WLA). Le regioni etichettati e senza etichetta sono di colore magenta e verde, rispettivamente. SSPL-MS con digestione tripsina fornisce informazioni qualitative sui peptidi di essere etichettati. Date le diverse popolazioni etichettati a livello intatto, il meccanismo promiscua di etichettatura pLeu e le differenze di efficienza di ionizzazione di peptidi etichettati e senza etichetta, è difficile ottenere metriche quantitative per SSPL-MS dopo la digestione. Tuttavia, le informazioni qualitative può ancora fornire una conoscenza proteiche cambiamenti conformazionali a livello peptide. In questo studio, sia MBT e Mbs formulazioni mostrato pLeu assorbimento attraverso la maggior parte della superficie proteica. Rispetto a Mbs, frammenti peptidici 32-42, 134-139 e 146-153 da MBT mostrato etichettatura pLeu (Figura 7). Questo suggerisce che le catene laterali di questi aminoacidi sono esposti a pLeu, come le eliche in questi regions sono intatte nella matrice MBT. Al contrario, la protezione da etichettatura pLeu nella matrice MBS è coerente con perturbazioni strutturali in queste regioni. Nel complesso, i risultati di ssHDX-MS e SSPL-MS suggeriscono che i metodi in grado di fornire informazioni complementari ad alta risoluzione a livello di peptide su backbone (ssHDX-MS) e della catena laterale (SSPL-MS) di esposizione e di eccipiente effetti in formulazioni proteiche liofilizzati .

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

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15.6K Views.  Purdue University. Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design. 

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Un metodo di cromatografia a gas pirolisi a due fasi con rilevamento spettrometrico di massa per l'identificazione di ingredienti di inchiostro del tatuaggio e prodotti contraffatti

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Indagine spettrometrica di massa sfaccettata di neuropeptidi in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Estrazione di aminoacidi non proteici da cianobatteri per cromatografia liquida-analisi di spettrometria di massa tandem

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed using bead-based proteolysis prior to proteotypic peptide affinity-capture and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) determination. The procedure can be applied to both conventional dried samples using paper cards (e.g., dried blood spots [DBSs] and dried serum spots [DSSs]), as well as samples collected with newer sampling methods such as volumetric absorptive microsampling (VAMS). In addition to describing this procedure, the preparation of both trypsin beads and antibody-coated beads is presented in a step-by-step manner in this work. The advantages of the presented procedure are time-efficient proteolysis using beads and selective robust cleanup using peptide affinity-capture. The current procedure describes the determination of the low-abundance small-cell lung cancer (SCLC) biomarker, progastrin-releasing peptide (ProGRP), in dried serum (both DSSs and VAMS). Detailed procedures for bead preparation make it easier to implement the workflow in new applications or other laboratories. It is demonstrated that the results may be dependent on the sampling material; for the present project, higher signal intensities were seen for samples collected using VAMS compared to DSSs.

A protocol is presented for the determination of low-abundance biomarkers from dried serum samples exemplified with the biomarker progastrin-releasing peptide (ProGRP). Antibody-coated magnetic beads are used for the selective cleanup and enrichment of a proteotypic ProGRP peptide. The captured peptide is subsequently analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed ...