This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato Thomas Jefferson University cura degli animali istituzionale e l&#39;uso e condotto in conformità con la Comunità europee la direttiva (2010/63 / UE, 86/609 / CEE e 87-848 / CEE), la Guida NIH per il la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, e la Società per le Politiche di Neuroscienze sull&#39;uso degli animali in Neuroscience Research. 1. potenziali d&#39;azione composto muscolare (CMAPs) <ol><li> Preparare l&#39;animale: <ol><li> Anestetizzare il topo con un inalante (isoflurano) al 1-2% consegnato a effetto o per iniezione (ketamina, xilazina, acepromazina). Dosaggio di anestesia iniettabile è la seguente: 95,0 mg / kg di ketamina, 10,0 mg / kg di xylazina, 0,075 mg / kg di acepromazina. NOTA: Usiamo successo sia inalanti e anestetico iniettabile approcci per lo svolgimento di questo protocollo di registrazione CMAP, senza preferenze. </li><li> L&#39;animale deve essere mantenuto ad una appropriataprofondità nesthetic prima dell&#39;intervento è stato avviato, attraverso la conclusione di un intervento chirurgico, e fino a quando la buprenorfina post-operatorio ha preso effetto. Verificare il corretto anestesia da breve pizzico piedi per determinare che una risposta ritiro non è suscitato. Inoltre, verificare il riflesso corneale con un batuffolo di cotone. Durante tutta la procedura chirurgica, stabilire che la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria non sono aumentati, il che suggerisce che la profondità dell&#39;anestesia è diventato troppo leggero. </li><li> Applicare una pomata veterinario sugli occhi dell&#39;animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Il chirurgo dovrebbe lavare il suo / le mani con un disinfettante (clorexidina scrub) prima di iniziare l&#39;intervento chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti sterili, maschera e abito o camice da laboratorio pulito. Tutti gli strumenti devono essere lavati e sterilizzati in autoclave prima dell&#39;intervento chirurgico. Aggiungere una striscia indicatrice sterilizzazione all&#39;interno del kit strumento prima autoclave a livello degli strumenti per verificare che la sterilizzazione è stata completata. Il chirurgo dovrebbeverificare che l&#39;intera linea sulla striscia è nero prima di iniziare un intervento chirurgico. Nastro l&#39;esterno della scatola con indicazione nastro autoclave pure. Se la chirurgia deve essere eseguita su più animali nello stesso giorno, pulire gli strumenti tra ambulatori e sterilizzare in uno sterilizzatore perle di vetro. Se necessario, sterilizzare entrambe le estremità dello strumento nello sterilizzatore perle di vetro posizionando il manico dello strumento nello sterilizzatore per il tempo necessario, rimuovendo lo strumento con una pinza emostatica sterile, raffreddamento in un campo sterile e poi mettendo fine funzionale lo strumento nello sterilizzatore perle di vetro per il periodo di tempo appropriato. </li><li> Una volta che animale è anestetizzato, posto a bordo chirurgica con superficie dorsale verso il basso e l&#39;addome rivolto verso l&#39;alto in modo che il nastro può essere usato per proteggere arti anteriori dell&#39;animale a bordo chirurgico. </li><li> Radere ventrale caudale superficie a partire dalla base del cranio, e assicurarsi che l&#39;area intorno addome su entrambi i lati della linea mediana è shAVED a seconda di quale si sta registrando emi-diaframma. Applicare povidone-iodio alla superficie della pelle rasata. </li></ol></li><li> Preparazione per le registrazioni CMAP: <ol><li> Dopo la preparazione degli animali, posto elettrodo di massa per via sottocutanea in coda (Figura 1). </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di riferimento per via sottocutanea nella regione controlaterale addominale inferiore. </li><li> Posizionare gel conduttivo sulla striscia superficie autoadesiva o elettrodo di registrazione del disco (dimensioni di superficie a striscia: 0,5 x 3 cm), e quindi inserire elettrodi di superficie trasversalmente lungo il margine costale unilaterale. </li><li> Posizionare elettrodi stimolatori transcutanea 0,5 centimetri a parte laterale di trachea e superiori alla clavicola. Inserire gli elettrodi di circa 1,0 centimetri di profondità attraverso la pelle. Fissare gli elettrodi a mano in modo che la loro posizione non si muove con stimolazioni successive. NOTA: Angolo elettrodi stimolanti 90 ° rispetto alla pelle nel sito di insertion. </li></ol></li><li> Compound azione muscolare potenziali (CMAP) registrazioni: <ol><li> Ottenere registrazioni elettrofisiologiche utilizzando uno stimolatore / amplificatore seguita da computer assisted analisi dei dati. </li><li> I parametri di stimolazione stimolo unico tiro dovrebbe essere di 0,5 msec, legumi sopramassimali 1.0 Hz. L&#39;ampiezza dello stimolo deve essere compreso tra 6.0 e 8.0 V (Figura 2A). NOTA: In un esperimento, utilizzare una intensità dello stimolo con la stessa ampiezza di tutti gli animali. L&#39;obiettivo è quello di massimizzare l&#39;ampiezza di risposta utilizzando l&#39;ampiezza minima della stimolazione. È importante notare che la risposta iniziale che si verifica al momento della stimolazione è un artefatto di stimolazione. Inoltre, occorre prestare attenzione per ottenere una risposta CMAP che è preceduta da un / linea di base piatta stabile dopo l&#39;artefatto di stimolazione, che è poi seguita dalla risposta CMAP rapida. Per ottenere tale risposta, può essere necessario riposizionare la stimolazione e / oelettrodi di registrazione. </li><li> Aspetta 30 secondi tra le stimolazioni, e ripetere 10 stimolazioni in fila per ottenere la risposta media (Figura 2B - C). Misurare l&#39;ampiezza dal basale al picco (Figura 2A). Condurre la stimolazione del nervo frenico durante la fase del ciclo respiratorio degli animali, quando il nervo frenico / diaframma non è attivato. La procedura può essere ripetuta sulla stessa animale per l&#39;emi-membrana controlaterale. </li><li> Dopo la sessione di registrazione CMAP finale, profumato l&#39;animale se sarà condotta NMJ colorazione. Condurre registrazioni CMAP più volte sullo stesso animale circa una volta alla settimana (o intervallo di scelta). </li><li> A seguito di sopravvivenza CMAP registrazioni, permettono all&#39;animale di recuperare su una piastra elettrica acqua calda in circolo, e continuamente monitorare durante il recupero fino recumbent sveglio e sternally. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. &lt;/ Li&gt; <li> Una volta sternally recumbent, monitorare l&#39;animale ogni 12 ore per le prime 48 ore (una volta al giorno in seguito). Se l&#39;animale sembra essere disidratata (pelle flaccida, svogliatezza), somministrare liquidi (soluzione Ringer lattato, per via sottocutanea, 1-2 ml per iniezione, con i siti ruotate, 2 volte al giorno) fino a peso post-chirurgica e perdita di liquidi stabilizza. Fornire animali cibo ammorbidito in piccoli piatti durante il periodo post-operatorio acuta, se necessario, per incoraggiare a mangiare se non possono raggiungere il caricatore coperchio filo. </li><li> Somministrare buprenorfina alla dose di 0.05 mg / kg prima della fine della chirurgia e quindi a intervalli di 12 h per le prime 24 ore (e subordinato segni di dolore / sollecitazioni in seguito) per via sottocutanea (sito ruotato). Se i segni di dolore o disagio si notano dopo, trattare gli animali con buprenorfina. I segni indicativi di dolore / sofferenza sono la mancanza di attività, vocalizzazioni, la mancanza di mangiare o bere (disidratazione), perdita di peso eccessivo, guardia, excessive rosicchiare o graffi sul sito di incisione. Ulteriori criteri utilizzati per la determinazione del dolore e angoscia comprendono insensibilità agli stimoli estranei, vocalizzazione transitoria o immotivata, respiro affannoso o anormale, scarico naso-occular persistente rosso-bruno, segnato piloerezione. Monitorare anche la prova di scarsa igiene che suggerirebbe animali malati. Se animale si osserva ancora essere in difficoltà dopo 72 ore di trattamento (secondo i criteri dolore / sollecitazione delineare sopra, e dopo aver ricevuto il protocollo analgesico descritto sopra) eutanasia dell&#39;animale. </li></ol></li></ol> 2. Diaframma Giunzione neuromuscolare (NMJ) Analisi <ol><li> Dissezione degli animali: <ol><li> Somministrare l&#39;animale un sovradosaggio di anestesia iniettabile (3 volte dose utilizzata sopra: Ketamina a 285.0 mg / kg, xilazina a 30,0 mg / kg, acepromazine a 0,225 mg / kg; somministrato per via intraperitoneale). In caso di sovradosaggio, tutti gli animali devono avere un secondo metodo di eutanasia (toracotomia) to assicurare la morte. La morte deve essere confermata osservando arresto cardiaco e respiratorio e rilevando pupille fisse e dilatate degli animali. </li><li> Condurre una laparotomia con bisturi o dissezione forbici estendere l&#39;escissione dal processo zyphoid caudalmente lungo la linea mediana. Separare con cura la pelle e il tessuto connettivo dal muscolo sottostante usando bisturi e pinze. </li><li> Tirando sul processo zyphoid, usare le forbici dissezione per rimuovere tutto il diaframma, in modo che il diaframma rimane attaccato all&#39;osso circostante. Questo è importante in quanto impedisce danni al muscolo diaframma, consentirà di successo dissezione dell&#39;intero diaframma e sarà di aiuto nel muscolo pulizia per la successiva colorazione. NOTA: A questo punto, animale può essere irrorato se necessario. </li></ol></li><li> Pulizia e colorazione del diaframma: <ol><li> Definire con precisione l&#39;intera sezionato diaframma, la superficie superiore rivolta verso l&#39;alto, alla gomma di silicone in un piatto di vetro 100 millimetri Petri4% paraformaldeide (made in 1% tampone fosfato - PBS) per 20 minuti usando uno stereomicroscopio. Allungare il diaframma per renderla tesa, e con perni di insetti, fissare il tessuto circostante per evitare pinning diaframma muscolo stesso (Figura 3). </li><li> Pulire accuratamente fuori del tessuto connettivo da solo la superficie superiore del muscolo con # 5 pinze e forbici piccole. NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questo protocollo di colorazione lentamente a dondolo a temperatura ambiente coperto dalla luce, se non diversamente specificato. Assicurarsi che il muscolo diaframma è sempre completamente immerso in liquido per evitare l&#39;essiccamento fuori. </li><li> Prima della colorazione, preparare tutti i reagenti necessari: 1x PBS, 2% siero bovino albumina (BSA) / PBS, 0,1 M glicina realizzato in 2% BSA / PBS, 4% paraformaldeide (PFA) in 1x PBS, e lo 0,2% TBP (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Assicurati di pre-cool metanolo a -20 ° C. </li><li> Lavare 3x per 10 min in 1x PBS. </li><li> Incubare a 0,1 M glicina (made in 2% BSA / PBS) per 30 min. </li><li> Incubare in soluzione RBTX (rodamina coniugata α-bungarotossina) per 15 minuti. Soluzione per RBTX è la seguente: Rodamina-coniugato alpha bungarotoxin 1: 400 in PBS 1x diluizione. NOTA: In questo protocollo, Rodamina viene utilizzato, ma qualsiasi fluoroforo di scelta può essere utilizzato per la colorazione. </li><li> Lavare 3x per 10 min in 1x PBS. </li><li> In -20 ° C freezer, incubare con MeOH per 5 min. NOTA: Non aggiungere MeOH prima di mettere muscolo nel congelatore, e rimuovere immediatamente soluzione dopo il periodo di incubazione. </li><li> Lavare 3x per 10 min in 1x PBS. </li><li> Blocco in 0,2% TBP per 1 ora (0,2% Triton fatta in 2% BSA / PBS). </li><li> Incubare con soluzione di anticorpo primario (in 0,2% TBP) a 4 ° C per una notte, mentre a dondolo. Le diluizioni di anticorpi come segue: SV2 (1,10) e SMI-312 (1: 1.000). </li><li> Lavare 3x per 10 minuti con 0,2% TBP. </li><li> Incubare con anticorpo secondario con diluizione 1: 100 di FGM1 (capra coniugato con FITC anti-topo IgG1; made in 0,2% TBP), mentre a dondolo per 1 ora. NOTA: Proteggere dalla luce per il resto del protocollo per la colorazione. </li><li> Lavare 3x per 10 minuti con PBS 1x. </li><li> Re-pulito circostante tessuto connettivo sul superiore (vedi sopra) la superficie del muscolo prima del montaggio e dei vetrini. NOTA: si consiglia di pulire e poi montare campione immediatamente dopo la colorazione. Tuttavia, se necessario, il campione può essere coperto in 1x PBS, avvolto in parafilm per evitare l&#39;evaporazione e conservati a 4 ° C per 1 settimana, con cambio di PBS al giorno. </li><li> Dopo il montaggio su vetrino, con coprioggetto non hardset Vectashield. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per evitare che si secchi. Conservare i vetrini distesa piatta in cartelle di diapositive di cartone a -20 ° C per il lungo termine. </li></ol></li><li> Analisi e Confocale Imaging: <ol><li> Quantitativamente analizzare la morfologia del macchiati e montati emi-diaframma sotto 20X e 40X con lo zoom con un epifluorescenza rettomicroscopio. Nota: Poiché il diaframma è macchiato e analizzata in modo tutto il montaggio, il muscolo è piuttosto denso. Di conseguenza, la maggior parte della colorazione a fluorescenza è completamente fuori fuoco quando un&#39;immagine statica viene presa utilizzando microscopia a fluorescenza non confocale. Per questo motivo, si consiglia di effettuare l&#39;analisi NMJ in tempo reale sul microscopio come questo consente di concentrarsi costantemente &quot;up&quot; e &quot;down&quot; attraverso il muscolo per identificare correttamente la morfologia di ciascuno dei singoli NMJs. Usando questo approccio, si può facilmente seguire la traiettoria dei singoli assoni motori mentre si muovono attraverso il tessuto in relazione spaziale ai cluster recettori post-sinaptici. </li><li> Misurando la lunghezza ventrale-to-dorsale del muscolo, dividere il muscolo in 3 sezioni separate per analisi basate su modelli di innervazione topografiche di specifici livelli del midollo spinale (Figura 4H). </li><li> Iniziando la regione ventrale del muscolo e MOVing dorsale, analizzare tutte en NMJs faccia situati sulla superficie delle fibre muscolari. Non analizzare fibre muscolari più profonde delle prime 3-4 fibre dalla superficie come interpretazione può essere difficile a causa della minore penetrazione anticorpo (RBTX penetra molto più profondo nel muscolo a causa delle piccole dimensioni della tossina rispetto agli anticorpi grandi utilizzati per etichettare neuroni). </li><li> Identificare ogni NMJ intatto se l&#39;assone pre-terminale del neurone è spessa di diametro e tutte le regioni del terminale nervoso completamente sovrappongono con i recettori dei muscoli sottostanti (AChR). </li><li> Identificare ogni NMJ parzialmente denervato se una regione delle AChRs muscolari sottostanti è occupato con corrispondente terminale nervoso. </li><li> Identificare ogni NMJ come completamente denervato se i AChRs muscolari non hanno alcun corrispondente terminale nervoso (è anche importante avere altri NMJs con neuroni marcati nello stesso campo di messa a fuoco, in modo che si può essere sicuri che la mancanza di terminale nervoso non è semplicemente dovuto al caccar penetrazione anticorpi in quella regione del muscolo). </li><li> Identificare ogni NMJ come moltiplicare innervato se non vi è più di un pre-terminale assone innervano un individuo NMJ (questo indica che c&#39;è stata un certo livello di denervazione e probabili tentativi di reinnervazione a questo incrocio). </li><li> Identificare ogni NMJ più sottile innervato se il NMJ ha piena sovrapposizione tra terminale nervoso e AChRs sottostanti, ma ha un assone pre-terminale sottile (anche questo è indicativo di un certo livello di denervazione e tentativi di reinnervazione). </li><li> Condurre analisi per ciascuna delle 3 regioni identificate per tutte le categorie NMJ precedenti per ogni animale. La media dei dati da ogni animale con i risultati di altri animali dello stesso gruppo sperimentale. Circa 200-300 giunzioni nel ratto emi-membrana muscolare e 150-200 nel topo emi-diaframma devono essere quantificati in almeno 3 (preferibilmente 5-6 o più) animali per gruppo sperimentale. </li><li> Ottenere immagini ad alta risoluzione confocale, usod per la pubblicazione, con un microscopio confocale. </li><li> Ottenere Z-stack a 0.3 micron dimensioni passo per 20-40 micron profondità, e raccogliere ulteriori sezioni ottiche sopra e sotto ogni giunzione per assicurare che l&#39;intero profilo sinaptica è inclusa. </li><li> Utilizzare il software di acquisizione di ricostruire immagini serie Z in proiezioni di massima intensità. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+parameter:+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+(an+evidence-based+review):+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology:+ALS+Practice+Parameters+Task+Force.">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li><li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection.">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li><li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li><li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spinal Cord Injury. , (2010).</li><li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions.">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li><li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration,+plasticity+and+adaptation.">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li><li>Gour&#233;vitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preB&#246;tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat.">The preB&#246;tzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li><li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury.">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li><li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats.">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li><li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury.">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li><li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung.">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li><li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice.">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS.">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Dato che la funzione respiratoria è compromessa sia traumatico SIC e la SLA, lo sviluppo di terapie che hanno come target la respirazione e, in particolare innervazione diaframma sono clinicamente rilevante 5,6. Per studiare completo la funzione respiratoria, deve essere utilizzato un metodo di approccio combinato. CMAPs misurano il grado di innervazione funzionale del diaframma mediante stimolazione del nervo frenico esterno, ma drive respiratorio bulbospinal non endogena 8. Inoltre, queste regis...

Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia debilitante motoneurone associata con la perdita di entrambi i neuroni motori superiori ed inferiori e la conseguente paralisi muscolare. Dopo la diagnosi, la sopravvivenza del paziente è in media di soli 2-5 anni 1. Frenico motoneurone (PhMN) perdita è una componente fondamentale della patogenesi della SLA. I pazienti in ultima analisi, muoiono a causa della perdita di PhMN innervazione del diaframma, il muscolo principale di ispirazione 2,3. Traumatica lesioni del midollo spinale (SCI) è anche un problema serio con difficoltà respiratorie associate. Circa 12.000 nuovi casi di SCI si verificano ogni anno 4 a causa di danni traumatici al midollo spinale. Nonostante l&#39;eterogeneità della malattia rispetto posizione, il tipo e la gravità, la maggior parte dei casi SCI comporta traumi al midollo spinale cervicale, che si traduce spesso in compromissione respiratoria debilitante e persistente. Oltre a ALS e SCI, altro sistema nervoso centrale (CNS) malattie può essere associato wesimo disfunzione respiratoria diaframmatica 5,6. Il nervo frenico è un nervo motore efferente che innerva la emi-diaframma omolaterale e che proviene da corpi cellulari PhMN situati nei livelli C3-C5 della omolaterale midollo spinale cervicale. Uscita PhMN è controllato scendendo ingresso bulbospinal dal tronco cerebrale in una zona conosciuta come il gruppo rostrale ventrale respiratorio (rVRG) 7. Il circuito rVRG-PhMN diaframma è centrale per il controllo della respirazione inspiratori, così come altri comportamenti diaframma non ventilatorio. Varie lesioni traumatiche e malattie neurodegenerative che colpiscono questo circuito può portare a un profondo declino della funzione respiratoria e la qualità della vita del paziente. Scendendo ingresso PhMNs dalla sopravvivenza rVRG, PhMN, integrità nervo frenico e corretta innervazione a livello della giunzione neuromuscolare diaframma (NMJ) sono tutti necessari per il funzionamento della membrana normale. È quindi importante utilizzare tecniche chepuò quantitativamente valutare questo circuito in vivo in modelli di roditori di SLA, SCI e altre malattie del sistema nervoso centrale. Con questo protocollo, l&#39;obiettivo è quello di descrivere strumenti sperimentali per la valutazione PhMN innervazione del diaframma sia a elettrofisiologico e livello morfologico. Potenziali d&#39;azione muscolare composto (CMAPs) sono registrati stimolando tutti gli assoni dei motoneuroni efferente di un dato nervo motore e poi analizzando la risposta di depolarizzazione suscitato delle miofibre bersaglio. Questa tecnica può essere utilizzata in vivo in ratti e topi anestetizzati per quantificare innervazione funzionale della emi-diaframma PhMNs 8. A causa del fatto che CMAPs rappresentano la registrazione simultanea di tutti (o almeno molti / maggior parte) myofibers dell&#39;intero emi-membrana, è utile esaminare anche i fenotipi dei singoli motori assoni e miofibre al NMJ diaframma per monitorare malattie - e la terapia rilevanti cambiamenti morfologici, come parziale e complete denervazione, germinazione rigenerativa e reinnervazione. Questo può essere ottenuto tramite tutto il montaggio immunoistochimica (IHC) del diaframma, seguita da valutazione dettagliata morfologica delle singole NMJs tutto muscolo 9. Combinando CMAPs e analisi NMJ fornisce un approccio efficace per studiare quantitativamente innervazione diaframmatica in modelli di roditori di malattia SNC e SNP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Adulti Sprague-Dawley ricevuto o laminectomia solo (controllo illeso) o unilaterale emi-contusione SCI a livello del midollo spinale C4 10-12. A 5 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico, picco CMAP ampiezza registrato dalla emi-diaframma omolaterale al sito laminectomia / ferita era significativamente ridotta a SCI ratti (Figura 2C), rispetto a solo il laminectomia-controllo (Figura 2B). Tutti NMJs nella emi-diaframma erano completamente intatto nel controllo non malati w...

Watch this Scientific Journal Video about Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons at JoVE.com

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funzionale e morfologica Valutazione della membrana innervazione da Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K Views.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

Video: Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Ricerca

Neuroscienze

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Ticare i neuroni simpatici dei ratti da Ganglia cervicale superiore embrionale per l'analisi morfologica e proteomica

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Isolamento funzionale di unità motorie singole del muscolo gastrocnomio mediale del ratto

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...