Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Tutti i topi sono stati alloggiati, mantenute e eutanasia secondo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida e sotto la supervisione dell &#39;Università di Chicago Resource Center animale. 1. Gli animali Preparazione di studi sperimentali <ol><li> Consentire agli animali di acclimatarsi a nuove abitazioni e ambiente, per recuperare da potenziali effetti fisiologici di trasporto e movimentazione. Nota: La seguente tecnica è applicabile a tutti i ceppi di topi disponibili in commercio. Il numero di animali da utilizzare per un esperimento dipende dal disegno dello studio e dovrebbe essere fatto con la consultazione da un esperto di statistica. </li></ol> 2. Identificazione e isolamento di peritoneale Fat Depositi. <ol><li> L&#39;eutanasia degli animali tramite CO 2 overdose e un metodo fisico secondario per confermare la morte. </li><li> Come la raccolta depositi di grasso peritoneale costituisce la rimozione degli organi interni (metodo secondaria), make un&#39;incisione mediana vicino alle papille inguinale attraverso la parete peritoneale per esporre gli organi interni (Figura 1A). </li><li> Per il omentale Grasso (OM), esporre il complesso omentale / pancreas, estendendo la milza dalla cavità peritoneale con una pinza (Figura 1C). Rilasciare omento dal pancreas e la milza strettamente rifilatura tutte le connessioni dei tessuti. Assicurarsi che ogni tessuto pancreatico residuo viene asportato 4. </li><li> Per il gonadica Grasso (GF), utilizzare pinze per sollevare il grasso gonadica circonda le ovaie e accise tagliando le connessioni dei tessuti (Figura 1A superiore de stra) 4. </li><li> Per il uterino Grasso (UF), utilizzare pinze per sollevare il grasso uterino che circonda le corna uterine e accise tagliando le connessioni dei tessuti (Figura 1A in basso a destra) 4. </li><li> Per la mesenterica Fat (MF), tagliare la giunzione tra l&#39;intestino tenue e il piloro. Utilizzare pinze per afferrare saldamente l&#39;estremità liberatenue, e lentamente &quot;buccia&quot; lontano dal grasso mesenterico. Rilasciare il grasso mesenterico dalla radice mesenterica con le forbici dissezione (Figura 1A in basso a sinistra) 4. </li><li> Per la Splenoportal Fat (SF), sollevare l&#39;estremità distale della milza con pinze per esporre la banda di tessuto adiposo sottile collegamento all&#39;ilo della milza al pancreas. Asportare il grasso splenoportal dapprima svincolandola dal pancreas, e poi accuratamente analizzarlo dalla milza (Figura 1B) 4. </li></ol> 3. Lattea Spot Identificazione Utilizzando Giemsa <ol><li> Excise omenta (fare riferimento al punto 2.3) da topi C57BL / 6 e fissare in 5% formalina tamponata neutra a 4 ° C per 16 ore (O / N). </li><li> Per inclusione in paraffina tessuto fissa, scegliere uno stampo che è appropriato per la dimensione del tessuto. Versare paraffina fusa dal serbatoio di paraffina per riempire lo stampo. Aprire la cassetta e utilizzando caldo perfunghi porcini, trasferire il tessuto nello stampo. <ol><li> Orientare con attenzione i tessuti durante l&#39;incorporamento paraffina per la produzione di sezioni longitudinali. Posizionare la cassetta tessuto etichetta sopra la modanatura e premere saldamente in posizione. Lasciare lo stampo raffreddare per almeno 30 minuti. </li></ol></li><li> Tagliare sezioni seriali (4 micron di spessore) dalla paraffina fissati in formalina (FFPE) blocco del tessuto incorporato. Posizionare un vetrino predepurata sotto sezioni come il nastro di tessuto viene fuori il blocco di paraffina. </li><li> In serie sezione tutta omento; raccogliere e macchiare ogni terza sezione per Giemsa (vedi 3.6). Lasciare che il vetrino con le sezioni di aria secca, preferibilmente O / N a temperatura ambiente. Diapositive secchi sono pronti per il fissaggio. Colorare la prima sezione per ematossilina eosina per paragoni con vetrini colorati Giemsa. </li><li> Deparaffinare i vetrini da due sequenziali 5 min incubazione in xileni. Reidratare diapositive da due incubazioni sequenziali nel seguente: etanolo 100%, 95% etanolo e infine toccare water. <ol><li> Prendere precauzioni adeguate per evitare le diapositive si asciughi. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Completamente immergere i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 5% soluzione Giemsa (w / v preparata in acqua di rubinetto) e incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto per 60 secondi, asciugare e montare con coprioggetto utilizzando supporti di montaggio. </li><li> Immagine dei vetrini colorati con uno scanner diapositive intero e di processo con il software del produttore. Quantificare il volume posto lattiginoso in sezioni omentali Giemsa-macchiati utilizzando il software ImageJ 4. </li></ol> 4. Propagazione e preparazione di cellule di cancro ovarico in vivo e ex vivo Studi <ol><li> Pre-caldo 15 ml di terreno di coltura delle cellule a 37 ° C in un bagno di calore. Preparare un tessuto pallone di coltura di dimensioni appropriate (ad esempio, 75 centimetri zona 2 di superficie), mediante l&#39;etichettatura con il nome di linea cellulare, il numero di passaggio, data e persona che ha preparato il brodo congelato, e la datae persona che è lo scongelamento / placcatura le cellule. Nota: Negli studi di metastasi tali informazioni dettagliate è di fondamentale importanza, come la data di congelamento giù e il numero di passaggio può influenzare il fenotipo metastatico. </li><li> Utilizzando l&#39;ambiente sterile della cappa biologica, pipetta 10 ml di terreno nel pallone T-75 cultura. Rimuovere una fiala di cellule del sistema azoto liquido e controllare l&#39;etichetta per confermare il tipo di cellula. Scongelare solo una fiala di cellule in un momento riscaldando a 37 ° C bagno di calore. </li><li> Usando una tecnica sterile, pipetta 1x10 6 cellule scongelato nel pallone cultura. Porre il pallone in incubatrice per permettere alle cellule di allegare. Oscillare delicatamente il pallone avanti e indietro in modo da formare una sospensione cellulare uniforme. <ol><li> Posizionare pallone in coltura tissutale incubatore e mantenere a 37 ° C in 5% CO 2 ambiente. Consentono alle cellule di aderire O / N. </li></ol></li><li> Aspirare il terreno, e sostituirli con fresco terreni di crescita pre-riscaldata. Porre il pallone in incubatrice e tuttiow cellule a crescere. Monitorare la crescita delle cellule quotidiano mediante ispezione visiva ogni 2-3 giorni con un microscopio invertito. Utilizzare le tecniche standard di coltura cellulare alle cellule di passaggio dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza. Nota: Per i saggi sperimentali raccolgono le cellule a 70% di confluenza per assicurare che le cellule siano attivamente proliferando. </li><li> Aspirare il terreno di coltura e risciacquare con 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Aspirare PBS e aggiungere 0,25% tripsina / EDTA (da 2 a 3 ml per 75 cm 2 di superficie) e incubare 5 minuti a 37 ° C. Visivamente confermano che le cellule sono staccati e aggiungere un uguale volume di mezzo di crescita, e pipettare delicatamente le cellule su e giù per ottenere una sospensione di cellule singole. Nota: E &#39;fondamentale che il terreno di coltura contiene siero come inattiva tripsina. Preparare almeno 2 a 4 volte più cellule rispetto al numero richiesto per un dato esperimento per compensare la perdita di cellule durante fasi successive </li><li> Determinare la percentuale di cellule vitali insospensione via trypan saggio esclusione blu utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Nota: Qui, usare solo preparazioni di cellule in cui ≥ 96% delle cellule sono vitali. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare dal pallone in una provetta conica da 50 ml. Cellule pellet di centrifugazione 5 min a 1.100 xg, a 4 ° C </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS ad una concentrazione di 2x10 6 cellule per ml. </li></ol> 5. Iniezione intraperitoneale di cellule Nota: Nei nostri esperimenti, i topi sono gestiti in un flusso d&#39;aria laminare o armadio biosicurezza all&#39;interno della nostra struttura barriera al fine di limitare il rischio di esposizione patogeno, Al fine di dimostrare chiaramente questa tecnica, le procedure nel video che accompagna sono stati condotti in un laboratorio riconosciuto per il lavoro degli animali. Questa particolare tecnica non richiede che gli animali erano sotto anestesia. Sotto protocolli approvati, eseguire questa technique su animali vivi. Utilizzare ceppi appropriati di topi per questo studio. Per esempio: usare immunocompromessi, topi nudi atimici per lo studio di cellule di cancro ovarico umano (SKOV3ip.1, e HeyA8) colonizzazione; utilizzare immunocompetenti C57BL / 6 topi per lo studio di topo cellule di cancro ovarico (ID8) colonizzazione. <ol><li> Carico 500 microlitri della sospensione singola cella nella siringa e mettere in sterile ricoperto ago da 25 G. Questo riduce taglio cella prima dell&#39;iniezione. </li><li> Scegli il mouse verso l&#39;alto per la collottola e tenere la coda con il palmo della mano e l&#39;indice e fissare la zampa posteriore sinistra tra l&#39;anello e mignolo (quando il mouse è trattenuto con la mano sinistra). Nota: per evitare organi addominali traumatizzanti, frenare il mouse bene in modo che non possa muoversi durante l&#39;iniezione. </li><li> Immaginate una linea attraverso l&#39;addome appena sopra le ginocchia, e individuare un punto sul lato destro dell&#39;animale e vicino alla linea mediana. Il punto di entrata è cranica e leggermente medialedell&#39;ultimo capezzolo. Nota: Inserendo l&#39;ago sul lato destro del mouse evita il cieco e riduce il rischio di puntura intestini 11. </li><li> Inserire l&#39;ago in corrispondenza della zona inferiore laterale dell&#39;addome del topo ad una profondità di circa 0,5 cm. Tirare indietro lo stantuffo per confermare che l&#39;ago non è penetrato in un vaso sanguigno o di altri organi peritoneali. <ol><li> Se il liquido viene aspirato scartare la siringa (e campione) 11. Un aspirato verde-marrone o giallo indica la penetrazione dell&#39;ago nel dell&#39;intestino o della vescica, rispettivamente. </li></ol></li><li> Iniettare il campione utilizzando lento, la pressione costante. Ritirare l&#39;ago e restituire il mouse per la sua gabbia. Non richiudere la siringa prima dello smaltimento in apposito contenitore. </li><li> Topi Sacrifice via di CO 2 asfissia e la rimozione degli organi vitali in punti temporali specifici dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 6. Lattea colonizzazione posto in vivo <ol><li> Quantitazione della localizzazione delle cellule tumorali di macchie biancastre con citometria a flusso <ol><li> Isolare depositi di grasso peritoneale da topi (come descritto nel passaggio 2,3-2,7) iniettati con fluorescenza tagged cellule tumorali e tessuti posto immediati PBS ghiacciato. <ol><li> Per questa particolare tecnica, il peso-partita tutti i tessuti adiposi di grasso al omento. Tessuti trasferimento per separare 5 ml provette contenenti 1,5 ml di DMEM senza siero e 0,1% (w / v) di albumina di siero bovino. Piscina tessuti raccolti da tre topi indipendenti al fine di garantire un rendimento sufficiente di cellule per citometria a flusso. </li></ol></li><li> Tessuti Triti utilizzando forbici chirurgiche e aggiungere 1,5 ml di DMEM senza siero contenente 0.4% (w / v) collagenasi I. Incubare la sospensione di tessuto a 37 ° C per 30 minuti con miscelazione rotazionale. <ol><li> Come passaggio facoltativo, dissociare ulteriormente il tessuto dalla masticazione. In questo caso, trasferire la sospensione tessuto-collagenasi ad un sacchetto microstomacher, masticate per 10 min in basso, ruotando l&#39;orientamentodei sacchi dopo 5 min. </li></ol></li><li> Filtrare i campioni attraverso un filtro a maglia di nylon (60 micron pori) per rimuovere i detriti più grandi. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri di PBS combinati con 900 ml di tampone di lisi ACK e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Cellule centrifugare a 250 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. <ol><li> Risospendere il pellet di cellule in 250 microlitri di PBS ghiacciato. Filtrare i campioni attraverso una maglia di nylon pori 60 micron per garantire sospensione singola cella. Lavare il filtro con 250 ml di PBS ghiacciato. </li></ol></li><li> Quantificare il numero di cellule con targhetta fluorescenza nella popolazione utilizzando un citofluorimetro equipaggiato con un laser giallo-verde 561 nm e / 15 nm filtro passabanda 585 nm. Impostare la porta per le celle tdTomato positive basate sull&#39;analisi delle cellule parentali e / o opportuni controlli negativi 4. </li></ol&gt; </li><li> La quantificazione delle metastasi microscopiche e macroscopiche <ol><li> Al punto finale sperimentale desiderata (s), isolare, e subito mettere i tessuti nei media fissaggio appropriati. Fissare i campioni più grandi, come gonadica intatto, uterino, e depositi di grasso mesenterica nel 10% formalina tamponata neutra per 48 ore a 4 ° C. Fissare campioni più piccoli (omentale e grassi splenoportal, così come equivalenti di tessuto di uterina e grasso mesenterico) nel 5% formalina tamponata neutra a 4 ° C per 2-16 ore. <ol><li> In alternativa, a scatto congelare i tessuti mettendoli in un mezzo di congelamento, come Office e cadere in una quantità appropriata di azoto liquido. </li></ol></li><li> Trasferimento tessuti al 70% di etanolo e conservare fissato a 4 ° C fino inclusione in paraffina. Incorporare e tessuti processo come descritto in 3.2 e 3.3. <ol><li> Utilizzare la sezione H &amp; E macchiato valutare tessuti per la presenza o assenza di metastasi microscopiche (cioè, gruppi di 50 cellule). Conferma tegli presenza di metastasi microscopiche con un metodo secondario, come una macchia d&#39;IHC per citocheratina 8/18 per rilevare cellule di cancro ovarico. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Lattea Spot Colonizzazione Ex Vivo <ol><li> Istituzione di ex vivo condizioni di base di coltura di organi omental <ol><li> Posizionare ogni omento in un unico inserto piastra di coltura e posto all&#39;interno di un pozzetto di una piastra di coltura tissutale dodici pozzetti contenenti 500 ml di DME media / F12 contenente il 20% di FCS. Mantenere colture d&#39;organo a 37 ° C in un ambiente di 5% CO 2 per 24 ore al 48 e / o punti di tempo supplementari. Utilizzare tre omenta indipendente (campioni in triplo) per ogni condizione (ad esempio, tipo di supporto punto di tempo /). </li><li> Per confermare l&#39;integrità dei tessuti alle estremità sperimentali, correggere e campioni di processo come descritto al punto 3. Contando sani contro adipociti necrotiche su H &amp; E sezioni in grado di valutare l&#39;integrità dei tessuti. Un minimo di ~ 120 cellule da5 campioni biologici è tenuto a formulare una percentuale di tessuto vivo presente 10. </li><li> Per misurare la funzione del tessuto, posto omenta (n = 3) in pozzetti separati di un 24-pozzetti contenenti 500 ml di DME media / F12 con 20% FCS. Lasciare omenta per condizionare i supporti a 37 ° C in un ambiente di 5% di CO 2 per 24 ore, e quindi rimuovere 250 microlitri per l&#39;uso in un IL-6 ELISA 10. </li></ol></li><li> Ex vivo co-coltura del omento mouse con cellule SKOV3ip.1-GFP <ol><li> Crescere e preparare cellule fluorescente contrassegnati come descritto nel capitolo 4 e risospendere ad una concentrazione di 2 × 10 6 cellule per ml. </li><li> Applicare ~ 6 ml di tessuto adesivo alla membrana dell&#39;inserto coltura e lasciare asciugare all&#39;aria. Lavare la membrana due volte con acqua sterile per rimuovere l&#39;adesivo in eccesso. Far asciugare le membrane sotto una cappa laminare. </li><li> Accise cautela il omenta e attaccarlo al memb adesivizzatorane con pinza sterile. Lasciare il tessuto di aderire alla membrana per 1 min prima di aggiungere supporti. Aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare sopra l&#39;omento in ogni inserto cultura. Riempire l&#39;area attorno alla camera transwell con 2,5 ml di DME / F-12 10. </li><li> Incubare omenta con sospensione cellulare per 6 ore a 37 ° C in un ambiente di 5% di CO 2. Rimuovere con cautela e lavare il omenta con ~ 10 ml di PBS. Visualizza fluorescente foci di cellule di cancro utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza adeguato 10. </li></ol></li></ol>

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcome+of+prophylactic+oophorectomy+in+BRCA1/BRCA2+mutation+carriers+and+events+during+follow-up.">Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up.</a> British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sviluppo di terapie per colpire le cellule Disseminata richiede una comprensione meccanicistica della colonizzazione metastatica, il primo passo fondamentale per lo sviluppo della malattia peritoneale. Per affrontare questi problemi riportiamo approcci che possono essere utilizzati per discernere come composizione del tessuto unico del omento e l&#39;architettura promuovere cancro ovarico colonizzazione metastatica. Segni particolari del nostro approccio sono: 1) l&#39;attenzione sui primi eventi del processo d...

A differenza di molti tumori solidi, metastasi da carcinoma ovarico sieroso ad alto grado (HGSC) si limitano alla cavità peritoneale 1. Così, efficaci terapie peritoneali potrebbero potenzialmente controllare o sradicare HGSC. Attualmente, un approccio terapeutico standard è citoriduzione chirurgica combinata con la chemioterapia 1-3. Purtroppo, la stragrande maggioranza dei pazienti esperienza e soccombono a complicanze di recidiva di malattia. Queste statistiche tristi evidenziano la necessità di una migliore comprensione della colonizzazione metastatica, il processo attraverso il quale le cellule tumorali a localizzare, utilizzare, e proliferare in tessuti dell&#39;ospite a formare metastasi 2. L&#39;omento è un luogo preferito precoce di metastasi HGSC 4-7. A differenza di altri adiposo peritoneale, il tessuto adiposo omentale contiene le strutture immunitarie insolite note come macchie biancastre, che contengono B, T e cellule NK e macrofagi, che svolgono un ruolo chiave nella homeos peritonealiTASIS 8,9. Oltre alle loro funzioni fisiologiche, abbiamo scoperto che macchie biancastre svolgono un ruolo attivo nel carcinoma ovarico colonizzazione metastatica 4. Nei saggi metastasi sperimentali, SKOV3ip.1, CaOV3, e HeyA8 (umana) e ID8 (murino; C57BL / 6) cellule di cancro ovarico rapidamente a casa per macchie biancastre, suggerendo che le cellule si stanno muovendo verso un fattore chemiotattico secreto. È interessante notare che le cellule tumorali non colonizzare adiposo peritoneale privo macchie biancastre (cioè, gonadici e grasso uterina) 4. Al fine di identificare i meccanismi che regolano la colonizzazione macchia lattiginosa, abbiamo ottimizzato i modelli di xenotrapianto che consentono l&#39;interrogatorio di eventi cellulari e molecolari nel corso tempo della colonizzazione metastatica 4. Un vantaggio specifico degli approcci qui descritti è la sua enfasi sulla architettura tissutale e la funzione, che consente agli utenti di testare le ipotesi in completamente integrato in vivo e ex vivo modelli di metastatic 4,10 colonizzazione. Confrontando la localizzazione e la crescita delle cellule tumorali nei depositi di grasso peritoneale che o contengono o mancano di macchie biancastre, i ricercatori possono testare il contributo relativo (s) di adipociti e cellule all&#39;interno macchie biancastre per l&#39;alloggio e la progressiva crescita delle cellule di cancro ovarico in tessuti fisiologicamente rilevanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Di alta qualità carcinoma ovarico sieroso (HGSC), la causa di diffuse metastasi peritoneali, continua ad avere una prognosi estremamente sfavorevole; meno del 30% delle donne sono vivi a 5 anni dopo la diagnosi. L&#39;omento è un sito preferito HGSC formazione di metastasi. Nonostante l&#39;importanza clinica di questo microambiente, il contributo del tessuto adiposo omentale alla progressione del cancro ovarico rimane poco studiato. Adiposo omental è insolito in quanto contiene strutture note come macchie biancastre, che sono composti da B, T e cellule NK, macrofagi e cellule progenitrici circostanti nidi dense di vascolarizzazione. Macchie biancastre giocano un ruolo chiave nelle funzioni fisiologiche del omento, che sono necessari per l&#39;omeostasi peritoneale. Abbiamo dimostrato che macchie biancastre anche promuovere il cancro ovarico colonizzazione metastatica di adiposo peritoneale, un passo fondamentale nello sviluppo delle metastasi peritoneali. Qui si descrivono gli approcci che abbiamo sviluppato per valutare e quantificare macchie biancastre in ogniitoneal adiposo e studiare il loro contributo funzionale di cellule di cancro ovarico colonizzazione metastatica dei tessuti omentali sia in vivo ed ex vivo. Questi approcci sono generalizzabile a modelli di topo e linee cellulari aggiuntivo, permettendo così lo studio della formazione di metastasi del cancro ovarico dalla localizzazione iniziale di cellule a strutture piatte lattee allo sviluppo di metastasi peritoneali diffuse.

Identificazione e istologico Esame dei peritoneale Fat Depositi Dissezione anatomica Gross consente l&#39;identificazione di quattro dei cinque fonti primarie di grasso peritoneale (Figura 1A). Spostamento in senso orario dal centro in alto sono: l&#39;omento (OM; descritto) che si trova sopra lo stomaco e la milza, il grasso gonadico (GF) che circonda l&#39;ovaio sinistro (ov), il grasso uterino (UF) attaccato alle corna uterine (uh) e il mesentere (MY) col...

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

13.0K Views.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Medicina

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un umano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placca aterosclerotica modello per studiare Lesione Biologia

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validazione di Nanobody e anticorpi Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Esperimenti tumore xenotrapianto NIRF imaging nei topi mediante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria di flusso e microscopia

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Umana Dupuytren di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...