Vorremmo ringraziare il Dott. Hesham Abdelbary per fornire umano campioni chirurgici per i dati presentati in Fig. 2.

1. Lavorazione dei tessuti <ol><li> Per ottenere risultati migliori, questo protocollo deve essere effettuata utilizzando un tessuto isolato appena depositato in DMEM mezzi di comunicazione contenente il 10% FBS, 1% Pennicilin / streptomicina soluzione, e lo 0,1% Amphothericin soluzione B immediatamente dopo l&#39;intervento chirurgico prima della lavorazione. Se ciò non fosse possibile, i tessuti possono essere lasciati durante la notte in questo mezzo a 4 gradi prima della lavorazione. </li><li> Prima della lavorazione del campione, sterilizzare pinze di metallo e lame monouso depositando in una soluzione di etanolo al 70% per almeno 5 minuti. Anche preparare un 24-pozzetti con 2 ml di DMEM supporti contenenti il ​​10% FBS, 1% Pennicilin / streptomicina soluzione, e lo 0,1% Amphothericin B. </li><li> Raccogliere il campione di tessuto in una cappa flusso laminare coltura cellulare con pinze sterilizzate e depositare il tessuto in una teglia da 15 centimetri vuota Petri, mantenendo il coperchio sul lato, lato sterile alto. </li><li> Nel cofano coltura cellulare, usare un mm 2 biopsia pugno di ottenere differenti core da una varietà di aree all&#39;interno del tessuto come in Figura 1. Depositare i nuclei nel coperchio del petri 15 cm con l&#39;aiuto di pinze, lasciando abbastanza spazio tra ciascun core in modo che possano essere facilmente tagliato lungo l&#39;asse orizzontale. </li><li> Dividi ogni core in 4 / 4 anche utilizzando una lama di rasoio sterile come in Figura 1. </li><li> Utilizzando una punta di pipetta, mettere ogni trimestre da un nucleo centrale in un dato ben diverso da A1 ad A4 come in figura 1, già contenente 1,5 ml di DMEM contenente 10% FBS, 1% Pennicilin / streptomicina soluzione, e lo 0,1% Amphothericin soluzione B . Ripetere l&#39;operazione per ogni core. Questo dovrebbe consentire il campionamento rappresentativo del tumore, riducendo al minimo i pregiudizi in un ben determinato / condizione. Per una migliore rappresentazione, aumentare il numero di core. </li></ol> 2. Valutazione della vitalità del tessuto <ol><li> A seguito di lavorazione dei tessuti, aggiungere 25μl Alamar blu per bene # # A1 e A2, come mostrato in figura 1 e incubare per 1 ora a 37 gradi in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li><li> In seguito a incubazione con Alamar blu, togliere 3 volte 100 ul da ogni A1 e A2 bene e il trasferimento a 6 diversi pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Leggi il segnale usando un lettore di fluorescenza piastra (530 eccitazione, 590 di emissione) e conservare i dati per il record. </li><li> Dopo Alamar segnale blu è stato letto, il trasferimento di tutti i pezzi di tessuto con una punta di pipetta, da ben A1 a C1 che contiene DMEM 10% FBS + PS + AmphoB. Fare attenzione a non trasferire una quantità eccessiva di supporti da ben A1. </li><li> Infettare pozzi A3 e A4, rispettivamente con 10 6 PFU di GFP-esprimere e luciferasi che esprimono virus vaccinia diluita in 25 l di media. Bene A2 può essere infettato da un virus che che esprime un transgene dato anche del tutto assenti. </li><li> 72 ore dopo, aggiungere 25 microlitri di Alamar blu per pozzi C1 e D1 e ripetere il passo 2,2 </li></ol> 3. Visualizzazione di espressione GFP transgene mediante microscopia fioritura <ol><li> Rimuovere tutti i supporti coltura cellulare che copre i pezzi di tessuto al fine di tener buone foto a fluorescenza. </li><li> Utilizzando un microscopio a fluorescenza capace dissezione, in primo luogo prendere una immagine a contrasto di fase con una risoluzione appropriata </li><li> Passa alla modalità fluorescenza e scattare una foto utilizzando il filtro appropriato per visualizzare il transgene di interesse, in questo caso GFP. </li><li> Utilizzare un filtro a fluorescenza per un&#39;altra lunghezza d&#39;onda il più possibile uno da quello del transgene di interesse (come RFP) per scattare una foto di fluorescenza di fondo </li></ol> 4. Visualizzazione di espressione luciferasi utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS) <ol><li> Assicurarsi che il IVIS viene inizializzato prima di iniziare. </li><li> In A4 pozzi e B4, aggiungere 5 ml di substrato luciferina 10 mg / ml, mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Impostare il tempo di esposizione IVIS a 5 secondi e scatta una foto del vostro pozzi. Se l&#39;immagine è satura, ripetere con il tempo di esposizione più bassi. Se non vi è alcun segnale, aumentare il tempo di esposizione. </li><li> Utilizzando il software di imaging IVIS, è possibile rimuovere lo sfondo utilizzando il segnale da ben B4 e selezionare la regione di interesse per quantificare il segnale luminescente. </li></ol> 5. Valutare i titoli virale mediante saggio placca <ol><li> Prima di quantificare i titoli virale, i tessuti devono prima essere omogeneizzato per liberare particelle virali. Questo può essere fatto alcuni mesi più tardi nei campioni di tessuto infetto vengono conservati a -80 </li><li> Pesare il campione che deve essere omogeneizzato utilizzando una bilancia analitica. In questo caso, useremo il campione raccolto da A2 bene. </li><li> Posizionare il tessuto è in polistirolo da 5 ml a fondo rotondo tubo falcon e aggiungere 1 ml di PBS. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore tessuti. Se necessario, memorizzare il omogenato a -80 per la valutazione dei titoli virale in un secondo momento. </li><li> Al virus vaccinia titolo, piastra prima 1 milione di cellule U2OS in un 6-pozzetti ed incubare una notte in un grado 37, 5% di CO 2 umideified tale che hanno raggiunto circa il 95% confluenza del giorno successivo incubatrice. </li><li> Utilizzare siero media liberi di fare diluizioni seriali del virus, avendo cura di cambiare punte tra un passo e diluizione. Di solito facciamo 1 su 10 diluizioni e utilizzare 100 l per il trasferimento in 900 microlitri. Quanti diluizioni sono fatte dipende la resa dei virus attesi. </li><li> In seguito a fare le diluizioni, rimuovere i mezzi di copertura delle celle U20S placcato poi aggiungere 500 ml di virus diluito magazzino (per ogni diluizione) per infettare le cellule U2OS. Incubare le cellule per 1 minuto un&#39;ora a 37 gradi Celsius in un 5% di CO 2 incubatore umidificato. </li><li> Durante questo tempo, scaldare il 2 X concentrato DMEM contenente 20% FBS, e la soluzione del 3% CMC in un bagno d&#39;acqua 37 gradi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, togliere i mezzi di copertura cellule infettate U2OS. Mescolare 01:01 volumi del 3% CMC: 2X DMEM, 20% FBS insieme, utilizzando 2 ml di questa miscela per coprire tutti i pozzetti delle cellule infette U2OS. </li><li> Mettere le cellule indietro in un grado 37 5% CO 2 umidificata incubatore per altre 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore, aggiungere 2 ml di metanolo-acido acetico fissativo in cima alla sovrapposizione CMC in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti in una cappa di coltura cellulare. </li><li> Scartare la sovrapposizione fisso e lavare resto fuori dei pozzi con acqua di rubinetto. </li><li> Macchiare le cellule fisso U2OS con 2 ml di una soluzione di Coomassie blu per bene e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente a bassa velocità su un piatto shaker. </li><li> Rimuovere il Coomassie macchia dai pozzetti e lavare i piatti con l&#39;acqua del rubinetto. Lasciare asciugare off con coperchio per circa un&#39;ora. </li><li> Le placche risultante virale può essere facilmente visualizzato in figura 2C. Le piastre possono essere conservate indefinitamente in questa fase. </li><li> Conte placche al passaggio di diluizione, dove tra 10 e 100 placche sono visibili. </li><li> Moltiplicare il numero di placche contati dalla diluizione utilizzata e moltiplicare il numero risultante da 2 a dare un titolo a PFU / ml. Per esempio, se 25 placche sono conteggiati nel pozzo dove è stato utilizzato un milione di volte di diluizione, il titolo del campione iniziale non diluita è 25 moltiplicato per 1 milione moltiplicato per 2 o 50 milioni di PFU / ml. Dividere ulteriormente questo numero per il peso inizialmente misura per il campione di segnalare i titoli in PFU / g </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Al fine di stabilire con precisione se un campione ottenuto chirurgicamente tessuto normale / tumorale è o non è infettabili con il virus, si deve prima assicurarsi che il campione di tessuto è almeno fattibile. Fig. 1A mostra che la redditività può essere valutata utilizzando un colorante metabolica (Alamar blu) e che il tessuto sia normali che tumorali possono rimanere metabolicamente attivo per un periodo di almeno 72 ore. Ciò suggerisce che i tessuti in coltura ex vivo in grado di supportare la replicazione virale. Un vantaggio significativo di virus oncolitici è che possono essere ingegnerizzati per esprimere transgeni terapeutici o di imaging. Fig. 2D-E mostra che GFP o luciferasi possono essere rilevati dai tessuti infetti ex vivo, sostenendo ulteriormente che questi tessuti sono vitali e anche infettabili. Anche se l&#39;espressione del transgene aumento è generalmente associata con la replicazione virale, non necessariamente equivale a un ciclo produttivo di vita virale che porta alla auto-amplificazione e diffusione, che è pensato per essere importante per l&#39;attività terapeutica. Per questo motivo, è necessario stabilire se si produce più virus di quello che è stato utilizzato per infettare inizialmente il tessuto. Fig. 2B mostra che al momento quantificazione virale mediante test placca, più virus si ottiene dopo 72 ore, l&#39;infezione dei tessuti raccolti immediatamente dopo l&#39;infezione. Nel complesso, questi dati mostrano che il tessuto tumorale asportato chirurgicamente possono rimanere vitali nelle cellule in coltura per un periodo di almeno 72 ore, durante le quali la replicazione virale tempo possono essere supportati. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Panoramica del tessuto campionamento / sezionamento protocollo. Campione di tessuto viene processato rimuovendo diverse 2 core mm che vengono successivamente divisa in quattro quartieri che sono distribuiti in modo casuale nei pozzetti A1-A4. I codici colore indicano i reagenti utilizzati in ogni pozzetto. Il grigio-grigio quadrati all&#39;interno dei pozzi rappresentano ogni trimestre dal 6 core singolo dipinto. Il tessuto in pozzetto A1 è trasferito ad un nuovo pozzo (C1) con i media dopo l&#39;iniziale lettura Alamar blu. Una seconda lettura è fatta al termine della incubazione di 72 ore con i virus. Wells A4 e B4 sono integrate con Luciferin dopo l&#39;incubazione 72 ore post-infezione <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Vitalità e infectability di tessuto prelevato dai pazienti. A) la vitalità del tessuto, come misurato dal segnale di Alamar blu a 2 ore e 72 ore dopo la raccolta. Asse Y rappresenta il vuoto corretto Alamar segnale blu. B) titolo di vaccinia virusraccolti per grammo di campioni di tessuto 2 e 72 ore dopo l&#39;infezione. C) Esempio di placche virus vaccinia sulle cellule U2OS di colorazione Coomassie. D) del segnale di luminescenza ottenuta dal paziente VV-luciferasi con infezione da tessuto ripreso con IVIS. E) le immagini di microscopia a fluorescenza di campione di tessuto del paziente infettato con VV-GFP.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III/IV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck.">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li><li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reovirus:+Rationale+and+clinical+trial+update.">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li><li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer.">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , (2010).</li><li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses.">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li><li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers.">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , (2010).</li><li>Kuip, H. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Uno dei passi fondamentali in questo protocollo è di ottenere campioni di tessuto fresco. Se il campione è messo in coltura cellulare a seguito di una lunga attesa in sala operatoria in un supporto inadeguato (es. PBS), questo può compromettere la vitalità del tessuto e prevenire infectability. Da segnalare, il tessuto normale è intrinsecamente più incline a questi effetti di tessuti tumorali. Un altro punto critico è il numero di core sono utilizzati per esempio il tessuto e la consistenza delle loro dimensioni. Incoerenze nelle dimensioni porterà alla variabilità tra campioni dei pazienti, in quanto fattori come l&#39;ipossia tissutale e la superficie infectectable varierà a seconda delle dimensioni dei nuclei e quartieri core. Anche se questo può essere parzialmente risolto utilizzando affettatrici tessuto, uno dei vantaggi del metodo presentato qui è che è relativamente facile, meno inclini alla contaminazione, e ampiamente applicabile ad una varietà di tipi di tessuto, compresi i tessuti molli o viscoso che non sono facilmente riconducibili al taglio dei tessuti. In particolare, il numero di core può essere aumentato al fine di ottenere una migliore rappresentazione dei tessuti. Inoltre, il core può essere tagliato in più pezzi (es. 5-8) per ospitare altri saggi potenziale per essere condotti in parallelo come il DNA, l&#39;RNA, o l&#39;estrazione di proteine. Tuttavia, il numero di pezzi in cui i core possono essere tagliati a dimensioni riproducibile dipenderà la dimensione effettiva del core, che possono essere modificati utilizzando carotieri diverse dimensioni. Opzionalmente, un modo per aiutare ottenere pezzi di tessuto riproducibile dimensioni è quello di uniformare la lunghezza dei nuclei con un righello prima di ulteriori suddividendoli in piccoli pezzi. Il protocollo può naturalmente essere modificata per ospitare altri virus e abbiamo trovato che i tessuti possono essere vitali e supporto della replica per un massimo di 6 giorni. Il protocollo può essere ulteriormente estesa ad altre misure di viralmente-espresso transgeni tra cytrokines. A seguito di infezione, i tessuti possono anche essere inclusi in paraffina per l&#39;ulteriore sezionamento e colorazione con metodi immunoistochimici, che permette un ulteriore affinamento della istologia dei tessuti e come si riferisce alle infezioni virali 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Alta glucosio DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin soluzione B </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Usa a 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-Streptomicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Usa all&#39;1% </td></tr><tr><td> Alamar Blu </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin Sale di potassio </td><td> Prodotti Imaging Molecolare </td><td> D-Luciferin Sale di potassio di 1 g </td><td> Risospendere in PBS a 10 mg / ml e filtrare su filtro di 0,22 micron </td></tr><tr><td> MEM polvere </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Fare nella metà del volume suggerisce di fare 2X MEM e filtro 0,22 micron del filtro prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Carbossimetilcellulosa (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Fare una soluzione al 3% in acqua deionizzata e autoclave. Si noti che in polvere può richiedere un certo tempo per sospendere di nuovo </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 millimetri Biopsia pugno </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Edge Blades Prep </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Disection microscopio a fluorescenza </td><td> Leica </td><td> modello M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> Imaging in vivo del sistema (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® serie 200 </td><td></td></tr><tr><td> Tessuto Tearor </td><td> Biospec prodotti </td><td> modello 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

I virus oncolitici (OVS) sono nuove terapie che replicano in modo selettivo e uccidere le cellule tumorali 1. Diversi studi clinici che hanno valutato l&#39;efficacia di una varietà di piattaforme tra cui oncolitici HSV, reovirus, e OVS Vaccinia come trattamento per il cancro sono attualmente in corso 2-5. Una caratteristica chiave del virus oncolitici è che possono essere geneticamente modificati per esprimere transgeni giornalista che permette di visualizzare l&#39;infezione dei tessuti al microscopio o bio-luminescenza di imaging 6,7. Questo offre un vantaggio unico dal momento che è possibile infettare i tessuti ex vivo da pazienti prima della terapia al fine di accertare la probabilità di successo viroterapia oncolitica 8. A tal fine, è fondamentale campione adeguato di tessuto per compensare l&#39;eterogeneità del tessuto e valutare la vitalità dei tessuti, in particolare prima di infezione 9. E &#39;anche importante seguire la replicazione virale mediante transgeni giornalista se espresso dalla piattaforma oncolitici così come da titolazione diretta dei tessuti dopo omogeneizzazione al fine di discriminare tra infezione abortiva e produttivo. L&#39;oggetto di questo protocollo è quello di affrontare questi temi e descrive qui 1. Il campionamento e la preparazione del tessuto tumorale per la coltura delle cellule 2. La valutazione della vitalità del tessuto utilizzando il colorante metabolica Alamar blu 3. Infezione ex vivo dei tessuti coltivati ​​con il virus vaccinico che ha espresso GFP o lucciola luciferasi 4. Rilevamento di espressione del transgene mediante microscopia a fluorescenza o con un sistema di imaging in vivo (IVIS) 5. Quantificazione del virus mediante test placca. Questo metodo completo presenta numerosi vantaggi quali la facilità della lavorazione dei tessuti, l&#39;indennizzo per l&#39;eterogeneità del tessuto, il controllo della vitalità del tessuto, e la discriminazione tra l&#39;infezione abortiva e le ossa in buona fede replicazione virale.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Virus oncolitici sono promettenti per la terapia del cancro. La possibilità di accertare la infectability di campioni di tessuto ottenuti da pazienti dal vivo prima del trattamento è un vantaggio unico di questo approccio terapeutico. Questo protocollo descrive come processo di tessuti per<em&gt; Ex vivo</emInfezione&gt; con il virus oncolitici e la successiva quantificazione virale.

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K Views.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Virus oncolitici sono promettenti per la terapia del cancro. La possibilità di accertare la infectability di campioni di tessuto ottenuti da pazienti dal vivo prima del trattamento è un vantaggio unico di questo approccio terapeutico. Questo protocollo descrive come processo di tessuti per Ex vivo con il virus oncolitici e la successiva quantificazione virale.

Video: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo del tessuto del paziente e l&#39;esame di consegna Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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Medicina

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarteriosa somministrazione di oncolitici virus per locoregionale Terapia delle ortotopico HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...