Questo lavoro è stato supportato da una CASS Science Foundation e Medicina di Grant; (MB); un Health &amp; Medical Research Council of Australia Nazionale Progetto Grant (KLS, 338.516); e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria (Australia).

1. Preparazione di cellule, dei media e reagenti <ol><li> Preparazione di-metilcellulosa contenente Piano <ol><li> Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 100 ml di sterile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (senza additivi) in un pallone da 250 ml. </li><li> Riscaldare la soluzione sul basso in un forno a microonde per 5 min; fare attenzione ad evitare bollente. </li><li> Una volta che la polvere metilcellulosa è semi-sciolto, aggiungere un agitatore magnetico pulito e mezzi per prendere il volume a 125 ml. </li><li> Mescolare, invertito, e agitare a temperatura ambiente per 1,5 ore, seguita da agitazione a 4 ° C per una notte. </li><li> Dividere la soluzione altrettanto in quattro provette da 50 ml e centrifugare per 1,5 ore a 2.300 x g. </li><li> Raccogliere il chiaro, surnatante altamente viscoso (circa il 90-95% delle azioni), un&#39;aliquota in sterili provette da 50 ml e conservare a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol></li><li> Cultura ed etichettatura di cellule <ol><li> Mantenere linee cellulari di carcinoma ovarico in monostrato in un tissue cultura incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 in terreni di coltura appropriato (DMEM per le cellule KGN 17 e MCBD110: M199 per le linee cellulari OVCA429 e OVCA433 18) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L -glutamina e 1% di penicillina-streptomicina. </li><li> Mantenere le cellule mesoteliali umane LP9 in M199: Hams mezzi F12 contenente 15% FBS, 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF) e 400 ng / ml di idrocortisone, in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Cellule seme nel formato desiderato pallone e crescono a circa il 75% di confluenza. Celle di raccolta di tripsinizzazione con 0,05% tripsina / EDTA, centrifugare a 186 xg per 5 minuti, e lavare pellet di cellule due volte con PBS. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol></li><li> Facoltativo fluorescente metodo di etichettatura cellulare <ol><li> Risospendere le cellule tumorali ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml in 1 ml di preriscaldata PBS/0.1% BSA. </li><li> Aggiungere 2 ml di 5 mM magazzino cellule Trsoluzione CSFE asso (o altra etichetta cella preferita che è trattenuta a lungo termine) a cellule ad una concentrazione finale di 10 mM e incubare a 37 ° C per 10-15 min a bagnomaria. </li><li> Estinguere la reazione con 1 ml di ghiaccio mezzo freddo contenente 10% FBS e ri-pellet per centrifugazione. Risospendere in 10 ml di mezzo di crescita preriscaldata adeguato (vedere il punto 1.2.1). </li><li> Cellule seme in un 2 pallone 75 centimetri filtro livellata e cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Controllare cellule al microscopio a fluorescenza per verificare che il livello di etichettatura fluorescenza è sufficiente per il rilevamento. Una volta che le cellule raggiungono circa il 75% di confluenza, raccolto e contano come nei passaggi 1.2.3 e 1.2.4 di cui sopra. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di Spheroids in metilcellulosa <ol><li> Calcolare il volume delle cellule tumorali ovariche da Sezione 1 necessarie per la generazione sferoide (per un totale di 300.000 cellule sono richiesti per ogni esperimento pieno piastra a 96 pozzetti). Noa te: se si utilizza linee cellulari diverse da quelle qui presentate, le densità di cellule per la produzione di sferoide uniforme possono avere bisogno di essere ottimizzato per ogni linea. </li><li> Per calcolare la diluizione di cellule in mezzi metilcellulosa, innanzitutto sottrarre il volume della cella richiesta (passo 2.1) da 15 ml. </li><li> Aggiungere 3 ml di metilcellulosa soluzione madre (per fare 20% metilcellulosa finale) per un volume di terreno di coltura appropriato per ciascuna linea cellulare, pari a 15 ml meno il volume delle cellule e mescolare accuratamente capovolgendo. </li><li> Aggiungi 300.000 cellule al medium contenente metilcellulosa e miscelare delicatamente per inversione. </li><li> Pipettare 150 microlitri della miscela cellule / metilcellulosa / media (per un totale di 3000 cellule / pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti fondo concavo e coltura a 37 ° C, 5% CO 2 per 1-4 giorni o fino a formare sferoidi uniformi (1 sferoide / pozzetto è tipicamente osservata). </li></ol> 3. RTCA Cellulari Invasion saggi NOTE: letture dell&#39;impedenza sono espressi come indice cellulare (CI), un parametro adimensionale che rappresenta una variazione relativa in cella impedenza misurata rappresenta lo stato della cella. Per l&#39;analisi, importare i dati in un foglio di calcolo, ad esempio Microsoft Excel. <ol><li> Piatto Preparazione <ol><li> Lavorando in gruppi di 4 pozzetti alla volta, aggiungere 50 microlitri matrice (diluito 1:10 in siero privo di mezzi di coltura) a ciascun pozzetto della camera superiore di una piastra a 16 pozzetti RTCA CIM per garantire che la superficie totale è coperto . Rimuovere 30 ml di matrice immediatamente, ma lentamente, per sbarazzarsi di qualsiasi liquido in eccesso. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 4 ore prima dell&#39;uso in un incubatore di coltura tissutale. </li><li> Aggiungere 30 ml di mezzo privo di siero (SFM) appropriati per ciascuna linea cellulare di cancro alla camera superiore e 160 microlitri di media con o senza siero (secondo il vostro disegno sperimentale) alla camera inferiore. </li><li> Montare la piastra CIM cliccando camera bassa nella camera superiore e equilibrmangiato in un incubatore a 37 ° C per 1 ora in un incubatore di coltura tissutale. </li></ol></li><li> Programmazione dello strumento RTCA <ol><li> Aprire il programma RTCA e selezionare la scheda &#39;Layout&#39;. Evidenziare tutti i pozzetti sperimentali. </li><li> Fai clic destro su pozzi e selezionare &#39;Attiva pozzi&#39;; quindi compilare in condizioni sperimentali e nomi di cella, se lo desideri. </li><li> Per aggiungere passaggi o sottofasi al programma, selezionare la scheda &#39;Pianificazione&#39; e fare clic destro su &#39;Aggiungi un gradino&#39;. Il primo passo è un fondo preprogrammato sweep, che è integrata automaticamente nel programma una volta sola &#39;aggiungere un passaggio&#39; viene scelto. </li><li> Inserire i dettagli del programma desiderato per la fase 2 del programma RTCA, che registrerà le letture durante la creazione del monostrato LP9. Aggiungere gli intervalli di tempo tra le letture dell&#39;impedenza selezionando la scheda &#39;Intervallo&#39; e digitando &#39;15 minuti &#39;. Aggiungi la durata sperimentale selezionando l&#39;&#39;Durata&#39; scheda did entrare in un tempo compreso tra 12-24 ore. </li><li> Per aggiungere fasi successive, selezionare la scheda &#39;Pianificazione&#39; e fare clic destro su &#39;Aggiungi un gradino&#39; e inserire i dettagli dei passaggi aggiuntivi, come sopra. Fase 3 del programma RTCA dirigerà lo strumento per effettuare le letture durante l&#39;invasione sferoide; Inserisci il &#39;5 min &#39;sotto la&#39; Intervallo &#39;scheda e &#39;48 ore&#39; nella scheda &#39;Durata&#39;. </li><li> Selezionare &#39;Plate&#39; nella barra dei menu e salvare. </li></ol></li><li> Generazione di LP9 monostrato e misurazione dei Spheroid Invasion <ol><li> Posizionare la piastra CIM in strumento RTCA e programma aperto dal precedente passaggio 3.2. Prima di aggiungere le cellule, selezionare &#39;Esegui&#39; nella barra dei menu e poi su &#39;Start&#39;. Verrà automaticamente eseguita Uno sfondo sweep (Fase 1 nelle istruzioni del software RTCA). </li><li> Rimuovere la piastra CIM dallo strumento seguendo lo sweep sfondo e posto in una cappa di coltura tissutale. </li><li> Piatto 50,000 LP9 cellule risospese in 160 microlitri SFM nella camera superiore di ciascuna piastra CIM bene. </li><li> Porre la piastra in strumento RTCA e le letture ogni 15 minuti, mentre il monostrato LP9 sta creando notte (Fase 2 del programma RTCA). </li><li> Harvest sferoidi tumorali generate nella fase 2 &#39;Generazione di sferoidi in metilcellulosa&#39;, sopra. <ol><li> Asetticamente, tagliare 1 millimetro la parte superiore di una punta di pipetta 1 ml e utilizzare per recuperare delicatamente il contenuto di ogni bene. Trasferire in una provetta sterile. </li><li> Centrifugare sferoidi a 120 xg per 8 minuti, e rimuovere metilcellulosa contenente il mezzo aspirando delicatamente. </li><li> Lavare sferoidi altre due volte con PBS, centrifugazione a 120 xg per 8 minuti per far sedimentare sferoidi dopo ogni lavaggio. </li><li> Per ogni bene sperimentale, risospendere un totale di 10 sferoidi in 160 ml di mezzo senza FBS. </li><li> Pausa l&#39;esperimento RTCA selezionando &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e di controllo &amp;# 8216; Pause &#39;. Rimuovere la piastra CIM dallo strumento, e posizionare in una cappa di coltura di tessuti. Aspirare fuori il supporto di ogni bene e sostituirlo con i media sferoide contenenti (10 sfere in 160 microlitri) o di mezzi freschi per i pozzi di controllo solo LP9. </li></ol></li><li> Riportare la piastra allo strumento RTCA. Selezionare &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e controllare &#39;Abort passo&#39;. Il programma si sposterà automaticamente alla fase successiva. Per riprendere l&#39;esperimento, selezionare &#39;Esegui&#39; dalla barra dei menu e verificare &#39;Start / Continue&#39;. Fase 3 nel programma RTCA avvierà. </li></ol></li><li> Analisi dei dati <ol><li> Per determinare il livello di invasività cellulare sferoide, sottrarre i valori ottenuti per il monostrato LP9 solo dalle singole letture ottenute per le linee cellulari di carcinoma ovarico in ogni tempo di valutazione. </li><li> Per tracciare &#39;invasione sferoide&#39;, normalizzare tutti i valori per il punto di tempo in cui gli sferoidi sono stati aggiunti alla piastra, da setting quel punto il tempo a &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Invadere le cellule tumorali ovariche interagire con una varietà di tipi di cellule sulla superficie del peritoneo, comprese fibroblasti, adipociti e cellule mesoteliali, e la comunicazione bidirezionale tra cellule tumorali e cellule peritoneali è pensato di svolgere un ruolo chiave nel guidare il processo metastatico 2. Una volta masterizzato, il protocollo qui descritto è facilmente adattabile allo studio di queste interazioni nel microambiente peritoneale, ad esempio, mediante l&#39;aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM bene o manipolazione genetica del cancro o linee cellulari peritoneale. Inoltre, questo metodo può essere usato con cellule di tumore ovarico primari raccolti di fresco da asciti maligne e / o cellule peritoneali primari per avere una visione diretta nelle segnali regolatori e le interazioni cellulari che regolano la creazione di una lesione metastatica all&#39;interno della cavità peritoneale <sup&gt; 2. L&#39;uso dello strumento RTCA per misurare la capacità invasiva delle cellule singole o sferoidi offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi endpoint singoli e analisi di immagini time-lapse. Lo strumento RTCA misura invasione cellulare a intervalli definiti in continuo nel corso di un saggio, che può essere ore o giorni. Ciò consente la determinazione delle variazioni del tasso di invasione nel tempo, che supera i limiti dei dosaggi singoli endpoint. Ad esempio, esaminando i dati invasione delle diverse linee cellulari di cancro in un singolo endpoint (Figura 2), ad esempio, 3 ore, potrebbe aver portato alla conclusione erronea che KGN e OVCA433 cellule erano molto più invasivo rispetto OVCA429 cellule. Un altro vantaggio di questa tecnologia è che lo strumento RTCA misura variazioni di impedenza elettrica. Ciò significa che le analisi possono essere eseguiti senza etichettare le cellule con un agente esogeno, che potrebbe avere effetti indesiderati su phen cellulareotype o funzione. Questo diventa particolarmente importante quando si studiano le cellule tumorali ovariche primarie derivate da asciti maligne, con cui è essenziale mantenere manipolazioni al minimo in modo da evitare di introdurre cambiamenti molecolari e fenotipici che non riflettano la loro natura in vivo 2. Inoltre, l&#39;uso dello strumento RTCA consente la raccolta di dati quantitativi in ​​tempo reale, che non solo evita la perdita di tempo analisi associati microscopia time-lapse ma anche consente la rapida determinazione della chiave finestre sperimentali per l&#39;ottimizzazione del saggio. Ciò è particolarmente utile quando si confrontano gli effetti di una serie di fattori di invasione sferoide, fattori come diversi possono esercitare i loro effetti massimi a diversi intervalli di tempo o con differenti profili notevolmente nel tempo. Anche se questo protocollo è suscettibile di modifiche (ad esempio, l&#39;uso di matrici diverse ECM, diverse linee di cellule di cancro, o target diverso cells), se ciò, è importante notare che diverse condizioni sperimentali devono prima essere ottimizzati. Ad esempio, prima di iniziare studi di invasione sferoide, il numero ottimale di cellule tumorali / piastra CIM bene dovrebbe innanzitutto essere determinata mediante saggio del numero di cellule titolazioni in coltura monostrato. Il numero ottimale di sferoidi da utilizzare per ben si basa quindi su questa analisi. Ad esempio, nel metodo corrente, sferoidi comprendono circa 3.000 cellule ogni momento della generazione. Se iniziali numero di cellulare titolazioni indicano che 30.000 cellule in monostrato sono ottimali per il rilevamento nell&#39;invasione analisi, poi 10 sferoidi sono aggiunti per piastra CIM bene. Inoltre, per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura, è importante studiare i comportamenti del &#39;bersaglio&#39; monostrato cellulare separatamente al fine di determinare se queste cellule sono intrinsecamente invasiva, in quanto ciò potrebbe confondere i risultati. Nell&#39;esempio mostrato, sferoidi tumorali sono placcati su di un Monola cella LP9yer, con e senza FBS aggiunto in fondo così come un chemoattractant. In parallelo, le cellule vengono coltivate LP9 soli, sotto ogni condizione di trattamento. Analogamente, quando si studia la capacità invasiva delle cellule e sferoidi, è anche importante esaminare le loro capacità migratorie e per distinguere i due comportamenti (cioè invasione richiede la digestione proteolitica di una barriera ECM mentre la migrazione non). Per fare questo, omettere la barriera ECM (Passi 3.1.1 - 3.1.3) e condurre il test in parallelo con la barriera ECM in luogo. Quest&#39;ultima misura &#39;invasione&#39; può essere corretto al precedente provvedimento &#39;migrazione&#39;, se lo si desidera. Infine, è importante notare che le informazioni ottenute dalle misure di impedenza elettrica non sono complete: una volta cellule hanno invaso nella camera inferiore, cambiamenti nella loro attaccamento, la diffusione, la proliferazione e sul lato inferiore della membrana possono contribuire ai cambiamenti rea impedenzaammaccature. Pertanto, questa metodologia è più informativa se usato in combinazione con altri saggi di redditività sferoide cellulare, l&#39;adesione, la migrazione e la morfologia al fine di valutare complessivamente comportamenti delle cellule sferoidali. Ad esempio, idealmente, al fine di comprendere appieno le interazioni sferoidali-mesoteliale, co-culture separate dovrebbero essere ripreso periodicamente al microscopio a fase standard in modo che le valutazioni qualitative della sferoide morfologia e la salute possono essere effettuate in parallelo con saggi RTCA quantitativi di invasione. Se viene eseguita la fase di etichettatura facoltativa, poi i comportamenti delle singole cellule tumorali possono essere determinate mediante microscopia a fluorescenza come disgregano dal sferoide e interagiscono con le cellule mesoteliali non marcati. Un ulteriore vantaggio di etichettatura fluorescenza delle cellule tumorali quando co-coltura con un secondo tipo di cellule è che è poi possibile confermare che solo le cellule tumorali hanno invaso le barriere cellulari ed ECM. <p class="jove_content"&gt; In sintesi, questo metodo rappresenta un elevato throughput analisi quantitativa di cancro ovarico sferoide invasione delle barriere mesoteliali e ECM. Attraverso l&#39;aggiunta di citochine esogene, fattori di crescita, o inibitori specifici verso le camere superiori o inferiori della piastra CIM così, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e barriere Matrix oltre tempo.

Il cancro ovarico ha il più alto tasso di mortalità di tutti i tumori ginecologici 1. In tutto il mondo, ci sono ~ 230.000 casi e 100.000 decessi dovuti alla malattia ogni anno 1. La maggior parte dei pazienti (&gt; 75%) sono diagnosticati dopo che il cancro si è già metastatizzato, quando il trattamento è ulteriormente complicata da una maggiore resistenza alla chemioterapia e la prognosi è infausta 2. I pazienti con stadio III-IV malattia metastatica hanno 5 anni i tassi di sopravvivenza di solo il 30-40% 3. Pertanto, vi è una necessità urgente di una migliore comprensione dei comportamenti cellulari alla base metastasi del cancro ovarico per trattare efficacemente la malattia avanzata. L&#39;attuale modello di metastasi del cancro ovarico propone diverse fasi nel processo metastatico, ciascuno dei quali si verifica in un microambiente distinto che incide sul comportamento del tumore. Metastatico delle cellule tumorali ovariche inizialmente cadono dal sito del tumore primario e sopravvivere in un nonadherstato ent nel fluido peritoneale come singole cellule o strutture multicellulari tridimensionali, definito aggregati multicellulari o sferoidi 2,4,5. Le cellule che non fanno sferoidi in sospensione sono più suscettibili a anoikis 2,4,5. Sferoidi esibiscono anche una maggiore resistenza a chemioterapici, contribuendo alla malattia residua e successiva ricorrenza del cancro 2,4,5. Un secondo passo fondamentale nella metastasi del cancro ovarico è il passaggio di aggregati da cluster free-floating ai tumori secondari stabiliti all&#39;interno della parete peritoneale e omento 5,6. Interazioni cellula-cellula e cellula-substrato sono stati implicati nella formazione di aggregati, la sopravvivenza e l&#39;adesione alla matrice extracellulare (ECM) prodotta dal rivestimento mesoteliali del peritoneo 4-11. Al momento, questi processi sono poco conosciuti. Per definire i meccanismi coinvolti nella diffusione dei tumori ovarici, sferoidi possono essere generATED da linee cellulari di cancro stabiliti con metodi di coltura non aderenti, mantenendo le cellule in sospensione o aggiungendo metilcellulosa ai terreni di coltura 12,13 o coltivando cellule su piastre basso attaccamento 2,14. Quando coltivate in questo modo, le cellule tumorali ovariche assemblano in aggregati multicellulari o sferoidi che presentano analoghe proprietà cellulari, molecolari e biochimici a quelli degli aggregati tumorali presenti in vivo 2,14. Dopo la formazione, sferoidi possono essere successivamente raccolti dal mezzo nonadherent e ripiastrate su una varietà di superfici solide per ulteriori studi funzionali. Questo rappresenta un progresso rispetto saggi in coltura monostrato, che non modellare accuratamente i comportamenti di cellule tumorali ovariche metastatizzanti all&#39;interno di un ambiente nonadherent come fluido intraperitoneale. La capacità invasiva delle sferoidi tumorali può essere valutata in saggi endpoint tradizionali Boyden camere 2 </sup&gt;, ma questo approccio può essere fuorviante, come l&#39;invasione delle cellule di cancro ovarico è un processo dinamico nel tempo. Un metodo real-time recente è stato ideato utilizzando time-lapse video microscopia della clearance cellule mesoteliali invadendo sferoidi tumorali ovariche 15,16; Tuttavia, l&#39;analisi di dati time lapse richiede tempo e può essere personale. Qui, una rapida, metodo quantitativo per valutare i comportamenti invasivi di sferoidi tumorali ovariche in tempo reale è descritto. In primo luogo, un modello cellulare sferoide-mesoteliali è stato stabilito che rappresenta la fase di metastasi del cancro ovarico quando sferoidi multicellulari attaccarsi e invadere il rivestimento peritoneale a formare tumori secondari. Poi metodologia per un analizzatore in tempo reale cellulare (RTCA, vedere la tabella Materiali per i dettagli dell&#39;azienda) è stato adattato per condurre quantitativi reali misure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi e testati in questo modello. Nel RTCA instrumento, risposte cellulari vengono monitorati in continuo nel corso di un saggio, senza la necessità di etichette esogeni, da variazioni di impedenza elettrica di misura. Piastre di coltura appositamente progettati hanno microelettrodi oro rivestite situati sotto una membrana microporosa all&#39;interfaccia tra le camere superiori e inferiori di un 2 concamerate bene (piastre «CIM»). La posizione degli elettrodi nella camera inferiore consente la misurazione delle variazioni di impedenza elettrica come cellule invadono attraverso un ECM o ECM / barriera cellulare. L&#39;interfaccia membrana tra le 2 camere di ciascuna piastra CIM bene viene dapprima rivestito con il componente ECM di interesse. Nel sistema modello cellulare sferoide-mesoteliali, l&#39;interfaccia è rivestita con uno strato di Matrigel (vedere la tabella Materiali per i dati aziendali), per imitare il complesso ECM sottostante il rivestimento mesoteliali del peritoneo, seguito da un monostrato confluente di mesoteliali umano &#39; &quot;cellule bersaglio. Infine, preformati sferoidi tumorali ovariche sono annuncided. Cellule sferoidali cancro ovarico devono invadere attivamente attraverso lo strato di cellule bersaglio e la matrice per raggiungere la camera inferiore e alterare le letture di impedenza elettrica. Cellule bersaglio in proprio sono valutati anche per garantire che essi non invadono attraverso lo strato di matrice e sono adatti per l&#39;uso in questo saggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Tumori ovarici metastasi versando nel liquido peritoneale e disperdendo ai siti distali all&#39;interno del peritoneo. Colture monostrato non modellare accuratamente i comportamenti delle cellule tumorali in un ambiente non aderente, come le cellule tumorali intrinsecamente aggregano in strutture multicellulari che contribuiscono al processo metastatico legandosi e invadendo il rivestimento peritoneale di formare tumori secondari. Per modellare questa importante fase di metastasi del cancro ovarico, aggregati multicellulari, o sferoidi, possono essere generati da linee cellulari di carcinoma ovarico istituiti conservato in condizioni non aderenti. Per simulare il microambiente peritoneale incontrato dalle cellule tumorali in vivo, un modello di co-coltura sferoide-mesoteliali stato stabilito in cui preformate sferoidi sono placcati su di un monostrato di cellule mesoteliali umano, formata su una barriera matrice extracellulare. Metodi sono stati poi sviluppati utilizzando un analizzatore di cella in tempo reale per condurre reale quantitativamisure di tempo della capacità invasiva delle differenti linee di cellule di cancro ovarico coltivate come sferoidi. Questo approccio consente la misura continua di invasione per lunghi periodi di tempo, che ha diversi vantaggi rispetto saggi endpoint tradizionali e analizza immagine microscopia tempo reale più laborioso. In breve, questo metodo permette una rapida determinazione dei fattori che regolano le interazioni tra cellule ovariche sferoidali cancro invasione attraverso mesoteliali e matrice ostacoli nel tempo.

Sferoidi tumorali ovariche possono essere generati da molti tipi di linee cellulari da loro coltura in sospensione o per la raccolta delle cellule tumorali primarie da ascite maligna 2,14. Qui due linee cellulari epiteliali cancro ovarico, OVCA433 e OVCA429, e una linea tumorale delle cellule della granulosa ovarica, KGN, sono stati utilizzati per generare sferoidi (Figura 1A). In questo metodo, le cellule sono coltivate in pozzetti fondo a U mentre sospeso in media che è stato fatto viscoso con l&#39;aggiunta di metilcellulosa. In queste condizioni, molte cellule tumorali ovariche presentano una capacità intrinseca di aggregare per formare sferoidi 13. Seguendo coltura durante la notte sospesa in metilcellulosa / media, tutte e tre le linee cellulari formate strutture sferoidali compatte di circa 400-500 micron di diametro (Figura 1A). Nel frattempo, la piastra RTCA CIM viene preparato, dapprima rivestendo l&#39;interfaccia membrana porosa con matrice e poi un monostrato confluente di mes umanicellule othelial (figura 1b). Una volta formate, sferoidi sono poi trasferiti alla piastra CIM preparato. Sferoidi tumorali prelevate vengono piastrate in cima al monostrato LP9 e valutati come descritto di seguito. Immagini al microscopio di fase standard (o al microscopio a fluorescenza, se la fase di marcatura delle cellule è stata seguita opzionale) di colture parallele sono periodicamente prelevati a favorire l&#39;interpretazione dei dati RTCA (Figura 1C). È informativo per valutare sia il livello basale di invasione di una linea cellulare di cancro, nonché invasione chemoattractant indotta. Tipicamente, invasività basale viene misurata mediante l&#39;aggiunta di SFM ad entrambe le camere superiore ed inferiore. Mezzi completi (10% FBS), che contiene molti potenziali fattori chemiotattici, viene utilizzato nell&#39;esempio corrente di esaminare &#39;chemiotattico indotto&#39; invasione (Figura 2). Studi paralleli di LP9 sole cellule mesoteliali hanno confermato che queste cellule sono minimamente ininvasiva oltre 2 giorni sotto sia basale o &#39;chemoattractant&#39; condizioni indotte e quindi erano un buon tipo di cellule da utilizzare in saggi di co-coltura con cellule di cancro ovarico (Figure 2A e 2B). Al contrario, sferoidi tumorali ovariche generati utilizzando una qualsiasi delle tre linee cellulari esposte la capacità di invadere verso un chemiotattico (FBS) (Figure 2A-2C). Il principale vantaggio di utilizzare gli strumenti in tempo reale RTCA oltre saggi endpoint tradizionali è che i cambiamenti nel comportamento delle cellule / sferoide possono essere quantificati nel corso del tempo. Sopra il test 2 giorni, la KGN, OVCA429, e linee cellulari OVCA433 tutti esposti la capacità di invadere verso un chemiotattico (indicato aumentando indici cellulari) ma bassi livelli basali di invasione (Figura 2C). Le linee cellulari esposte tassi simili di invasione, come indicato dalle piste parallele delle curve (Figura 2C); Tuttavia, la curva OVCA429 esposto un elevato asintoto superiore,che ha indicato un livello massimo superiore di invasione rispetto alle altre linee cellulari. Inoltre, le linee cellulari esposte differenze nei loro tempi di insorgenza di invasione, con le cellule KGN invadere rapidamente le cellule e matrice barriere e la OVCA433 e OVCA429 cellule prendono 3-5x più di invadere rispettivamente (Figura 2D). È importante sottolineare che i loro comportamenti allo scoppio della invasione non sono risultati predittivi della loro capacità complessiva di invasione (Figure 2C e 2D). Ciò suggerisce diverse capacità intrinseche delle linee cellulari del cancro ma anche può indicare che diversi fattori possono disciplinare precoci e tardivi comportamenti invasivi di sferoidi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 generazione Spheroid e il modello sperimentale di impostare una:.. Homaghi sotto microscopio a contrasto di fase sferoidi formando in metilcellulosa / media (in alto) e della linea cellulare di corrispondenza cresciuto come un monostrato (in basso) B:. schematico che mostra il RTCA 2 camerata piastra CIM ben impostato, in cui preformato cancro ovarico sferoidi sono placcati su di un monostrato di un LP9 mesoteliali strato / barriera matrice nella camera superiore e supporti ± FBS come fattore chemiotattico è aggiunto alla camera inferiore. Elettrodi sotto l&#39;interfaccia del provvedimento 2 camere crescente impedenza elettrica come più cellule invadono le barriere al minor camera C:. Immagini di sferoidi KGN sulla parte superiore del monostrato LP9 al microscopio a contrasto di fase (sinistra) o microscopia a fluorescenza (a destra). Barre di scala = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> .. Figura 2 in tempo reale i dati ovarico sferoide cancro invasione A - B: risultati rappresentativi da un&#39;invasione test RTCA condotta con e senza FBS nella camera di fondo di un piatto CIM bene. Invasione delle cellule KGN viene confrontato con cellule mesoteliali LP9. I risultati sono mostrati come media ± SD cellulare Indice dai pozzi triplice copia agli hr timepoint 24 (A) e oltre un intero periodo di test due giorni (B) C - D:. Un confronto tra la capacità invasiva delle KGN, OVCA429, e la cella OVCA433 linee raffigurati nelle 24 ore (C) e in modo più dettagliato in un periodo di tempo 2,5 hr (D).

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Views.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico. 

Video: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Ricerca

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...