Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere 1K22AI097291-01 e dal Centro Nazionale per l&#39;avanzamento delle Scienze di traslazione del National Institutes of Health sotto Premio Numero UL1TR000433. Riconosciamo inoltre Prof. Darrell Irvine al MIT e il Prof. Matthias Stephan Fred Hutchinson Cancer Center per il loro contributo al lavoro iniziale sulle nanoparticelle vaccino e OT-I / Luc topi transgenici.

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Università sull&#39;uso e la custodia degli animali (UCUCA) presso l&#39;Università del Michigan ed eseguito secondo le politiche e le linee guida stabilite. 1. Sintesi e caratterizzazione di ICMVs Co-caricato con proteine ​​antigene e adiuvante Molecole <ol><li> Mescolare 1: 1 rapporto molare di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) in cloroformio, mantenendo la quantità totale di lipidi a 1,26 mmol per batch (cioè, 500 mg di DOPC e 630 pg di MPB) in una fiala di vetro da 20 ml (diametro = 28 mm e altezza = 61 mm). </li><li> Aggiungere farmaci lipofili, come monofosforil lipide A (MPLA) o coloranti lipofili (ad esempio, DID), alla soluzione lipidica a concentrazione desiderata. Rimuovere accuratamente il solvente organico da spurgo con nitroge extra dryn gas e ponendo i campioni sotto vuoto O / N. </li><li> Idratare il film lipidico aggiungendo 200 ml di 10 mM bis-tris propano (BTP, pH 7.0) contenente idrosolubili farmaci (ad esempio, antigeni proteici). Vortex per 10 sec ogni 10 min per 1 ora a RT. </li><li> Trasferire il contenuto della fiala di vetro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, posto i campioni in un bagno di acqua e ghiaccio, e sonicare continuamente per 5 minuti con l&#39;impostazione su una 125 W / 20 kHz sonda punta sonicatore intensità del 40%. </li><li> Aggiungere 4 ml di ditiotreitolo 150 mm (DTT) per ogni lotto (Concentrazione di impiego 2,4 mm), vortex e centrifugare brevemente con una microcentrifuga da tavolo. </li><li> Aggiungere 40 ml di 200 mM CaCl 2 e mescolare con la pipetta (Concentrazione di impiego 33 mm). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora per permettere la reticolazione di MPB contenenti strati lipidici con DTT. </li><li> Campioni centrifugare a 20.000 g per 15 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in 200 ml di ddiH 2 O. </li><li> Ripetere il passaggio 1.7 e centrifugare di nuovo dopo il secondo ddiH 2 O lavaggio per rimuovere CaCl 2, che non ha reagito DTT, e materiali di carico non incapsulate dal surnatante. </li><li> Preparare 10 mg / ml di 2 kDa polietilenglicole-tiolo (PEG-SH) in ddiH 2 O. Risospendere ogni campione ICMV in 100 ml di soluzione di PEG-SH e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Eseguire due ddiH 2 O lavaggi (passo 1,7) e risospendere il pellet ICMV finale in PBS e conservare a 4 ° C. Prima dell&#39;uso, mescolare la sospensione ICMV, come particelle possono depositarsi sul fondo dopo una conservazione prolungata. </li><li> Per la caratterizzazione di particelle, rimuovere una piccola aliquota (~ 10%) di ICMVs da ogni lotto e diluire singolarmente in un volume totale di 1 ml di ddiH 2 O. Mettere un unico campione in una dimensione Zetasizer cellulare e misura delle particelle, indice di polidispersità, e il potenziale zeta dei campioni con un sistema di misura e DLS potenziale zeta (secondo il protocollo del produttore). </li></ol> 2. Esame del linfonodo drenante di ICMVs fluorescenza-etichettato con Microscopia confocale <ol><li> Preparazione di ICMVs caricato con l&#39;antigene fluoroforo marcatura ed colorante fluorescente lipofile <ol><li> Preparare proteina fluoroforo-tag, come ovalbumina reagito con Alexa Fluor 555-succinimidile estere, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Per preparare ICMVs taggati con fluoroforo nella shell di lipidi, aggiungere colorante fluorescente lipofile, (ad esempio, 1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante la preparazione del film lipidico (Step 1.2) al 0,05% dell&#39;importo di lipidi molare. Per lipidi idratazione pellicola (Step 1.3), tampone uso contenente antigene fluoroforo-tag, e completa la sintesi ICMV come indicato dal passo 1,4-1,11. </li></ol></li><li> La somministrazione sottocutanea di nanoparticelle a base di coda <ol><li> Anestetizzare mouse usando un vaporizzatore flusso controllato dotato di una camera di induzione urazie 3% isoflurano e 1.5 L / min di flusso di ossigeno secondo un protocollo approvato IACUC animale. Una volta che il mouse è inconscia, effettuare le seguenti operazioni rapidamente prima dell&#39;anestesia indossa off per consentire l&#39;accesso ottimale al sito di iniezione e minimizzare il disagio per l&#39;animale. In alternativa, utilizzare un adeguato cono adatto per mantenere l&#39;anestesia. Se i topi vengono anestetizzati per più di 5 minuti, applicare lubrificante necessario per ridurre al minimo l&#39;irritazione degli occhi dopo la procedura. </li><li> Spruzzare la base della coda con il 70% di etanolo per disinfettare e bagnare la parte pelliccia capelli bagnati evidenziare una piccola zona di pelle visibile, che può essere usato per visualizzare l&#39;ago sotto la pelle. </li><li> Preparare sospensione iniettabile contenente particelle desiderata quantità di antigene e adiuvante per 100 ml di dose vaccinale in PBS (es, 10 mg e 0,3 mg OVA MPLA per 100 ml di dosaggio di iniezione è stato utilizzato in passato 6,9). </li><li> Disegnare il int sospensione di particellesiringa oa con un ago G 27-29 e inserire l&#39;ago alla base della coda (~ 5 mm dalla linea sottile) con lo smusso rivolto verso l&#39;alto e iniettare 50 ml di sospensione di particelle 22. </li><li> Attendere qualche secondo per la pressione di pareggiare per evitare un eccessivo riflusso ed estrarre l&#39;ago. Ripetere l&#39;iniezione sul lato opposto della base della coda di indirizzare entrambi drenanti LNs inguinali. </li></ol></li><li> Preparazione di criosezioni linfonodali e l&#39;esame con la microscopia confocale. <ol><li> Euthanize il mouse con CO 2 asfissia seguita da pneumotorace indotta secondo un protocollo approvato IACUC animale. Estrarre LNs inguinali secondo il protocollo dimostrato in Bedoya 23 e lavare il sangue ponendo i tessuti in 1 ml di 4 ° C PBS. </li><li> Assorbire il PBS dai tessuti con i tessuti e posizionare il tessuto in cryomolds tessuto (10 x 10 x 5 mm 3) pre-riempita fino all&#39;orlo con ottobre congelamento media 24. Snap congelare il tiscitare blocco in azoto liquido per 30 sec. In alternativa, posizionare blocco tessuto in ghiaccio secco per 30 min. Conservare tessuti congelati in -80 ° C freezer. </li><li> Tagliare sezioni di tessuto di spessore 5-10 micron di un criostato fissato a -20 ° C 24. </li><li> Se necessario, eseguire l&#39;etichettatura immunofluorescenza, ed esaminare il tessuto con la microscopia confocale come precedentemente dimostrato 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoraggio espansione di antigene-specifica, luciferasi che esprimono CD8 + cellule T dopo nanoparticelle vaccinazione con Whole Animal Imaging <ol><li> Isolamento di OVA 257-264 -specific, le cellule-luciferasi che esprimono CD8 + T da OT-I / Luc topi transgenici <ol><li> Eutanasia di un topo transgenico OT-I / Luc con CO 2 asfissia e indurre un pneumotorace secondo un protocollo approvato IACUC animale. Raccolto milza in modo sterile accedendo cavità peritoneale e staccare il tessuto dal pancreas 23 accuratamente, eposto in 5 ml di 4 ° C PBS + 2% FBS per trasferimento a cappa coltura tissutale. </li><li> Posizionare la milza su un nylon colino 70 micron su un 50 ml conica tubo da centrifuga (fino a 3 milze alla volta). Utilizzando un pistone da una siringa da 3 ml, macinare le cellule attraverso il filtro. </li><li> Lavare il pistone e il filtro con PBS + 2% FBS e scartare. Portare il volume totale di 10 ml / milza nel tubo 50 ml, prelevare un piccolo campione della sospensione cellulare a contare con un emocitometro e centrifugare per 10 min a 300 x g. </li><li> Utilizzando un kit magnetico selezione negativa in commercio, isolare la popolazione di cellule T CD8 +, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo aver lavato le cellule con PBS, contare il numero di isolate cellule T CD8 +. Per valutare la purezza delle isolate cellule T CD8 +, incubare ~ 20.000-30.000 cellule in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per 10 minuti, quindi aggiungere 20 ml di anticorpi αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubare per 30 min. Perform tutte le incubazioni a 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Eseguire l&#39;analisi di citometria di flusso 25. </li></ol></li><li> Trasferimento adottivo di isolate cellule T CD8 + e la visualizzazione della loro vaccinazione posto espansione <ol><li> Eseguire trasferimento adottivo di cellule isolate OT-I / Luc CD8 + T in naive C57BL / 6 topi somministrando 1-10 × 10 5 cellule in un volume di 200 microlitri di PBS via endovenosa coda vena 22 (giorno -1). Considerando che in pelliccia e pelle nera patch in topi C57BL / 6 può interferire con il segnale bioluminescente, albini rasato C57BL / 6 topi sono l&#39;ideale per questi studi. </li><li> Dopo una giornata (giorno 0), somministrare il vaccino, come descritto in precedenza (paragrafo 2.2). </li><li> Somministrare 150 mg di luciferina per kg di peso corporeo per via intraperitoneale topo in un volume di 300 ml di PBS. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con isoflurano (come al punto 2.2.1) e visualizzare le cellule OT-I / Luc CD8 + T con l&#39;acquisizione del segnale di bioluminescenza per 5-10 min wesimo un intero sistema di imaging animale (IVIS, fare riferimento a Wilson 26 per istruzioni dettagliate). Ripetere se necessario per studi longitudinali. </li></ol></li></ol> 4. Peptide-MHC Tetramero colorazione di PBMC per l&#39;analisi di Antigen-specific cellule T CD8 + Nota: La seguente procedura di protocollo può essere effettuata sia utilizzando i topi C57BL / 6 adoptively trasferiti con cellule OT-I / Luc CD8 + T o C57BL / 6 topi senza il trasferimento adottivo. <ol><li> In un punto di tempo desiderato dopo la vaccinazione, raccogliere circa 100 ml di sangue (4-6 gocce) di topi tramite sottomandibolare tecnica sanguinamento 27 in un tubo rivestito di K 2 EDTA e capovolgere più volte per impedire la coagulazione. </li><li> Trasferire 100 ml di sangue in una provetta, aggiungere 1 ml di tampone di lisi, e incubare per 2-3 minuti per rimuovere i globuli rossi (RBC). Campioni di centrifugazione per 5 min a 1500 xg e rimuovere il surnatante. Se il pellet ancorappears rossi (che indicano la rimozione incompleta di globuli rossi), ripetere il passo lisi con una breve incubazione (&lt;1 min) di tampone di lisi. </li><li> Lavare le rimanenti PBMC con 1 ml di tampone FACS (PBS + 1% w / v BSA) e centrifugare a 1500 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il campione in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per bloccare il legame degli anticorpi specifici e FCR-mediata. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le cellule da microprovette in 4 ml tubi FACS con fondo arrotondato. Aggiungere 20 ml di H-2K b soluzione OVA Tetramero-SIINFEKL-PE secondo le specifiche del costruttore per ogni campione e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Preparare il cocktail di anticorpi (ad esempio, αCD8-APC, αCD44-FITC e αCD62L-PECy7 anticorpi (0.005, 0.005, e 0.002 mg / ml di concentrazione, rispettivamente)). Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione sperimentale, e incubare per 20 min in ghiaccio. Preparare controlli singoli fluorofori per labeling cellule con ogni tetramero fluoroforo-tag o anticorpi alla concentrazione sopra indicato. </li><li> Lavare 2 volte con tampone FACS e risospendere il pellet finale in tampone FACS contenente 2 mg / ml di DAPI. Le cellule sono ora pronti per citometria a flusso di analisi (dettagli ed esempi possono essere trovati in Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer a condizione che il costo di produzione sostenuti durante la pubblicazione di questo articolo.

Il protocollo fornito in questo articolo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un nuovo sistema di nanoparticelle a base lipidica, chiamato ICMVs, e fornisce il processo di convalida dell&#39;efficacia delle formulazioni di vaccino a base di nanoparticelle di indurre risposte delle cellule CD8 + T antigene-specifiche. Sintesi ICMV si completa in tutte le condizioni acquosa, che è un importante vantaggio rispetto ad altri sistemi comunemente utilizzati polimerici nanoparticelle (ad esempio, poli (lattid...

Sviluppo di un vaccino tradizionale è principalmente impiegato l&#39;approccio empirico di tentativi ed errori. Tuttavia, con il recente sviluppo di una vasta gamma di biomateriali e scoperta di determinanti molecolari di attivazione immunitaria, è ora possibile progettare razionalmente formulazioni di vaccino con spunti biofisici e biochimici derivati ​​da agenti patogeni 1,2. In particolare, diverse piattaforme di distribuzione di droga di particolato sono stati esaminati come portatori di vaccini in quanto possono essere co-caricati con antigeni subunità e agenti immunostimolanti, proteggere i componenti del vaccino dal degrado, e migliorare la loro co-consegna all&#39;antigene cellule presentanti (APC) residente in linfa nodi (LNS), massimizzando in tal modo la stimolazione immunitaria e l&#39;attivazione 3-5. In questo rapporto, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle &quot;-patogeno imitando&quot;, chiamato interbilayer reticolato vescicole multilamellari (ICMVs), che sono stati precedentemente dimostrato come platfor potente vaccinom per lo scatenamento di robusta linfociti T citotossici (CTL) e le risposte immunitarie umorali in entrambi i compartimenti sistemiche e delle mucose 6-9. In particolare, la vaccinazione con ICMVs ottenuti in sostanzialmente migliorata livelli di IgG sieriche contro un antigene della malaria, in confronto con la vaccinazione con adiuvanti convenzionali (ad esempio, allume e Montanide) 7 e anche suscitato risposte CTL potenti contro le cellule tumorali e modelli sfida virali nei topi 9. Qui, utilizzando ICMVs come sistema di nanoparticelle modello di vaccino, si descrivono i metodi per la caratterizzazione di vaccini nano-formulazioni, tra cui le dimensioni delle particelle e le misure di potenziale zeta e il monitoraggio del traffico di particelle per LNs drenanti (dLNs) utilizzando confocale dei tessuti cryosectioned 7. Inoltre, vi presentiamo un metodo basato imaging intero animale di analizzare l&#39;espansione delle risposte CTL nei topi dopo il trasferimento adottivo di antigene-specifiche cellule T CD8 +-luciferasi che esprimono 9,10. Infine, describa tetramero colorazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per la quantificazione longitudinale risposte delle cellule T endogene nei topi vaccinati con nanoparticelle 6,9. ICMVs sono una formulazione di nanoparticelle a base lipidica sintetizzata da fusione controllata di liposomi multilamellari semplici in strutture, che vengono poi stabilizzati chimicamente mediante gruppi di testa di fosfolipidi maleimmide-funzionalizzati reticolanti all&#39;interno di strati lipidici con ditiolo reticolanti 6. Una volta che sono sintetizzati ICMVs, una piccola frazione di nanoparticelle può essere utilizzata per determinare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta (cioè, carica superficiale di particelle) con un sistema di dispersione dinamica della luce (DLS) e un analizzatore di potenziale zeta. DLS misura le variazioni nella diffusione della luce in sospensioni di particelle, permettendo la determinazione del coefficiente di diffusione e la dimensione idrodinamica delle particelle 11. Il raggiungimento di dimensioni coerente delle particelle da lotto a lotto sintesi è fondamentaledal momento che la dimensione delle particelle è uno dei principali fattori che influenzano drenaggio linfatico di particelle di vaccini per dLNs e la successiva captazione cellulare da APC 12,13. Inoltre, il potenziale zeta può essere ottenuto misurando la velocità della particella quando viene applicata una corrente elettrica, che permette di determinare la mobilità elettroforetica di particelle e superficie delle particelle di carica 11. Assicurare coerenti valori di potenziale zeta delle particelle è importante poiché carica superficiale delle particelle determina stabilità colloidale, che ha un impatto diretto sulla dispersione di particelle durante la conservazione e dopo somministrazione in vivo 14,15. Al fine di monitorare la localizzazione delle particelle di dLNs, ICMVs possono essere etichettati con fluorofori desiderati incluse tinture lipofile e antigeni covalente-tag. A seguito di vaccinazione, i topi possono essere sacrificati in vari momenti, dLNs asportato, cryosectioned, e analizzati con microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione di Drai linfaticaning di entrambi i vettori di vaccino nanoparticelle e antigene dLNs. Le sezioni di tessuto possono inoltre essere marcate con fluorescenza etichettati anticorpi e utilizzati per ottenere ulteriori informazioni, come i tipi di cellule associate con l&#39;antigene e formazione di centri germinali come abbiamo mostrato in precedenza 7. Una volta che la sintesi delle particelle è ottimizzata e la tratta ai dLNs è confermato, è importante per convalidare elicitation in vivo espansione CTL. Al fine di analizzare scatenamento di cellule antigene-specifiche T CD8 + in risposta alla vaccinazione delle nanoparticelle, abbiamo utilizzato un modello di antigene ovalbumina (OVA), con OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) immunodominante epitopi delle cellule T CD8 +, che permette analisi dettagliate immunologici di risposte delle cellule T antigene-specifiche per iniziale 16,17 lo sviluppo di vaccini. In particolare, per interrogare le dinamiche di espansione e la migrazione delle cellule antigene-specifiche CD8 + T, abbiamo generato undoppio modello di topo transgenico incrociando lucciola luciferasi che esprimono topi transgenici (Luc) con OT-I topi transgenici che possiedono le cellule CD8 + T con recettore delle cellule T (TCR) specifico per SIINFEKL (in associazione con H-2K b). Da questi topi OT-I / Luc, luciferasi che esprimono, le cellule OT-I T CD8 + possono essere isolati e preparati per il trasferimento adottivo in naïve topi C57BL / 6. Una volta seminato, l&#39;immunizzazione con successo nanoparticelle-OVA contenente comporterà l&#39;espansione delle cellule T trasferiti che possono essere monitorati dal monitoraggio del segnale bioluminescenza con un intero sistema di imaging 9,10 animale. Questa tecnica di imaging corpo intero non invasiva è stato usato con altri antigeni virali o tumorali in passato 18-20, processi di espansione delle cellule T nei tessuti linfoidi e diffusione ai tessuti periferici in modo longitudinale rivelare. Complementare all&#39;analisi di adoptively cellule T CD8 + antigene-specifici trasferiti, endogenole risposte delle cellule T a noi dopo la vaccinazione può essere esaminata con il complesso peptide-maggiore di istocompatibilità (MHC) test tetramero 21, in cui un complesso tetramero peptide-MHC, composta da quattro MHC di classe fluoroforo-tagged molecole I caricato con epitopi peptidici, è impiegato di legare TCR ed etichettare le cellule T CD8 + in modo antigene-specifica. Il test tetramero peptide-MHC può essere effettuata sia in studi della necroscopia terminali per identificare le cellule CD8 + T antigene-specifiche in linfoidi e tessuti periferici o in studi longitudinali con le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti da sangue di serie pareggi. Dopo la colorazione linfociti con peptide-MHC tetramero, citofluorimetria analisi viene eseguita per analisi dettagliate sul fenotipo di CTL o la quantificazione della loro frequenza tra cellule T CD8 +.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

I passi necessari per la sintesi di ICMVs sono illustrati in Figura 1 6. In breve, un film lipidico contenenti farmaci lipofili o coloranti fluorescenti è idratata in presenza di farmaci idrofili. Cationi divalenti, quali Ca 2+, si aggiungono a guidare fusione dei liposomi anionici in vescicole multilamellari. Ditiolo crosslinker, come DTT, è aggiunto il &quot;fiocco&quot; lipidi maleimmide-funzionalizzati su apposing strati lipidici, e, infine, rimanendo gruppi maleimmide estern...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

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JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Views.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Video: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Determinazione quantitativa simultanea delle anti-vettore e Anti-transgene-Specific CD8+ T cellule tramite MHC I tetramero colorazione dopo la vaccinazione con un vettore virale

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Un test di citometria a flusso basato su DNA / Ki67 per l'analisi del ciclo cellulare di cellule T CD8 antigene-specifiche in topi vaccinati

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...