Il nostro protocollo fornisce un approccio pratico con cui la milza e i linfonodi del topo possono essere utilizzati per riflettere la dinamica della risposta delle cellule T maggiore rispetto a fornire un'istantanea fenotipica allo stato stazionario. La nostra tecnica rileva sensibilmente le cellule T CD8 antigene-specifiche che sono impegnate in una risposta continua. Le cellule T CD8 proliferanti vengono misurate senza i possibili effetti confondenti del trattamento farmacologico in vivo o del trasferimento cellulare.
La nostra tecnica può fornire una finestra sulla dinamica immunitaria in diversi contesti. Ad esempio, in relazione alla risposta alla vaccinazione e alle infezioni, alle malattie autoimmuni e all'immunoterapia del cancro. Preparare un tampone di lavaggio fresco 1x permeabilizzazione diluendo 10x tampone di permeabilizzazione con acqua distillata e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri per eliminare gli aggregati.
Anticorpo monoclonale diluito Ki67 FITC in tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x come determinato con un esperimento di titolazione per un volume finale di 100 microlitri per campione. Aggiungere 3 millilitri del tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x a ciascun tubo con celle e centrifugare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
Ancora una volta, aggiungere il tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x e la centrifuga per pellettare le celle. Quindi, scartare il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo monoclonale diluito Ki67 FITC al pellet, quindi vortice e incubare per 30 minuti al buio.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 4 millilitri di 1x tampone di permeabilizzazione, centrifugando dopo ogni lavaggio e scartare il surnatante. Aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da acquisire direttamente al citometro a flusso e 250 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da incubare con Hoechst per la colorazione del DNA. Preparare la soluzione di Hoechst e PBS e aggiungerla a ciascun campione in modo che la concentrazione finale sia di due microgrammi per millilitro.
Vortice e incubare i campioni per 15 minuti al buio. Quindi, centrifugare i campioni per cinque minuti e aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet della cella. Aprire il software e creare diversi gruppi corrispondenti ai diversi organi da analizzare facendo clic su Crea gruppo "nella sezione della barra multifunzione dell'area di lavoro.
Aprire la finestra del gruppo modificato facendo doppio clic sul nome del gruppo e sincronizzare i gruppi appena creati inserendo un segno di spunta sulla funzione sincronizzata. Trascina ogni file FCS nel gruppo corrispondente, quindi crea una strategia di gating che inizia con il gruppo a-LN. Aprire la finestra del grafico facendo doppio clic sul campione completamente macchiato per visualizzare gli eventi non delegati acquisiti per il campione in un dot plot.
Si noti che gli assi x e y sono etichettati come nei file FCS, come indicato nella tabella due del file delle impostazioni del citometro a flusso di questo manoscritto. Verificare che venga visualizzato un numero sufficiente di eventi per una visualizzazione appropriata. Se necessario, aprire le preferenze facendo clic sull'icona a forma di cuore nella barra multifunzione dell'area di lavoro, selezionare Grafici, quindi Dot Plot"come tipo di grafico e verificare che il numero di punti disegnati nella casella corrispondente sia corretto o modificarlo.
Visualizzare gli eventi non delegati nella finestra del grafico in un dot plot con DNA-A sull'asse x e DNA-W sull'asse y. Utilizzate la scala lineare per entrambi gli assi. Se necessario modificare la scala da logaritmica a lineare cliccando sulla casella indicata con una T vicina ad ogni asse nella finestra del grafico.
Selezionate una singola popolazione di celle facendo clic su rettangolo nella sezione dello strumento gating, quindi fate doppio clic al centro del gate rettangolare per visualizzare le singole celle in un dot plot con il parametro FSC-A sull'asse x e lo stampo della cella morta sull'asse y. Fare clic sul poligono per selezionare la popolazione di cellule vive, che sono negative per la morte delle cellule morte. Fate doppio clic al centro del gate poligonale per visualizzare le celle in un dot plot con il parametro FSC-A sull'asse x e il parametro SSC-A sull'asse y.
Fai clic sul rettangolo e crea un cancello rilassato per includere tutte le singole celle vive in quel grafico. Fare doppio clic al centro del cancello rilassato per visualizzare le celle in un dot plot con CD3 sull'asse x e CD8 sull'asse y. Utilizzare la scala di accesso appropriata per la visualizzazione nella finestra del grafico.
Se necessario, modificare la scala x e y facendo clic sulla casella, indicata con una T vicino a ciascun asse, scegliere Personalizza funzione di accesso e modificare decenni neg extra con basi e decenni positivi se necessario. Selezionare le celle CD3+CD8+ facendo clic su poligono. Fate doppio clic al centro del gate CD3+CD8+ per visualizzare le celle in un dot plot con Tetr-gag sull'asse x e Pent-gag sull'asse y.
Selezionare le cellule T CD8 specifiche dell'antigene facendo clic su poligono. Fare doppio clic al centro del gate specifico del gag per visualizzare le celle in un dot plot con DNA-A sull'asse x e Ki67 sull'asse y. Selezionare le celle nelle diverse fasi del ciclo cellulare facendo clic su Quad"nella sezione dello strumento gating della finestra del grafico.
Copiare la strategia di gating creata in un campione nel gruppo corrispondente per applicare i gate a tutti i campioni del gruppo. Quindi copiare le strategie di gating per i gruppi b-milza e CBM, come descritto nel manoscritto del testo. Verificare che tutte le porte siano appropriate per ogni campione dei tre gruppi.
Se necessario, desincronizzare il gruppo e modificare le porte come descritto nel manoscritto. Visualizza le celle BM del cancello rilassato in un dot plot con DNA-A sull'asse x e Ki67 sull'asse y. Visualizza i risultati facendo clic su Editor layout nella sezione della barra multifunzione dell'area di lavoro.
Trascinate ogni gate della strategia di gating nel riquadro di esempio nell'editor di layout e posizionate i grafici in base alla sequenza del gating. Se necessario, modificare il tipo di grafico facendo doppio clic sul grafico corrispondente nel layout e selezionando il tipo appropriato nella finestra di definizione del grafico. Fare clic sul gruppo e iterare per funzioni sulla barra multifunzione del layout per visualizzare i risultati ottenuti in cellule T CD8 antigene-specifiche di ciascun organo e confrontare diversi campioni.
Visualizza i risultati delle cellule del midollo osseo che rappresentano un controllo positivo. Un tipico esempio di analisi del ciclo cellulare delle cellule del midollo osseo è mostrato qui. Il protocollo ha prodotto un basso coefficiente di variazione dei picchi di DNA da G0 a G1 e da G2 a M, indicando un'eccellente qualità della colorazione del DNA.
Una strategia di gating in cinque fasi è stata impiegata per identificare le cellule CD8 specifiche dell'antigene. Due multimeri sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità del rilevamento delle cellule T CD8 specifiche del vomito nei topi vaccinati senza aumentare lo sfondo di colorazione nei topi non trattati. Le cellule T CD8 specifiche del vomito nei linfonodi drenanti e nella milza contengono un'alta percentuale di cellule nelle fasi S-G2 / M al terzo giorno post boost.
Inoltre, le cellule T CD8 specifiche del gag nelle fasi S-G2 / M avevano un alto FSC-A e SSC-A quando sovrapposte alle cellule T CD8 totali dello stesso organo. Gli istogrammi offset hanno mostrato che l'espressione di CD62L da parte delle cellule T CD8 specifiche del gag era bassa, come previsto per le cellule T attivate, ad eccezione di alcune cellule in G0 nei linfonodi. Questo metodo è progettato per le cellule T per ottenere un'eccellente qualità della colorazione del DNA insieme alla membrana e alla colorazione Ki67.
L'analisi dei dati della citometria a flusso è un punto chiave. Assicurarsi di utilizzare un controllo appropriato per il posizionamento del cancello. Usando questo metodo, abbiamo scoperto le cellule T nelle fasi S-G2 / M del ciclo cellulare nel mouse e nel sangue periferico umano.
Questa tecnica è stata utile negli studi di immunomonitoraggio nel diabete di tipo 1, nella mononucleosi infettiva e nel COVID-19.
