This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC della Columbia University e le linee guida applicabili per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio sono stati seguiti. Nota: Preparare tutti i buffer utilizzati per le procedure ISH in acqua RNase-free o DEPC trattati. Questa raccomandazione non è strettamente necessario dopo ISH è stato completato, ma si suggerisce che buffer sono ancora preparati in acqua bidistillata autoclave e / o sterilizzati grazie al filtro. 1. Individuazione di ATF4 mRNA localizzata a colinergica assoni nel Adult mouse cervello utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) Seguito da immunoistochimica <ol><li> Preparazione del campione per le fette di cervello congelati paraformaldeide-fisso <ol><li> Per il seguente esempio, preparare le fette di cervello di topo congelati fissi. <ol><li> In breve, sacrifica 9 mesi di età i topi da anestesia con ketamina (100 mg kg -1 di peso corporeo) e xilazina (10 mg kg -1 corpo weigHT), seguita da un&#39;infusione transcardial del 4% paraformaldeide in PBS (pH 7,4). </li><li> Rimuovere cervelli e post-fix in paraformaldeide al 4% per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo la fissazione, lavare campioni tre volte in PBS e cryoprotect a 30% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Cervelli Incorpora in ottobre congelamento composto, in serie sezione a 20 micron su un criostato e montare su poli-D-lisina vetrini da microscopio trattati. Tenere fettine di cervello a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Rimuovere paraformaldeide-fisso fette di cervello dal congelatore e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> In una cappa aspirante, ri-fix cervello affetta 20 min con paraformaldeide 4% a temperatura ambiente. NOTA: ATTENZIONE: 4% paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato ed eliminato in modo appropriato seguendo protocolli di sicurezza. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> Disidratare fettine di cervello. <ol><li> Preparare 50%, 75% e 100%Soluzioni di etanolo. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 50% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 75% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere i vetrini in fresco 100% di etanolo per 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa, i vetrini possono essere conservati in 100% di etanolo a -20 ° C fino a 1 mese. </li></ol></li></ol></li><li> Saggio FISH seguita da immunoistochimica utilizzando calore indotta antigene / RNA smascheramento <ol><li> Prima di iniziare preparare tutto il materiale necessario: <ol><li> Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata in forno per creare un ambiente umidificato. </li><li> Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all&#39;interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione. </li><li> Rimuovere sonde (entrambe le sonde negativi e target) da frigo e riscaldare in forno di ibridazione per 10 min. Lasciate raffreddare le sonde down a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-4 (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di recupero dell&#39;antigene: 10 mm di citrato di sodio (pH 6), 0,05% di Tween 20. Nota: soluzione può essere conservata a temperatura ambiente a tempo indeterminato e possono essere usate per la futura colorazione. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) in acqua RNase-free o DEPC trattati. NOTA: il tampone di lavaggio 1x può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione. Tampone di lavaggio 50x potrebbe precipitare. Se è così, il calore 50x tampone di lavaggio a 40 ° C per 10 min prima di preparare la soluzione 1x. </li></ol></li><li> Estrarre i vetrini da 100% di etanolo e asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una vaschetta Coplin contenente 50 ml di soluzione di recupero dell&#39;antigene. Immergere i vetrini in soluzione recupero dell&#39;antigene e lessateli per 10 minuti in un forno a microonde. NOTA: In alternativa luogo scorre orizzontalmente in un 100 millimetriDiametro piatto di vetro rotondo contenente 100 ml di soluzione di recupero. <ol><li> Riempire un bicchiere 1 L con acqua distillata e metterlo nel forno a microonde. NOTA: L&#39;acqua &quot;tampone&quot; il calore durante l&#39;esecuzione di smascheramento. </li><li> Porre i vetrini in soluzione recupero dell&#39;antigene all&#39;interno del forno a microonde. Bollire scorre ad alta potenza per 5 min. Subito dopo i campioni hanno smesso di bollire, calore scivola di nuovo ad alta potenza per extra di 5 min. </li><li> Raffreddare i vetrini a temperatura ambiente. NOTA: PUNTO CRITICO: ebollizione durata e procedura dovrebbero essere specificati dall&#39;utente, a seconda delle caratteristiche microonde. Il più veloce l&#39;ebollizione inizia maggiore è la probabilità di soluzione evaporazione. In questo caso si raccomanda che i campioni sono bolliti per periodi di tempo più brevi più di due volte per completare un tempo smascheramento totale di 10 min. Al contrario, se si esegue il riscaldamento a potenza media o bassa, smascheramento può essere eseguita una volta per 10 min. Tuttavia, se i campioni non bollire continuously per un totale di circa 10 minuti, questo può comportare smascheramento parziale sia del RNA e proteine ​​bersaglio da rilevare. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte con PBS 1x. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce (~ 100 microlitri) della sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. Nota: La sonda set dapB si rivolge a un gene batterico e non deve rilevare alcuna RNA mammiferi. </li><li> Aggiungere 2 - 3 gocce di sonda targeting impostati a quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l&#39;RNA di interesse. Nota: un set di sonde di targeting residui 20 - 1.381 del mouse ATF4 mRNA viene utilizzato in questo esempio. </li><li> Coprire i vetrini con parafilm per evitare sonda evaporazione, metterli nella casella diapositiva umidificata all&#39;interno del forno di ibridazione e incubare a 40 ° C per 2 ore. NOTA: OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere ibridate con un set di sonde di targeting del mouse Polr2A e utilizzati come controlli positivi. </li><li> Wash slides due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 1-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 2-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 3-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce del reagente di amplificazione AMP 4 FL a ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli inscivolo box e incubare a 40 ° C per 15 min in forno ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e due volte con PBS 1x. </li><li> Aggiungere 100-200 microlitri (o volume sufficiente a coprire completamente fette) di una soluzione di saturazione contenente 3 mg / ml BSA, glicina 100 mM e 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di anticorpo anti-ChAT diluito in una soluzione bloccante (1/100) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che le fette di cervello non si asciugano. Se necessario, riapplicare soluzione di anticorpi anti-chat per fettine di cervello di 24 ore dopo l&#39;incubazione. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di anticorpo secondario Alexa coniugato adeguato (es., Alexa-594 asino anti-capra per questo particolare esempio) per le diapositive, coprire con parafilm e incubmangiato per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini una volta con acqua distillata. </li><li> Montare i vetrini con mezzo di montaggio-DAPI contenenti. </li><li> Visualizzare fette di cervello sotto un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol> 2. Individuazione di ATF4 mRNA localizzato a assoni in campioni di cervello umano per mezzo di ibridazione in situ (CISH) Seguito da Luxol Fast Blue e violetto cresolo Controcolorazione <ol><li> Preparazione dei campioni per i campioni di cervello umano inclusi in paraffina fissati in formalina <ol><li> Cuocere le fette in forno a secco a 60 ° C per 1 ora. </li><li> Deparaffinare fettine di cervello in una cappa aspirante. NOTA: ATTENZIONE: i reagenti sono tossici e devono essere gestiti e smaltiti seguendo le linee guida di sicurezza appropriate <ol><li> Immergere i vetrini in xilene stanza di compensazione alternativa due volte per 10 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 100% due volte per 1 min. </li><li> Lafette ir-secco 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa i campioni possono essere asciugati a RT O / N, ma devono essere utilizzati entro 24 ore. </li></ol></li></ol></li><li> Diamminobenzidina (DAB) a base di test ISH cromogenico seguito da Luxol veloce macchia blu-violetto e cresil utilizzando indotta dal calore e la proteasi indotta RNA smascheramento <ol><li> Prima di iniziare preparare i materiali necessari: <ol><li> Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata per creare un ambiente umidificato. </li><li> Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all&#39;interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione. </li><li> Preparare 1x Pretrattare 2 diluendo la soluzione 10x (inclusa nel kit CISH reagente) in acqua RNase-free o DEPC trattati. Se pretrattamento viene eseguito su una piastra calda, aggiungere 100 ml di soluzione Pretrattare ad un piatto di vetro del diametro di 100 mm e aumentare la superficie di contatto tra il piatto e la piastra calda (se pretrattamentoviene eseguito in un forno a microonde, una vaschetta Coplin può essere utilizzato invece come specificato in 1.2.3). Soluzione di calore a 100 ° C e mantenerla non più di 30 min bollente prima sommergendo campioni. </li><li> Calore sonde negativi e positivi 10 min a 40 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-6 (incluso nel kit CISH reagente) a temperatura ambiente. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit di reagenti CISH) in acqua distillata. Nota: 1x tampone di lavaggio può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione. </li></ol></li><li> Aggiungi ~ 4 gocce (~ 120 microlitri) di Pretrattare 1 per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare 3 a 5 volte in acqua distillata fresca. </li><li> Eseguire smascheramento calore indotto: <ol><li> Trasferire i vetrini a caldo Pretrattare 2 (incluso nel kit di reagenti CISH) di soluzione e far bollire per 15 minuti. Nota: Boiling può essere eseguita su un piatto caldo per garantireebollizione continua o in un forno a microonde seguendo i punti critici indicati 1.2.3). </li></ol></li><li> Trasferire immediatamente i vetrini di acqua distillata e lavare 3 a 5 volte. </li><li> Lavare i vetrini 3 a 5 volte a fresco al 100% di etanolo. </li><li> Far asciugare le fette 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: O alternativa fette possono essere essiccati / N. </li><li> Eseguire smascheramento proteasi indotta: <ol><li> Aggiungere 4 gocce di Pretrattare 3 (incluso nel kit di reagenti CISH), coprire con parafilm e incubare 30 minuti a 40 ° C in forno ibridazione. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini da 3 a 5 volte in acqua fresca distillata. </li><li> Aggiungere 4 gocce di sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. </li><li> Aggiungere 4 gocce di sonda di targeting impostato quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l&#39;RNA di interesse. NOTA: Un set di sonde di targeting residui 15 - 1.256 del ATF4 mRNA umano è utilizzato in questo esempio. OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere hybridized con un set di sonde di targeting PPIB umano e usati come controlli positivi. </li><li> Mettere diapositive nella casella di scorrimento e incubare per 2 ore. a 40 o C in forno ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 1 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 2 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 3 reagenti per ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con 1x erah buffer per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 4 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 5 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 6 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare uguale volume di BROWN-1 e BROWN-2 reagenti (incluso nel kit di reagenti CISH), aggiungere ~ 120 ml di soluzione per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e sciacquare una volta in acqua distillata. NOTA: passaggi critici: i seguenti passaggi sono fondamentali perottenere un ottimale di contrasto assonale senza mascherare la presenza di granuli di RNA. </li><li> Prima di eseguire di contrasto verificare la presenza di mRNA di interesse al microscopio campo chiaro. Definire le aree di riferimento nei campioni di cervello in cui monitorare la presenza di puncta durante tutta la procedura di contrasto. </li><li> Luxol Preriscaldare soluzione blu veloce a 60 ° C. </li><li> Collocare i vetrini in Luxol blu veloce e incubare 30 minuti a 60 ° C. </li><li> Sciacquare più volte in acqua distillata. </li><li> Dip scorre più volte in 0,05% di soluzione di carbonato di litio per iniziare differenziazione. </li><li> Dip vetrini due volte in fresco 75% di etanolo. </li><li> Risciacquare in acqua distillata. </li><li> Controllare fettine di cervello al microscopio campo chiaro. Si noti che la materia grigia e bianca dovrebbe iniziare ad essere granuli distinguibili e RNA ancora visibili come blu scuro / puncta nero. Verificare che gli assoni alla prima comparsa come luce blu fibre. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubazione con Luxol veloce soluzione di blu in 10-20 min passi, controllando attentamente la di contrasto e la presenza di granuli di RNA. Nota: in genere, di contrasto ottimale è acquisito in 60-90 minuti (tempo totale di incubazione), ma il tempo può essere ridotto se si sospetta che i granuli di RNA potrebbero essere mascherati dalla Luxol veloce macchia blu (vedi figura 2 per gli esempi). </li><li> Incubare i vetrini in soluzione violetto cresolo per 10 minuti a RT. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata. </li><li> Dip vetrini da 5 a 10 volte in 70% di etanolo. </li><li> Disidratare fettine di cervello attraverso 3 rapidi cambi di etanolo al 100%. </li><li> In una cappa aspirante, chiare fettine cerebrali incubando due volte in xilene agente di compensazione alternativa a 2 min e una terza volta per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Fettine di Monte cerebrali in mezzo di montaggio permanente basato xilene. </li><li> Analizzare i campioni al microscopio campo chiaro. </li></ol></li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo rapporto si descrive l&#39;uso di una tecnologia ISH ad alta risoluzione per il rilevamento di assoni localizzato ATF4 mRNA. Questi ed precedenti studi pubblicati dimostrano che questa tecnologia è compatibile con la rilevazione di proteine ​​a base di anticorpi in tessuti o addirittura embrioni interi 33. Importante, è stato recentemente utilizzato per il rilevamento di Arc mRNA all&#39;interno dendriti dei neuroni ippocampali 34. Può anche essere combinato con c...

Assonale reclutamento mRNA e traduzione locali consentono assoni di rispondere agli stimoli extracellulari in maniera temporalmente e spazialmente acuta 1. Intra-assonale sintesi proteica si comprende meglio nel contesto del neurosviluppo in cui svolge un ruolo cruciale nella crescita comportamento cono 2-8, assone Pathfinding 9-11 e retrogrado segnalazione 12,13. Ma molto meno si sa circa il significato funzionale di assonale sintesi proteica nei neuroni post-sviluppo quando i livelli di mRNA e ribosomi assonale sono notevolmente ridotte 14,15. Assoni vertebrati maturi sono stati a lungo pensato di essere traslazione attivo 16. Tuttavia, studi recenti indicano che la traduzione locale viene riattivato negli assoni maturi in condizioni patologiche. Per esempio, un sottoinsieme di mRNA viene reclutato per assoni rigeneranti seguente è richiesta lesioni nervose e intra-assonale sintesi proteica per la corretta rigenerazione di questi assoni 17. Inoltre, il nostro gruppo has dimostrato che specifici mRNA sono reclutati per assoni dopo l&#39;esposizione locale per la malattia di Alzheimer peptide Ap 1-42, e la traduzione locale del fattore di trascrizione ATF4 è necessaria per propagare gli effetti neurodegenerativi di Ap 1-42 da assoni al soma neuronale 18. Infine, le analisi di throughput elevato hanno rivelato che gli assoni maturi hanno un trascrittoma più complesso e dinamico di quanto previsto 18-21, soprattutto in condizioni patologiche. Alla luce di questi studi, un metodo altamente sensibile e specifico per rilevare è necessario mRNA assoni localizzati nel sistema nervoso adulto. Gran parte del lavoro sul reclutamento mRNA e traduzione locali negli assoni maturi è stata eseguita su neuroni in coltura. Ciò è particolarmente vero per le analisi del trascrittoma in quanto esistono metodi di coltura specializzate che permettono l&#39;isolamento degli assoni dalla somato-dendritica vano 18-20. Anche se questi studi hanno dato ins preziosiight nel ruolo della traduzione locale di assoni maturi, la questione se i neuroni in coltura rappresentano fedelmente la situazione in vivo o se mRNA reclutamento è una risposta di adattamento degli assoni a condizioni di coltura è ancora aperta. Pochi studi hanno fornito prove di mRNA assunzioni a maturare assoni in vivo. Ad esempio, la trascrizione che codifica per la proteina marcatore olfattivo è stato rilevato in assoni nei neuroni sensoriali adulti 22. Un transgene contenente la 3 &#39;UTR di β-actina mRNA viene trasportato assoni nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico in topi e si traduce localmente dopo periodi di sviluppo 23. Lamin b2 mRNA è localizzato a assoni retinici in Xenopues laevis girini e il suo esaurimento colpisce assone manutenzione dopo lo sviluppo assonale 21. Interferenza con il trasporto assonale della codifica mRNA per citocromo C ossidasi IV altera il comportamento del mouse 24. Infine, ATF4 mRNA si trova in adultiXON di topi e cervelli umani nel contesto di Ap 1-42 indotta neurodegenerazione 18. Alta velocità effettiva analisi del trascrittoma hanno dimostrato di essere utile per identificare i profili di mRNA in assoni isolati in vitro, ma hanno limitazioni per studi in vivo in quanto nei tessuti interi assoni non si trovano mai isolatamente, ma mescolati con i corpi cellulari neuronali, cellule gliali e altri tipi di cellule. Pertanto, tali analisi devono essere combinati con tecniche di imaging che confermano la localizzazione subcellulare di mRNA. RNA ibridazione in situ (ISH RNA) permette la rilevazione e visualizzazione di specifiche sequenze di RNA in cellule e tessuti. Tuttavia, i saggi originali RNA ISH erano adatte solo per l&#39;identificazione di RNA altamente abbondanti 25, che è raramente il caso di mRNA assoni localizzate. Negli ultimi decenni ci si è messi in via di sviluppo nuove tecnologie che permettono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola <sup&gt; 25,26. Ad esempio, Singer e colleghi hanno sviluppato le sonde ISH per rilevare mRNA in singole cellule, che consiste in 5 non sovrapposti fluorescente 50-mers (per i dettagli si riferiscono al 27). La differenza principale tra le tecniche sopra menzionate e quella qui descritta è che la successiva utilizza 20 doppia Z-struttura (non lineare) sonde che tipicamente colpiscono ~ 1 kb regione del RNA di interesse garantire specificità e bassi livelli di fondo. Le sonde sono poi ibridati con preamplificatore e amplificatore sequenze che vengono finalmente fluorescente o coniugati con enzimi che consentono reazioni cromogeni. Questi passaggi di amplificazione migliorare il rapporto segnale-rumore, rispetto ad altre tecnologie ISH 28. Qui si descrive due protocolli che utilizzano RNAscope combinato sia con fluorescenza immunocitochimica o con coloranti istologici che permettono di contrasto assonale. Entrambi i protocolli sono adatti per visualizzare la localizzazione assonale di ATF4 mRNA in mo adultiutilizzare e cervelli umani.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNA sono spesso localizzate a assoni vertebrati ed è richiesta la loro traduzione locale per assone pathfinding o ramificazione durante lo sviluppo e per la manutenzione, la riparazione o la neurodegenerazione in periodi postdevelopmental. Analisi High Throughput hanno recentemente rivelato che gli assoni hanno un trascrittoma più dinamico e complesso di quanto previsto in precedenza. Queste analisi, tuttavia sono stati per lo più fatto in neuroni in coltura dove gli assoni possono essere isolate dai compartimenti somato-dendritiche. E &#39;praticamente impossibile raggiungere tale isolamento nei tessuti interi in vivo. Pertanto, al fine di verificare l&#39;assunzione di mRNA e la loro rilevanza funzionale in un animale intero, analisi trascrittoma dovrebbero idealmente essere combinati con tecniche che permettono la visualizzazione di mRNA in situ. Recentemente, sono state sviluppate tecnologie ISH nuove che rilevano RNAs a livello di singola molecola. Ciò è particolarmente importante quando si analizza la localizzazione subcellulare di mRNA, RNA poiché localizzati trovano tipicamente a livelli bassi. Qui si descrive due protocolli per la rilevazione di mRNA assoni-localizzate utilizzando una nuova tecnologia ultrasensibile RNA ISH. Abbiamo unito RNAscope ISH con assonale di contrasto utilizzando la fluorescenza immunoistochimica o coloranti istologici per verificare l&#39;assunzione di ATF4 mRNA di assoni in vivo nel topo matura e cervello umano.

Un breve riassunto delle procedure sopra descritte è mostrato nella figura 1. Rilevazione ottimale di ATF4 mRNA granuli negli assoni colinergici con smascheramento indotta dal calore Nel valutare la localizzazione assonale di mRNA, è fondamentale per poter identificare gli assoni e di essere in grado di visualizzare bassa RNAs abbondanti. La tecnologia di RNA ISH qui descritta consente il rilevamento di RNA ad una risoluzione di una si...

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Views.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta risoluzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Manuale Protocollo Segmentazione for Human ippocampale Sottocampi Utilizzando 3T Risonanza Magnetica

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...