Siamo grati a Michael Feiss e Jean Sippy per la guida sulla creazione di fago e purificazione. Ringraziamo Michael Elowitz per la fornitura del software di riconoscimento delle cellule, Schnitzcell. Il lavoro in laboratorio Golding è sostenuta da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01GM082837), la National Science Foundation (082.265, PFC: Centro per la Fisica delle cellule viventi), la Fondazione Welch (Grant Q-1759) e Human Frontier Science Programma (RGY 70/2008).

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I ceppi batterici, fagi e plasmidi: Strain LE392 è supF. E &#39;stato scelto per sopprimere la SAM7 mutazione nel genoma del fago (vedi Tabella 1 per i dettagli). Così, alla fine lysogens indotte lisi e rilasciare particelle fagiche, le cellule infettate volontà che hanno scelto la via litico. Lisogeni cellule vengono coltivate a 30 ° C a causa della presenza del termosensibile cI 857 allele nel genoma fagico. Dopo l&#39;induzione di calore, GPD-EYFP e di tipo selvatico GPD sono co-espressi dal genoma di λ LZ1 e il plasmide pPlate * D rispettivamente. Come risultato, il capside del fago λ appena creato LZ2 contiene una miscela di GPD-EYFP e proteine ​​GPD. Questo fago mosaico è strutturalmente stabile e sufficientemente fluorescente per consentire l&#39;individuazione di fagi individuali 5. pP RE - mCherry è un plasmide reporter utilizzato per rilevare scelta del pathwa lisogenay. Il RE promotore P viene attivato dal CII durante la creazione di lisogenia 1,11. pP RE - mCherry 5 è stato derivato da pE-GFP 11 sostituendo GFP con mCherry 12. Per maggiori dettagli si veda il nostro precedente lavoro 5. Condizioni di crescita Parametri: Durante l&#39;induzione lysogen (sezione 1), lieve agitazione a 180 rpm dà una resa virus buono 13. Uso di glucosio nel mezzo di crescita deve essere evitato il metabolismo del glucosio genera acidi prodotti metabolici, e particelle lambda mature sono instabili a pH acido 13. L&#39;aggiunta di MgSO4 mira a stabilizzare il fago capside 3. Per i fagi che trasportano wild type CI (invece di CI 857), il lysogen può essere indotta con il DNA-danneggiamento agente Mitomicina C 3. Nella fase 1.3, l&#39;incubazione a 37 ° C non dovrebbe di norma superare i 90 minuti. È Usef<html> ul per verificare la densità cellulare da OD 600 ogni 30 min. Per un buon lisato, OD 600 scende a circa 0,2 o meno, e il restante OD 600 è un risultato di detriti cellulari. Incubazione troppo lungo può causare una resa inferiore, poiché il fago fago appena creato può iniziare a iniettare loro DNA in detriti cellulari. Per ottenere una banda visibile fago (almeno 1 x 10 11 particelle fagiche) nei passi 2,11 e 2,13, crescono almeno 500 ml cultura nel passaggio 1,2. L&#39;aggiunta di 0,2% maltosio nel mezzo di crescita nelle fasi 5.1 e 5.2 mira ad indurre l&#39;espressione di agnello, il recettore per il fago lambda adsorbimento 3,14. Il 1000 volte diluizione invece di 100 volte al punto 5.2 è volta a ridurre il livello di fondo mCherry dal RE plasmide giornalista pP - mCherry. Nel Passaggio 5,5 iniettabile DNA fagico triggering, 35 ° C viene scelta per evitare l&#39;induzione della temperatura sensibile allele cI857. Phage Purificazione: jove_content &quot;&gt; Le fasi di depurazione dei fagi (passaggi da 2.1 a 2.11) può essere sostituito con altri 5 protocolli di purificazione, ma il finale attraverso ultracentrifugazione gradiente di equilibrio CsCl (Piazza di 2.12 e 2.13), è inevitabile. Rotori oscillanti sono necessari passi 2,10 e 2.12 per garantire taglienti bande fagiche visibili. Ottenere un titolo puro fago può facilmente richiedere fino a una settimana, per cui è necessario controllare il titolo fago lungo la strada per assicurarsi che nulla vada storto durante le fasi intermedie. Phage Manipolazione: Durante tutte le procedure di purificazione di cui alla sezione 2, è fondamentale per gestire fago lisato con delicatezza per evitare di taglio code fago da teste fagiche. Durante l&#39;infezione delle cellule nella sezione 5 (ad esempio, attraverso i passaggi 5,5 5,7), è anche fondamentale per evitare il taglio di particelle fagiche dalla cellula infettata. Si noti che se il fago viene tagliato dalla cellula infetta dopo iniezione suo DNA, il risultato è una infezione &quot;scuro&quot;, cioè inrisultato perfezione sarà osservato nell&#39;esperimento, ma il fago infettante non lo farà. Per ridurre al minimo tali problemi, si usa una punta larga pipetta ogni volta che la gestione fagi o il fago / cella miscela. DAPI di prova: La colorazione dello stock del fago con DAPI (sezione 4) è un metodo rapido ed efficace per verificare la purezza dello stock fago. Può anche essere usato per testare possibile degradazione di un magazzino fago esistente nel tempo. Per un archivio pura, la co-localizzazione di segnali YFP e DAPI al microscopio a fluorescenza dovrebbe essere prossimo al 100%. Abbiamo tipicamente osservare che meno dell&#39;1% dei punti YFP non contengono DAPI (che rappresenta capsidi senza genoma virale), che indica che queste particelle non correttamente impacchettare il DNA virale o già iniettato loro DNA altrove. Meno dell&#39;1% dei punti DAPI non contengono YFP (corrispondente a non fluorescenti fagi). Se questo non è il caso, attraverso passaggi 2,12 2,14 necessità di essere ripetuto in order per purificare nuovamente. Per quanto riguarda i parametri di imaging, la configurazione microscopio al punto 4.3 non è così critica come al punto 5 perché non a lungo termine live-cell imaging è necessario qui. Tuttavia, mantenendo le stesse impostazioni microscopia in sezione 5 è utile se si vuole calibrare l&#39;intensità di fluorescenza di una singola particella fagica. Se il PBS-agarosio lastra non è molto pulito, o troppo colorante DAPI viene utilizzato, alcuni punti DAPI corrispondenti a DNA del fago può essere circondato da un &quot;alone&quot;. Se troppo poco colorante DAPI viene utilizzato, il segnale dal canale DAPI può essere molto debole. Microscopio di sistema: Per l&#39;imaging nella sezione 6, si usa un microscopio a epifluorescenza invertito commerciale (Eclipse TE2000-E, Nikon), con un obiettivo 100x (Piano di Fluo, apertura numerica 1,40, immersione in olio) e standard di set di filtri (Nikon). La sorgente di luce di fluorescenza è una lampada ad arco con controllo di intensità luminosa. Le seguenti caratteristiche sono controllati dal computer: x, y, z Pozione, campo chiaro e fluorescenza persiane, e la scelta del filtro di fluorescenza. Una funzione di messa a fuoco automatica è necessaria. In caso contrario, la messa a fuoco può facilmente allontanarsi durante il time-lapse film (normalmente 4 ore). La capacità di acquisire più posizioni (x, y) in ogni punto è utile, in quanto permette di seguire eventi di infezione multipli in parallelo. Noi di solito acquisire 8 posizioni stadio in ogni film, in seguito fino a 100 eventi di infezione. La fotocamera che usiamo è una soluzione raffreddata 512x512 CCD da 16x16 pixel fotocamera micron con una gamma dinamica di 16 bit (Cascade512, fotometrici). Acquisizione viene eseguita utilizzando MetaMorph software (Molecular Devices). Il microscopio deve essere posto in un ambiente a temperatura controllata, in alternativa, la fase microscopio dovrebbe essere circondato da una camera a temperatura controllata. Acquisizione di immagini: Per live-cell imaging, è fondamentale per evitare inutile esposizione del campione, che potrebbe portare a candeggio e phototoxicity. Pertanto, è meglio caratterizzare il vostro primo sistema per trovare una esposizione ottimale la luce che consenta di rilevare la fluorescenza pur non portando ad una crescita cellulare eccessiva sbiancamento o inibizione. Per ottenere una buona immagine di fluorescenza, giocare con l&#39;intensità della luce eccitante, tempo di esposizione e guadagno della telecamera. Nei passaggi 6,2-6,3, l&#39;intervallo di 10 min cornice è scelta allo scopo di minimizzare l&#39;esposizione della luce. In ogni frame, un solo in-fuoco dell&#39;immagine è necessaria in contrasto di fase (per riconoscimento cellulare) e canali fluorescenti (per determinare il destino della cellula). Nel primo punto temporale, tuttavia, più z-posizione immagini attraverso il canale YFP devono catturare tutti fagi infettano sulla superficie cellulare. Il tempo di esposizione YFP nel frame iniziale può anche essere superiore a quella utilizzata per il film accelerato nei tempi successivi. Image Analysis: Attentamente contare le particelle fagiche intorno alla superficie delle cellule nella fase 7.1. Comeosservato in precedenza, si prende una serie di z-stack attraverso il canale YFP al punto 6.2. Tuttavia, questo può ancora lasciare alcune particelle fagiche fluorescenti out-of-focus, che sfida il conteggio. La lunghezza della cella nel lasso di tempo iniziale è misurata utilizzando il software Metamorph. La lunghezza della cella può essere misurata ImageJ o altri strumenti software. Inoltre, un programma automatizzato casa costruita Matlab può essere molto utile per ottenere informazioni quali il cambiamento di fluorescenza nel tempo lungo linee cellulari.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM tampone </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Ago </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Dialisi cassetta </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Vetrino da microscopio </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-trasparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-trasparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotore </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotore </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Rifrattometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Microscopio a epifluorescenza </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e apparecchiature.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Il sistema comprendendo batteriofago (fago) lambda e del batterio E. coli si è servito a lungo come paradigma per la cella-destino 1,2 determinazione. Seguendo l&#39;infezione simultanea della cella da un numero di fagi, uno dei due percorsi è scelto: litico (virulenta) o lisogena (dormiente) 3,4. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo per l&#39;etichettatura fluorescente fagi singoli, e sono stati in grado di esaminare la post-infezione decisionale in tempo reale al microscopio, a livello di fagi singoli e cellule 5. Qui, descriviamo la procedura completa per eseguire gli esperimenti di infezione descritti nel nostro precedente lavoro 5. Questo include la creazione di fagi fluorescenti, infezione delle cellule, l&#39;imaging al microscopio e l&#39;analisi dei dati. Il fago fluorescente è un &quot;ibrido&quot;, co-esprimono versioni wild-type e YFP-fusione della proteina del capside GPD. Un lisato fago grezzo viene prima ottenuto inducendo una lysogen del GPD-EYFP (Enhbilanciato giallo fluorescente delle proteine) fago, ospitare un plasmide che esprime di tipo selvatico GPD. Una serie di fasi di purificazione vengono poi effettuate, seguito da DAPI-etichettatura e immagini al microscopio. Questo viene fatto al fine di verificare l&#39;uniformità, confezionamento efficienza DNA, segnale di fluorescenza e la stabilità strutturale del magazzino fago. L&#39;adsorbimento iniziale di fagi a batteri viene eseguita su ghiaccio, seguito da una breve incubazione a 35 ° C per attivare l&#39;iniezione del DNA virale 6. Il fago / miscela di batteri viene poi spostato alla superficie di una lastra sottile agar nutriente, coperto con un vetrino coprioggetto e ripreso sotto un microscopio a epifluorescenza. Il post-infezione processo è seguito per 4 ore, a intervallo di 10 min. Posizioni a più stadi sono tracciati in modo tale che ~ 100 infezioni delle cellule può essere rintracciata in un singolo esperimento. Ad ogni punto di posizione e tempo, le immagini vengono acquisite in contrasto di fase e fluorescenti canali rosso e verde. Il contrasto di fase immagine è utilizzato in seguito per l&#39;assemblaggio cell riconoscimento mentre i canali fluorescenti sono usate per caratterizzare il risultato dell&#39;infezione: produzione di nuovi fagi fluorescenti (verde) seguita da lisi cellulare, o l&#39;espressione di fattori lisogenia (rosso), seguito da crescita cellulare ripresa e divisione. Gli acquisiti filmati time-lapse sono trattati con una combinazione di metodi manuali e automatizzati. I risultati delle analisi dei dati di identificazione dei parametri di infezione per ogni evento infezione (ad esempio il numero e le posizioni di infettare fagi), così come risultato l&#39;infezione (lisi / lisogenia). Ulteriori parametri possono essere estratti se desiderato.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri, dopo l&#39;esito dell&#39;infezione sotto il microscopio, e l&#39;analisi dei risultati di infezione.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.0K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione di E. coli Batteri, dopo l'esito dell'infezione sotto il microscopio, e l'analisi dei risultati di infezione.