Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Riconosciamo Hannah Fox per aiuto nella preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01AI030612.

1. colture cellulari, infezione virale e l'EdC etichettatura ( Figura 1) il seguente protocollo coinvolge funzionare con virus. Fare riferimento al proprio Istituto &#39; protocolli di biosicurezza di s per quanto riguarda la manipolazione sicura di virus e altri agenti biologici. Questo protocollo è stato approvato da Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh.
<ol><li>Tripsinizzano un pallone di coltura tissutale 2 cm 150 confluenti di cellule MRC-5 e trasferire le cellule ad una piastra di coltura del tessuto di 2 600 cm contenente 100 mL DMEM con 10% FBS. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2 per 3-4 giorni per raggiungere la fase stazionaria ed confluenza. Un piatto di 2 cm 600 confluenti contiene ~ 7 x 10 7 cellule. Preparare 1 piastra per ogni condizione e 1 piatto per ogni controllo negativo corrispondente. 
	Nota: Le cellule devono raggiungere la fase stazionaria per inibire la replicazione del DNA cellulare per garantire che solo vDNA viene etichettato e purificata nei passaggi successivi. 
	Nota: Ogni campione richiede un accesso senza etichetta di controllo negativo, preparato con le stesse condizioni di infezione e il punto di tempo senza l'aggiunta di EdC. 
	Nota: Una versione ridimensionata di questo esperimento dovrebbe essere effettuata in tandem per testare per l'etichettatura del DNA cellulare da formazione immagine usando crescita cellulare paragonabile, infezione, EdC condizioni, di etichettatura e intervalli di tempo (vedi passo 2).</li>
	<li>Diluire 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL di freddo Buffered Saline (TBS). Rimuovere il mezzo di crescita e conservare a 37 ° C. Per infettare, aggiungere 7-mL diluito virus alle cellule MRC-5 e rock per 1 h a temperatura ambiente. A seguito di adsorbimento, rimuovere inoculo, sciacquare con temperatura ambiente 50 mL TBS e sostituire il mezzo di crescita originale. Incubare a 37 ° C in presenza di 5% CO 2. Questo passaggio deve essere effettuato per ogni condizione sperimentale ed il controllo negativo. 
	Nota: Maggiore EdC etichettatura possa essere acquisito utilizzando HSV-1 mutanti difettosi per l'espressione del dUTPase virale (gene UL50) e/o uracile glicosilasi (gene UL2). HSV-1 dUTPase ha specificità di substrato basso e può fare diminuire l'attivazione di alcuni inibitori nucleosidici analoghi 25 , 27.</li>
	<li>Genomi virali di etichetta con EdC. Seguire le indicazioni per etichettare in arrivo genomi (1.3.1.), la replica di genomi (1.3.2.), o forche di replicazione virale (1.3.3.). 
	Nota: Solo un passo 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3 deve avvenire, a seconda se in arrivo genomi, genomi replicati o forcelle replica devono essere analizzati nei passaggi successivi, rispettivamente. 
	Nota: EdU o f-ara EdU può essere sostituito per EdC. La tossicità di analoghi nucleosidici deve essere monitorata e ridotto al minimo.
	<ol><li>Uso prelabeled scorte per realizzare l'infezione nel punto 1.2 e procedere al passaggio 2 o 3 all'interno di 4 h post infezione (hpi) per studiare non replicata vDNA ( Figura 1A). 
		Nota: Preparare prelabeled virus scorte utilizzando il protocollo descritto in precedenza 25. Stock di virus deve essere passato attraverso una colonna di G-25 per rimuovere qualsiasi residuo EdC.</li>
		<li>Etichetta replicante vDNA aggiungendo 5-25 µM EdC al terreno di coltura delle cellule delle cellule infettate per 2-4 h ( Figura 1B). Prima di aggiungere, diluire EdC in 1 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Per etichettare le forcelle di replicazione virale, dopo l'inizio della replica vDNA (&#8805; 4 hpi), etichetta di impulso replica vDNA con 5-25 µM EdC per 5-20 min. Per inseguire, sciacquare 3 x con mezzo di chase contenente 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e poi incubare in presenza di medium di chase per altri 20-40 min ( Figura 1). 
		Nota: Pulse e chase medio dovrebbe essere equilibrato al 37 ° C e 5% CO 2 prima dell'uso. 
		Nota: Per esperimenti di pulse chase, è importante considerare la quantità di tempo che necessaria per nucleosidi entrare nella cellula ed essere fosforilato prima che queste possano essere incorporate nella replica del DNA. Questo deve essere determinato empiricamente. 
		Nota: Per determinare la risoluzione di esperimenti di pulse chase, calcolare il tasso di replicazione virale nelle circostanze sperimentali utilizzati. Questo può essere determinato mediante PCR quantitativa di genomi virali durante un singolo passaggio crescita tempo corso 26. 
		Nota: Per l'imaging di genomi virali procedere al passaggio 2 e per la purificazione di genomi virali, procedere al passaggio 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Formazione immagine di EdC DNA ( Figura 2A) contrassegnato Nota: è utile effettuare imaging in tandem con il metodo di purificazione del genoma virale per verificare che il DNA cellulare non è etichettato in esperimenti. La formazione immagine può essere utilizzata anche per visualizzare la natura di vDNA con etichetta e per convalidare i dati di proteomica. Esempi di DNA virale e cellulare modelli di macchiatura sono mostrati nella Figura 3.
<ol><li>Svolgere infezioni ed EdC etichettatura come indicato nel passaggio 1, ad eccezione di utilizzando ridimensionato condizioni sulle lamelle in un piatto di coltura del tessuto 12-pozzetti contenente 1 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Fix cellule con 1 mL 3,7% paraformaldeide in PBS 1X per 15 minuti a TA. Dopo la fissazione, risciacquo celle 2 volte con 1 mL 3% BSA in PBS. 
	Attenzione: Paraformaldeide può causare lesioni gravi o permanenti. Attenersi alle precauzioni di sicurezza. 
	Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le lamelle possono essere memorizzate a 4 ° C nel secondo lavaggio per fino a 3 giorni.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 1 mL di tampone di permeabilizzazione [vedi Tabella materiali] per 20 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Lavare con 1 mL di 3% BSA e quindi blocco con 1 mL 3% BSA in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre dondolo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della reazione clicca cocktail [vedi Tabella materiali] alle lamelle di coniugare covalentemente Alexa Fluor 488 azoturo di EdC DNA contrassegnato. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Macchia DNA cellulare con 1 mL di una diluizione di 1:2,000 di Hoechst in PBS per 30 min a temperatura ambiente mentre a dondolo. Aspirare e lavare due volte con 1 mL di PBS.</li>
	Immunofluorescenza indiretta <li>macchia con gli anticorpi primari e secondari secondo standard di protocolli 25. 
	Nota: VDNA con etichetta colocalizza con ICP8, ICP4 o UL42 ed etichettati cellular DNA colocalizza con macchia di Hoechst.</li>
	<li>Montare vetrini coprioggetti sui vetrini e immagine celle utilizzando un microscopio a fluorescenza. 
	Nota: I vetrini possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.</li>
</ol> 3. Purificazione di vDNA e proteine associate Nota: diversi aspetti del presente protocollo sono stati adattati da Leung et al. 22 Nota: tutti i buffer e i reagenti devono essere refrigerati il ghiaccio prima dell'uso e tutti i passaggi devono essere effettuati sul ghiaccio se non diversamente indicato.
<ol><li>Raccogliere nuclei. 
	Nota: Prima di isolamento dei nuclei, formaldeide può essere utilizzato per crosslink proteine a DNA. Condizioni più rigorose di lavare quindi possono essere utilizzate durante la purificazione del DNA su perline rivestite con streptavidina. Per crcondizioni di osslinking e lavaggio vedere Sirbu et al. 21. <ol><li>sostituire crescita medio con 20 mL di tampone di estrazione di Nuclei (NEB) e incubare per 20 min a 4 ° C con occasionali a dondolo. I nuclei diventano visibili al microscopio.</li>
		<li>Raschiare i nuclei dalla piastra con un raschietto in cella e trasferire in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare per 10 min 2.500 x g a 4 ° C per a pellet di nuclei, scartare il surnatante. 
		Nota: Trypan blu colorazione può essere utilizzato per verificare l'isolamento dei nuclei da cellule.</li>
		<li>Delicatamente sloggiare la pallina nucleare in 10 mL di PBS, trasferirlo in una provetta conica 15 mL e pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS. 
		Nota: I Nuclei possono essere congelati e il protocollo può essere sospesa a questo punto. A tale scopo, Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 500 µ l di congelamento nel buffer e incubare la provetta in un bagno di ghiaccio di etanolo/a secco. Memorizzare i nuclei congelati a-80 ° C. Prima dell'uso, scongelare i nuclei a temperatura ambiente, trasferire rapidamente di ghiaccio, aggiungere 10 mL di PBS, roccia delicatamente per mescolare, pellet mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C e rimuovere completamente PBS. I nuclei di congelamento può provocare ridotta resa.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente coniugato biotina-azoturo di EdC etichettato vDNA.
	<ol><li>Risospendere il pellet nucleare in reazione clicca 10ml mescolare [vedi Tabella materiali] pipettando delicatamente su e giù 5 volte con una pipetta da 10 mL. 
		Nota: È importante che i reagenti inclusi nella combinazione di reazione di clic vengono aggiunti nell'ordine indicato.</li>
		<li>Ruotare per 1h a 4 ° C. Durante la rotazione preparare e chill buffer B1, B2 e B3 [vedi Tabella materiali].</li>
		<li>Pellet nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere fare clic su mix di reazione e lavare la pallina delicatamente risospendere in 10 mL di PBS e centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere delicatamente la pallina nucleare in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL utilizzando un puntale di grande diametro. Pellet di nuclei mediante centrifugazione per 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere PBS e freeze flash in azoto liquido. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e nuclei congelati possono essere conservati a-80 ° C. gelo disgelo aiuta con conseguente lisi quindi è consigliabile che i nuclei essere flash congelati anche quando si procede a passo 3.3 nello stesso giorno.</li>
	</ol></li> <li>Lyse nuclei e il frammento di DNA.
	<ol><li>Scongelare i nuclei su ghiaccio e risospendere in 500 µ l di Buffer B1 pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 45 min.</li>
		<li>Sonicate campioni 6 volte per 30 s ogni ampiezza 40% usando una sonda del microtip di 3 mm. Posizionare il campione sul ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo sonicazione, campioni dovrebbero apparire chiaro, non nuvoloso. 
		Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per sonicatori individuali. Per istruzioni dettagliate su come ottimizzare le condizioni di sonicazione riferirsi a Leung et al. 22.</li> <li>pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il formato della pallina dovrebbe diminuire sostanzialmente. Filtrare il surnatante con colino di cella 100 µM e mantenere il flusso attraverso.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l tampone B2 per il surnatante filtrato. 900 µ l di questo esempio verrà utilizzato nel passaggio 3.4.2.</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per isolamento del DNA (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x soluzione SDS-bicarbonato [vedi Tabella materiali]. Procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Prendere una parte aliquota di ciascuna condizione per ingresso proteina (50 µ l o 1/20th volume) e aggiungere 50 µ l 2 x tampone di Laemmli, congelato in azoto liquido e conservare a -80 ° C. uso nel passaggio 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylated del DNA di streptavidina rivestito perline.
	<ol><li>Preparare Streptavidin T1 biglie magnetiche trasferendo 300 µ l di liquami tallone ad un tubo di microfuge 1,5 mL. Preparare una provetta di perline per campione. Lavare 3 volte con 1 mL di Buffer B2 su vortex per risospendere, applicando un magnete per separare le perline, e aspirando il tampone di lavaggio delle perle. 
		Nota: Ottimizzato vincolante il risultato di condizioni nel fondo minimo legame e resa ingrandita. È stato determinato sperimentalmente che biglie magnetiche Streptavidin T1 hanno una capacità di associazione significativamente maggiore rispetto dell'agarosi branelli, come pure altri branelli di streptavidina e meno sfondo vincolante di perle di streptavidina C1 ( Figura 4A ).</li>
		<li>Aggiungere 900 µ l di campione dal punto 3.3.4. ai branelli lavati e ruotare durante la notte a 4 ° C. 
		Nota: Non non perle di vortice, una volta che il campione viene aggiunto a loro. 
		Nota: Se gli importi significativi di DNA o proteine sono isolati nel controllo negativo senza etichetta, questo passaggio può essere ridotto da pernottamento a 4 h per ridurre rilegatura.</li>
	</ol></li> <li>Lavare perline ed eluire vDNA e proteine associate. 
	Nota: Si consiglia di utilizzare puntali con filtro per i passaggi rimanenti.
	<ol><li>Campioni di posto in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, Rimuovi sovranatante, Risospendere delicatamente in 1 mL di Buffer B2, ruotare a 4 ° C per 5 min</li>
		<li>Ripetere tre volte il punto 3.5.1.</li>
		<li>Posizionare i campioni in una cremagliera del tubo magnetico microfuge, rimuovere il surnatante, risospendere in 1 mL di Buffer B3, delicatamente e ruotare a 4 ° C per 5 min.</li>
		<li>Miscela di microsfere di trasferire 100 µ l (volume di th 1/10) ad un nuovo tubo per isolamento del DNA associato. Applicare questo tubo al magnete, rimuovere il surnatante, risospendere perline in 100 µ l 1 x soluzione SDS-bicarbonato e procedere con il protocollo di isolamento del DNA (punto 3.6).</li>
		<li>Applicare il tubo contenente la miscela di microsfere di 900 µ l restante dal punto 3.5.3. al magnete, rimuovere il surnatante e risospendere perline in 50 µ l 2 x Laemmli buffer del campione per eluire complessi della DNA-proteina e proteina.</li>
		<li>Campioni di ebollizione a 95 ° C per 15 min, vortice, rapidamente nel microfuge e applicare il magnete. Trasferire l'eluato a un nuovo tubo, congelamento flash e conservare a -80 ° C. 
		Nota: Uso cap blocchi per garantire che i tubi non pop aprire durante la cottura. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e campioni possono essere conservati a-80 ° C per diverse settimane.</li>
		<li>Analizza campioni di proteine di Blue di Coomassie macchiatura, macchiarsi occidentale o spettrometria di massa di procedure standard 25. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4 e Figura 5. 
		Nota: Per determinare se il rendimento di proteina è sufficiente per la spettrometria di massa, 7,5 µ l di ogni campione viene utilizzato per l'analisi di macchiatura blu di Coomassie e 7,5 µ l per macchiarsi occidentale di un genoma virale rappresentanza associato la proteina (ICP4, ICP8 o UL42). Lo stesso volume di lisati dal passaggio 3.3.6. vengono eseguiti a fianco al controllo per i livelli della proteina di input. Il campione rimanente (35 µ l) viene poi analizzato dalla massa spettrometria come descritto in precedenza 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento del DNA <ol><li>Incubare i campioni da passaggi 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C per 4-16 h. Rimuovi il campione dai branelli magnetici, se necessario.</li>
		<li>Estrarre campioni con 150 µ l fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (PCI) e trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre la rimanente PCI con 100 µ l Tris-EDTA (TE) e aggiungere la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Estrarre campioni con 200 µ l cloroformio: alcool isoamilico (24:1).</li>
		<li>Purificare la fase acquosa utilizzando il Kit di purificazione di PCR secondo il produttore &#39; protocollo s. 
		Nota: L'indicatore di pH nel Buffer PB diventerà viola quando aggiunto al campione. Aggiungere 10 & n.181; PH di L 3m NaOAc 5.0 per diminuire il pH del campione.</li>
		<li>Concentrazione di DNA determinare utilizzando un fluorometro. 
		Nota: Questo protocollo produce in genere 100-400 ng associato a perlina del DNA. Nessun DNA dovrebbe essere rilevato nell'eluito del controllo negativo in cui EdC non è stato aggiunto al passaggio 1.3.</li>
		<li>DNA può essere conservato in un grippaggio del DNA basso tubo a 4 o - 20 ° C e può essere utilizzato per PCR in tempo reale o analisi di sequenziamento di throughput elevato.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+periphery+of+nuclear+domain+10+(ND10)+as+site+of+DNA+virus+deposition.">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li><li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment.">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo include più passaggi che, se non seguite con attenzione, possono provocare rese significativamente riduttrice della proteina o contaminazione con DNA cellulare. È fondamentale che cellule stazionarie sono utilizzate per tutti gli esperimenti per garantire che DNA cellulare non è etichettato e purificato. Questo può essere confermato dall'assenza di polimerasi del DNA cellulare del campione di proteine perché HSV-1 non utilizzare il cellulare DNA polimerasi per la sintesi di genoma. Durante EdC etic...

I virus hanno una limitata capacità di svolgere le funzioni essenziali e pertanto dipendono da fattori dell'ospite per facilitare gli aspetti critici dell'infezione compreso trasporto, replica, riparazione, ricombinazione ed espressione genica virale. Le attività di questi fattori dell'ospite sono spesso aumentate di proteine codificate virally. Inoltre, virus deve evitare il rilevamento e interferenze di risposte cellulari all'infezione virale. Di conseguenza, interazioni ospite virus dettano l'esito dell'infezione. Di fondamentale importanza è capire come virus alterano l'ambiente cellulare per adattare il macchinario cellulare per facilitare processi virali. Di particolare interesse è identificare i fattori e i processi agiscono sui genomi virali durante tutto il ciclo infettivo.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) è che una doppia elica del DNA virus che infetta una parte sostanziale della popolazione umana. Entro la prima ora di infezione, il genoma virale entra nel nucleo, dove una cascata ordinata dell'espressione genica virale ensues in coordinamento con virale del DNA (vDNA) replica1. Nel nucleo, genomi sono soggetti a regolazione epigenetica, sottoposti a riparazione e ricombinazione e sono confezionati in capsidi, tale che i primi virioni di progenie sono prodotte in meno di sei ore. La valutazione completa delle proteine del genoma virale associato durante tutto il corso dell'infezione getterà le basi per indagare i dettagli molecolari dei processi che agiscono sui genomi virali e forniranno la comprensione di quali fattori virali e cellulari sono coinvolti nelle varie fasi dell'infezione.
Metodi precedenti per l'indagine sui fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione virale includono purificazione di affinità delle proteine virali per l'analisi di proteine cellulari associati2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. questi saggi sono stati strumentali per l'identificazione di fattori cellulari coinvolti nella risposta antivirale ospite, così come modifica virale della cromatina, espressione genica, e riparazione del DNA. Tuttavia, è difficile da accertare se interazioni dipendono l'associazione con vDNA e proteomica solo consentono di comprendere le interazioni che si verificano in funzione di uno specifico fattore virale. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato utilizzato per identificare dove specifiche proteine virali e cellulari legano al genoma virali10,11,12,13,14 , 15 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) combinato con immunocitochimica ha permesso la visualizzazione dei fattori cellulari che colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. queste analisi consentono analisi spazio e temporale. Tuttavia, le limitazioni comprendono la necessità per gli anticorpi altamente specifici, sensibilità limitata e la necessità di approfondimenti precedenti interazioni ospite di virus. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo basato su iPOND (isolamento delle proteine sul DNA nascente)21 e aniPOND (accelerata nativo iPOND)22 per selettivamente etichettare e purificare vDNA da infettato le cellule per l'imparziale identificazione del genoma virale proteine associate mediante spettrometria di massa. iPOND è stato determinante per l'indagine delle dinamiche di forcella di replicazione cellulare.
Per la purificazione selettiva di genomi virali da cellule infette, la replica di vDNA è etichettata con nucleosidi Etinil per volta, 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) o 5-Etinil-2-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguita da covalente Coniugazione di azoturo di biotina tramite clic su chimica per facilitare purificazione singolo passo del genoma virale e proteine associate su perline rivestite con streptavidina (Figura 2B). D'importanza, le infezioni avvengono nelle cellule fisse, che non sono impegnate nella replicazione del DNA cellulare per attivare specifici di etichettatura di vDNA. Inoltre, l'infezione HSV-1 provoca l'arresto del ciclo cellulare ed inibisce cellular DNA replica23,24. Virus può essere prelabeled prima dell'infezione per l'analisi di proteine associate con genomi virali in ingresso (Figura 1A) o con l'etichetta durante la replicazione del DNA per l'analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B) 25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. Inoltre, vDNA Etinil-modificato può essere coniugato covalentemente a un fluoroforo per indagine spaziale della dinamica della proteina (Figura 2A e Figura 3). Formazione immagine permette la visualizzazione diretta del vDNA è un approccio gratuito per la validazione delle interazioni della proteina-vDNA e può essere adattata per tenere traccia di genomi virali durante l'infezione. Ci aspettiamo che questi approcci potrebbero essere ulteriormente modificati per studiare qualsiasi aspetto dell'infezione herpesviral, compresa la latenza e riattivazione e di studiare altri virus a DNA. Inoltre, etichettatura con uridina 5-Etinil potrebbe consentire l'analisi di genomi virali RNA (UE).

<table><tbody><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&amp;nbsp; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stocks with titers greater than 1x10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL work best</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp; column (PD-10 Desalting Column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-Ethynyl-2&amp;acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dilute to 1x in sterile water before use)</td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &amp;deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>(+) Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C for up to 1 year&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td></tr><tr><td>Freezing buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &amp;mu;L 50x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli sample buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&amp;nbsp; &amp;deg;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td></tr><tr><td>Cap locks for 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard western blotting reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Prepare 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Prepare according to manufactorer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-ICP8 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb solution</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope equipped with imaging software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C and 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

L'obiettivo del presente protocollo è per isolare il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) DNA da cellule infettate per l'identificazione di associato virale e proteine cellulari di spettrometria di massa. Anche se le proteine che interagiscono con genomi virali svolgono un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione, un'analisi completa delle proteine del genoma virale associato non era in precedenza fattibile. Qui dimostriamo un metodo che consente la purificazione diretta del genoma di HSV-1 da cellule infette. Replica del DNA virale in modo selettivo è etichettata con nucleotidi modificati che contengono un gruppo funzionale di alchini. Con etichetta DNA quindi è specificamente e irreversibilmente contrassegnato tramite il legame covalente di azide biotina tramite un rame (I)-catalizzato reazione di cicloaddizione o clic di azide-alchino. Biotina-etichetta DNA viene purificata su rivestite di streptavidina e proteine associate sono eluite e identificate mediante spettrometria di massa. Questo metodo consente il targeting selettivo e l'isolamento di HSV-1 replica forchette o interi genomi da ambienti biologici complessi. Inoltre, l'adattamento di questo approccio vi permetterà per l'indagine sui diversi aspetti della infezione herpesviral, nonché l'esame dei genomi di altri virus a DNA.

L'uso della chimica clicca per la purificazione di DNA dalle cellule è stata compiuta in primo luogo il metodo di iPOND21. Lo scopo di iPOND è quello di purificare le forcelle di replicazione cellulare per l'identificazione di proteine associate. Abbiamo adattato questa tecnica per studiare specificatamente interazioni proteina vDNA durante l'infezione. Manipolazione dell'approccio di etichettare genomi virali con EdC (Figura 1), com...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. L'obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando &quot;Genomica singolo virus &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analisi di SARS-CoV-2 utilizzando la tecnologia dual-reporter e multiplex

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento delle strategie antivirali attraverso nuove tecniche di immunocattura e spettrometria di massa

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando "Genomica singolo virus '

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

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Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification