NGL è stato sostenuto dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Noi riconosciamo con gratitudine Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) per la loro lettura critica del manoscritto.

Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l&#39;approvazione etica animale deve essere dato dal Research Comitato Etico Locale e la revisione Istituzionali Boards. Quando si lavora con sangue animale, cellule, o di agenti pericolosi, come indicato in questo protocollo, le azioni di biosicurezza e di sicurezza di laboratorio adeguate devono essere seguite. 1. Manipolazione Mouse e tessuto Collection <ol><li> Preparare una workstation sterile e ottenere strumenti sterili per la raccolta dei tessuti. Questi strumenti comprendono grandi e piccole forbici chirurgiche, pinze, pinzette e fine-tip. Includere piccoli piatti Petri etichettate con i nomi dei tessuti appropriati, riempite con soluzione 1x PBS (PBS) (3 - 5 ml) equilibrati a RT (20 - 22 ° C). Anche un grande capsula di Petri, senza etichetta, riempita con una soluzione 1x PBS (10 - 15 ml). </li><li> Eutanasia di un mouse incinta (10,5-19,0 ​​giorni dopo coitum (DPC) o prima della consegna) utilizzando l&#39;anidride carbonica (CO 2). Per assicurare che il mouse è eutanasia, utilizzare la tecnica dislocazione cervicale. Nota: Prima di 10.5 dpc, è difficile separare manualmente i tessuti deciduali dai tessuti uterini. Se non è necessario l&#39;isolamento di leucociti decidui, leucociti dai tessuti uterini di topi non gravide o quelli di topi a &lt;10,5 dpc possono essere eseguite anche seguendo questo protocollo. </li><li> Utilizzando un paio di forbici chirurgiche sterili, rimuovere completamente la parte addominale inferiore della pelle e del tessuto muscolare. Con una pinza, farsi da parte tutti gli altri organi, fino dell&#39;utero e delle ovaie sono visibili. Con l&#39;utero ancora attaccato, utilizzare la pinza per spostarlo al di fuori della cavità peritoneale (Figura 1A). </li><li> Individuare le ovaie distali al ovidotto e uterotubal svincolo di ogni corno uterino. Utilizzando le piccole forbici chirurgiche, fare una incisione a livello della giunzione uterotubal e separare le corna uterine dal mesentere contenente i vasi uterini; quindi,accise alla cervice per staccare le corna uterine dalla cavità peritoneale (Figura 1B). </li><li> Con piccole forbici chirurgiche, fare un&#39;incisione tra il collo dell&#39;utero e il segmento inferiore delle corna uterine. Lascia attaccato una porzione della cervice durante questo processo (Figura 1C) per evitare l&#39;apertura del corno uterino. </li><li> Immergere le corna uterine (compreso il collo dell&#39;utero) in un grande piatto di Petri riempite con soluzione PBS 1x (10 - 15 ml) per idratare i siti di impianto. </li><li> Mentre era ancora immerso in soluzione PBS 1x, tagliare qualsiasi grasso dalle corna uterine con piccole forbici chirurgiche. Mantenere i tessuti immersi in soluzione PBS 1x per tutta la dissezione. </li><li> Tenendo le corna uterine in posizione con le pinze, rimuovere uno dei siti di impianto dal dell&#39;utero con un taglio trasversale attraverso la regione inter-impianto, utilizzando i piccoli forbici chirurgiche (Figura 1D). Il sito di impianto contiene il feto, circondato dallamembrana corioallantoidea, e il uterino, decidua e tessuti placentari. </li><li> Utilizzando le pinze, tenere il sito al suo posto e fare una piccola incisione nella parete uterina adiacente al placentare e tessuti deciduali (Figura 1E). Tagliare lungo il perimetro della placenta / decidua finché questi separarsi sia dalla parete uterina e la membrana corioallantoidea che comprende il feto (Figura 1F). </li><li> Rimuovere la placenta e tessuti deciduali annessi e posto in soluzione PBS 1x (3-5 ml; vedere il punto 1.12). </li><li> Posizionare il feto circondato dalla membrana corioallantoidea attaccato ai tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con soluzione PBS 1x (3 - 5 ml). L&#39;idratazione di questi tessuti faciliterà la separazione della membrana corioallantoidea dalla parete uterina (vedere fase 1.14). </li><li> Utilizzando un paio di pinzette fine-tip, buccia delicatamente il tessuto deciduali (strato bianco-grigio) dalla superficie placentare. Eseguire questomuoversi con cautela per mantenere l&#39;integrità della placenta e dei tessuti deciduali (Figura 1G). </li><li> Posizionare la placenta e tessuti deciduali in due piatti etichettati separatamente Petri riempite con soluzione PBS 1x (3-5 ml). </li><li> Rimuovere delicatamente la parete uterina dalla membrana corioallantoidea con le pinzette fine-tip. Questi sono i tessuti uterini. </li><li> Posizionare i tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con una soluzione 1x PBS (3-5 ml). </li><li> Ripetere i passaggi da 1.8 tramite 1.15 finché non sono stati elaborati tutti i siti di impianto. </li><li> Raccogliere diversi uterino, decidua, e tessuti placentari per migliorare la resa delle celle durante la digestione enzimatica. La quantità di tessuti dipende dalla dimensione cucciolata; tuttavia, l&#39;isolamento dei leucociti richiede&gt; 2 pezzi di tessuto. Nota: Per informazioni più dettagliate in merito alla dissezione dei siti di impianto in giorni diversi gestazionali, visualizzare le immagini presenti nel secondo capitolo della Guida per investigatisu di mouse gravidanza 42. </li></ol> 2. uterino, deciduale e placentare Tissue dissociazione <ol><li> Etichetta diversi sterile 2 ml provette coniche con il nome di tessuto adeguato e inserire una fiala con 1.000 ml di soluzione enzimatica su ghiaccio. </li><li> Dalla piastra Petri riempita con una soluzione 1x PBS, trasferire due pezzi (100-150 mg) del uterina, decidua, o tessuti placentari per una etichetta 2 ml tubo conico. </li><li> Aggiungere 500 pl di soluzione enzimatica fredda in ciascuna 2 ml tubo conico. </li><li> Con sottili forbici sterili, cominciare dissociare il tessuto immerso nella soluzione enzimatica finché non viene finemente macinata. Nel corso del tempo, la sospensione svilupperà un aspetto lattiginoso. Questa operazione non deve superare più di 2 minuti per evitare un eccesso di manipolazione del campione. </li><li> Una volta che il tessuto è stato dissociato, aggiungere un extra di 500 ml di soluzione enzimatica fredda al tubo conico 2 ml. </li><li> Posizionare il tubo conico 2 ml su ghiaccio. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.6 con ciascun tessuto fino a quando sono stati elaborati tutti i tessuti. </li><li> Trasferire 2 ml provette coniche con il tessuto omogeneizzato (tessuto tritato + soluzione enzimatica) campioni dal ghiaccio in un incubatore a 37 ° C ed effettuare un&#39;agitazione orbitale dolce (80 rpm). Incubare per 30 - 35 min. Assicurarsi che la temperatura dell&#39;incubatrice è stabilizzata prima di iniziare il tempo di incubazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere le 2 ml conici con i tessuti dissociate dal termostato e disporli sul ghiaccio per evitare ulteriori digestione. </li><li> Etichetta sterili 50 ml provette coniche in base al tipo di tessuto. Togliere i coperchi e sostituirli con un colino cellula sterile (100 micron dimensione dei pori). </li><li> Versare i tessuti dissociate dalle ml 2 tubi coniche attraverso il filtro delle cellule utilizzando ~ 20 ml di soluzione 1x PBS. I frammenti di tessuto rimarranno nel filtro cella e la sospensione cellulare passeranno attraverso di esso. </li><li> Lavare il ditessuti ssociated nel colino cella 2 - 3 volte con 20 ml di soluzione 1x PBS utilizzando una pipetta di trasferimento. </li><li> Sciacquare i vuoti 2 ml provette coniche con la soluzione PBS 1x (1 ml) e versare il contenuto attraverso i filtri di cella. </li><li> Rimuovere i filtri cellulari dai tubi coniche ml 50 e sostituire i coperchi. Centrifugare le provette a 1.250 g per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Con cautela, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Il pellet cellulare contiene i leucociti isolati e cellule stromali. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno di coltura RPMI senza siero fetale bovino (FBS). Mescolare delicatamente. Non usare vortice. </li><li> Aggiungere 500 ml di FBS ordinate in una provetta di polistirene plastica da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 1100 xg senza il freno a RT a pellet cellule vitali mentre debris cellulare viene mantenuto all&#39;interfaccia PBS / FBS. </li><li> Aspirare il surnatante senza toccare il pellet. Il cell pellet contiene cellule per lo più vitali. </li><li> Facoltativamente: per concentrare le cellule mononucleate, utilizzare una soluzione satura polisaccaride 20%, come descritto di seguito. <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1.000 ml di RPMI terreno di coltura senza FBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20% di soluzione satura polisaccaride in una provetta di plastica di polistirene da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima a questa soluzione, secondo le istruzioni del produttore. Mentre stratificazione del campione, evitare di mescolare la soluzione satura polisaccaride 20% con la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. E &#39;molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e perdere il gradiente. Le cellule mononucleari si trovano nell&#39;interfaccia tra la soluzione satura polisaccaride 20% e la soluzione PBS 1x. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet cellulare contiene cellule mononucleari per lo più. Note: Per eseguire la vitalità di colorazione e colorazione intracellulare, vedere il passaggio 3. Per eseguire immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 4. Per eseguire la vitalità di colorazione e solo la colorazione extracellulare, vedere il passaggio 5. Per eseguire una coltura cellulare di leucociti isolati, vedere il passaggio 6. Per eseguire separazione delle cellule magnetico, vedi punto 7. </li></ol></li></ol> 3. Viability colorazione delle celle risolvibile <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1.100 ml di soluzione PBS 1x. Mescolare delicatamente con un micro-pipetta. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un tubo di plastica 5 ml polistirene. Aggiungere 400 ml di soluzione PBS 1x al tubo di polistirene da 5 ml. Questo tubo è un controllo per il tessuto auto-fluorescenza. Conservare a 4 ° C fino al punto 3.5. </li><li> Trasferire le restanti 1.000 ml di sospensione cellulare in una nuova provetta di polistirene plastica 5 ml. Aggiungere 1 ml di tintura viabilità e omogeneizzare delicatamente. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 1,000 &amp; #181; l di soluzione 1x PBS. Mescolare delicatamente a mano. </li><li> Centrifuga entrambi provette da 5 ml in polistirolo di plastica (i punti 3.2 e 3.3) a 1250 g per 10 minuti a 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare (passo 3,3) saranno utilizzati al punto 4. L&#39;pellet (punto 3.2), servirà come controllo per il tessuto auto-fluorescenza. </li></ol> 4. Immunofenotipizzazione <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 50 ml di anti-topo CD16 / CD32 (diluito 1: 100 in tampone FACS [0.1% di BSA, 0,05% di sodio azide, soluzione 1x PBS, pH 7.4]). Mescolare la sospensione cellulare con delicatezza. Non utilizzare il vortice. </li><li> Incubare la sospensione di cellule in provette di polistirene da 5 ml al buio a 4 ° C per 10 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 50 ml di ogni anti-leucociti anticorpo monoclonale che reagisce con marcatori di superficie cellulare extracellulari o anticorpo controllo isotipico corrispondenza (diluizioni degli anticorpi devono essere convalidati). Ad esempio, analizzare leucociti sottopopolazioni, utilizzare anti-moutilizzare gli anticorpi che reagiscono con i seguenti marcatori di superficie di leucociti-cell: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabella 1). </li><li> Una volta che gli anticorpi contro marcatori extracellulari sono stati aggiunti al tubo di polistirene di plastica da 5 ml, mescolare delicatamente. Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante questa incubazione, preparare e pre-riscaldare la soluzione tampone di fissaggio (diluito con acqua deionizzata, 1: 5) a 37 ° C, se necessario. Tenere il tampone a 37 ° C al buio fino a quando il suo utilizzo è necessario. </li><li> Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 500 ml di tampone FACS nel tubo di plastica polistirolo 5 ml e mescolare delicatamente. Questo passo è necessario per lavare le cellule ed eliminare ogni eccesso di anticorpo non legato. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. Nota: se non è richiesta la colorazione intracellulare, vedere punto 5. Se è necessaria colorazione intracellulare, eseguire permeabilizzazione e intracellularicolorazione lare qui, e poi procedere con la fissazione (passo 4.8). </li><li> Aggiungere 500 microlitri della soluzione di tampone di fissaggio pre-riscaldato al pellet e incubare al buio per 10 min a 37 ° C. </li><li> Dispensare 500 ml di tampone FACS nella provetta di polistirene di plastica da 5 ml. Mescolare delicatamente. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone FACS per ogni campione. Questi campioni possono essere analizzati mediante citometria a flusso. Acquisire subito i campioni per i migliori risultati. </li></ol> 5. Viability colorazione delle celle irreparabili <ol><li> Dopo immunofenotipizzazione extracellulare, risospendere il pellet cellulare in 500 ml di buffer di FACS. </li><li> Aggiungere 1 ml di 4 &#39;, 6-dicloridrato diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 200 mg / ml) appena prima di acquisire il campione. </li><li> Visualizzare i campioni entro 1-2 minuti dopo l&#39;aggiunta di DAPI utilizzando un citofluorimetro. </li></ol><ol><li> Preparare una stazione di lavoro sotto una cappa aspirante sterile. Pre-riscaldare il terreno di coltura RPMI a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1000 ml di tampone FACS per la conta cellulare. </li><li> Contare il numero di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o emocitometro e la soluzione blu 0,4% trypan, seguendo le istruzioni del produttore. Registrare il conteggio totale delle cellule vive. </li><li> Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 minuti per rimuovere il tampone FACS. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di terreno di coltura RPMI preriscaldata pipettando delicatamente 2 a 3 volte. </li><li> Piatto il numero desiderato di cellule in una piastra da 24 pozzetti sterili e incubare a 37 ° C. Il tempo di incubazione sarà determinato dalla domanda di ricerca. </li></ol> 7. ordinamento delle cellule magnetiche <ol><li> Impostare una stazione di lavoro pulito, con i seguenti materiali: colonne MS, separatore cellulare magnetico, 15tubi ml coniche, 30 micron filtri pre-separazione, e un multi-stand. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone MACS (0,5% di BSA, 2 mM EDTA, soluzione 1x PBS, pH 7,2). </li><li> L&#39;utilizzo di un contatore di cellule automatico o emocitometro e lo 0,4% trypan soluzione blu, contare e registrare il conteggio totale delle cellule vive. </li><li> Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere altri 500 ml di tampone MACS. </li><li> Procedere per eseguire la separazione magnetica seguendo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Determinare purezza, in citometria di flusso o microscopia. </li></ol>

Gli autori rilevano conflitti di interesse.

La raccolta di dati coerenti che registra le caratteristiche fenotipiche e abbondanza di leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale è essenziale per comprendere la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Sono state descritte diverse tecniche che facilitano l&#39;isolamento di leucociti infiltranti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale durante la gravidanza 31,38,39,43-46. Tuttavia, ogni tecnica è differente, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richied...

Tolleranza immunitaria in gravidanza è un periodo in cui i cambiamenti caratteristici si verificano all&#39;interno del sistema immunitario della madre. Queste modifiche permettono alla madre di tollerare il feto, un innesto semi-allogenico 1. Il feto esprime paterna complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) 2, e le cellule fetali sono stati trovati nel sangue materno 3; tuttavia, il feto non è respinta 4,5. Questo enigma non è pienamente compresa. L&#39;ipotesi più recente afferma che la tolleranza materno-fetale è creato durante il coito e la fecondazione 6,7 e mantenuto per sostenere una gravidanza a termine 8-10. La composizione della tolleranza materno-fetale è considerata un meccanismo di malattia durante i primi e ultime fasi della gravidanza, 10-16. Tolleranza materno-fetale prevede la partecipazione di varie sottopopolazioni di leucociti, comprese le cellule T (cellule T regolatorie, cellule Th1, Th2 e cellule Th17), macrophages, neutrofili, mastociti, cellule NK, e cellule NKT, cellule dendritiche e le cellule B, che il cambiamento nella densità e localizzazione per tutta la gravidanza 15,17-19. Tolleranza materno-fetale è arricchito all&#39;interfaccia materno-fetale 20 - sede anatomica in cui il sistema immunitario della madre interagisce con gli antigeni fetali 20,21. L&#39;interfaccia materno-fetale viene creato durante placenta quando le cellule del trofoblasto extravilloso fetali invadono la mucosa uterina 22-24. Sul lato fetale di questa interfaccia, le membrane che circondano il feto creano una superficie epiteliale specializzata all&#39;interno della placenta e le cellule syncytiotrophoblast controllano lo scambio di nutrienti attraverso il contatto diretto con il sangue materno 22. Sul lato materno dell&#39;interfaccia, la decidua recluta un pool eterogeneo di leucociti che nei topi rappresentano il 30% al 50% di tutte le cellule deciduali. Oltre alla loro partecipazione a MaternAl tolleranza immunitaria, queste cellule sono fattori chiave per diversi processi durante la gravidanza, per esempio., la protezione del tratto riproduttivo dalle infezioni, la fecondazione, l&#39;impianto dell&#39;embrione 7,25, decidual angiogenesi 26, rimodellamento vascolare 24,27, trofoblasto invasione 28, placentare Sviluppo 24,25, e, in ultima analisi, il lavoro e la consegna 15,17. Pertanto, lo studio dei leucociti coinvolti nella tolleranza materno-fetale è essenziale per chiarire la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Mentre l&#39;uso di immunoistochimica e immunofluorescenza ha generato i dati per la visualizzazione diretta e la localizzazione di uterina, decidua, o leucociti placentari 29,30, citofluorimetria analisi ha ulteriormente evidenziato specifici sottoinsiemi di leucociti in ciascuno di questi tessuti 31,32. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per determinare la densità e la proporzione di maternal-fetale interfaccia leucociti 33 e di espressione livelli di proteine ​​extracellulari e intracellulari 8-10,34. Analisi citofluorimetrica dei leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale richiede una cella singola sospensione. Per isolare leucociti infiltranti dal decidua, uterino, e tessuti placentari, sono stati utilizzati due metodi di dissociazione tissutale: meccanica ed enzimatica. Entrambi i metodi consentono la separazione dei leucociti infiltrati dalla matrice extracellulare (ECM) di questi tessuti. Dissociazione enzimatica dei tessuti è superiore alla dissociazione dei tessuti meccanica in quanto consente una resa superiore di leucociti con danni meno shear-force-associati 35. Di conseguenza, la dissociazione tessuto meccanico richiede pooling tessuti 36, che possono aumentare la variabilità e l&#39;eterogeneità dei campioni. Tuttavia, la dissociazione meccanica può essere la scelta quando l&#39;antigene di interesse può essere modificato per dissociazione enzimatica o quando la funzionalità della cellas di necessità interessi da preservare (ad es., la citotossicità delle cellule NK) 35. L&#39;uso di proteolisi con enzimi specifici per degradare la ECM elimina le basse rese osservati con la dissociazione meccanica. Diversi studi hanno riportato l&#39;uso di tripsina 32, collagenasi 37, DNase 31, dispasi 38, e cocktail commerciali di vari enzimi 32,39. Tuttavia, la natura e la concentrazione di diversi enzimi e la durata della digestione devono essere accuratamente definiti e convalidati, al fine di assicurare il mantenimento dell&#39;integrità degli epitopi antigenici superficie cellulare necessari per immunofenotipizzazione. Le varie strutture superficiali sono differenzialmente sensibili alla distruzione da diversi enzimi, con alcuni enzimi, come la tripsina, essendo noto per strippaggio epitopi superficie leucociti riconosciuti da molti anticorpi monoclonali. Introdotto nel presente documento è un metodo che utilizza un proteolytic e collagenolitica cocktail enzimatico, chiamato Accutase. Questa soluzione enzimatica è abbastanza delicato mentre ancora efficiente in dissociare tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale, e non richiede l&#39;aggiunta di altri reagenti dissociazione o siero per terminare la reazione di dissociazione. Inoltre, è pronto per l&#39;uso come fornito e, anche se il tempo di dissociazione deve essere convalidata, è più robusto rispetto ai sopra citati enzimi 40,41. L&#39;utilizzo di una combinazione di entrambi i tipi di disaggregazione tessuto migliora la qualità e la quantità di cellule ottenute; in tal modo, diversi studi hanno implementato l&#39;uso combinato di dissociazione meccanica ed enzimatica con risultati soddisfacenti 31,32,37. Il protocollo qui descritto è stato fondato e validato nel nostro laboratorio; si utilizza una combinazione di una dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta. Questo protocollo permette lo studio ulteriore isolamento e dileucociti infiltranti in tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale (utero, decidua, e placenta). Il seguente protocollo mantiene anche l&#39;integrità dei marcatori di superficie delle cellule e dei rendimenti cellule vitali sufficienti per applicazioni a valle come dimostrato dalle analisi di citometria di flusso. Infine, questo protocollo mantiene la consistenza della preparazione cellulare per l&#39;analisi e il confronto dei diversi tessuti murini che compongono l&#39;interfaccia materno-fetale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
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			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
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			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Tolleranza immunitaria in gravidanza richiede che il sistema immunitario della madre subisce cambiamenti distintivi, al fine di accogliere e nutrire il feto in via di sviluppo. Questa tolleranza è iniziata durante il coito, stabilito durante la fecondazione e l&#39;impianto, e mantenuto per tutta la gravidanza. Mediatori attivi cellulari e molecolari della tolleranza materno-fetale sono arricchiti nel sito di contatto tra tessuti fetali e materni, noto come l&#39;interfaccia materno-fetale, che comprende la placenta e l&#39;utero e tessuti deciduali. Questa interfaccia è costituito da cellule stromali e leucociti infiltranti, e le loro caratteristiche fenotipiche abbondanza e cambiano nel corso della gravidanza. Leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale includono neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, le cellule T, cellule B, le cellule NK e cellule NKT che creano insieme il micro-ambiente locale che sostiene la gravidanza. Uno squilibrio tra queste cellule o qualsiasi inappropalterazione riate nei loro fenotipo è considerato un meccanismo di malattia in gravidanza. Pertanto, lo studio di leucociti che si infiltrano l&#39;interfaccia materno-fetale è essenziale al fine di chiarire i meccanismi immunitari che portano a complicazioni legate alla gravidanza. Qui descritto è un protocollo che utilizza una combinazione di dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta con proteolitica e cocktail enzimatica collagenolitica isolare i leucociti infiltranti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale. Questo protocollo consente l&#39;isolamento di un alto numero di leucociti vitali (&gt; 70%) con sufficientemente conservati proprietà antigeniche e funzionali. Isolati leucociti possono poi essere analizzati da diverse tecniche, tra cui immunofenotipizzazione, separazione delle cellule, l&#39;imaging, immunoblotting, espressione di mRNA, coltura cellulare, e in vitro saggi funzionali quali reazioni contrastanti leucociti, la proliferazione, o saggi di citotossicità.

La dissezione dei tessuti murini dall&#39;interfaccia materno-fetale è mostrato in Figura 1; questa procedura prevede l&#39;apertura della cavità peritoneale (Figura 1A, B), corna uterine (Figura 1C), compresi i siti di impianto (Figura 1D), e la raccolta di tessuti uterini (Figura 1E), la placenta (Figura 1F), e tessuti decidua (Figura 1G) a 16.5 dpc. La Figura 2 mostra la morfologia...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Views.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

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Immunologia e infezioni

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l&#39;isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...