Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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NGL è stato sostenuto dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Noi riconosciamo con gratitudine Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) per la loro lettura critica del manoscritto.

Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l&#39;approvazione etica animale deve essere dato dal Research Comitato Etico Locale e la revisione Istituzionali Boards. Quando si lavora con sangue animale, cellule, o di agenti pericolosi, come indicato in questo protocollo, le azioni di biosicurezza e di sicurezza di laboratorio adeguate devono essere seguite. 1. Manipolazione Mouse e tessuto Collection <ol><li> Preparare una workstation sterile e ottenere strumenti sterili per la raccolta dei tessuti. Questi strumenti comprendono grandi e piccole forbici chirurgiche, pinze, pinzette e fine-tip. Includere piccoli piatti Petri etichettate con i nomi dei tessuti appropriati, riempite con soluzione 1x PBS (PBS) (3 - 5 ml) equilibrati a RT (20 - 22 ° C). Anche un grande capsula di Petri, senza etichetta, riempita con una soluzione 1x PBS (10 - 15 ml). </li><li> Eutanasia di un mouse incinta (10,5-19,0 ​​giorni dopo coitum (DPC) o prima della consegna) utilizzando l&#39;anidride carbonica (CO 2). Per assicurare che il mouse è eutanasia, utilizzare la tecnica dislocazione cervicale. Nota: Prima di 10.5 dpc, è difficile separare manualmente i tessuti deciduali dai tessuti uterini. Se non è necessario l&#39;isolamento di leucociti decidui, leucociti dai tessuti uterini di topi non gravide o quelli di topi a &lt;10,5 dpc possono essere eseguite anche seguendo questo protocollo. </li><li> Utilizzando un paio di forbici chirurgiche sterili, rimuovere completamente la parte addominale inferiore della pelle e del tessuto muscolare. Con una pinza, farsi da parte tutti gli altri organi, fino dell&#39;utero e delle ovaie sono visibili. Con l&#39;utero ancora attaccato, utilizzare la pinza per spostarlo al di fuori della cavità peritoneale (Figura 1A). </li><li> Individuare le ovaie distali al ovidotto e uterotubal svincolo di ogni corno uterino. Utilizzando le piccole forbici chirurgiche, fare una incisione a livello della giunzione uterotubal e separare le corna uterine dal mesentere contenente i vasi uterini; quindi,accise alla cervice per staccare le corna uterine dalla cavità peritoneale (Figura 1B). </li><li> Con piccole forbici chirurgiche, fare un&#39;incisione tra il collo dell&#39;utero e il segmento inferiore delle corna uterine. Lascia attaccato una porzione della cervice durante questo processo (Figura 1C) per evitare l&#39;apertura del corno uterino. </li><li> Immergere le corna uterine (compreso il collo dell&#39;utero) in un grande piatto di Petri riempite con soluzione PBS 1x (10 - 15 ml) per idratare i siti di impianto. </li><li> Mentre era ancora immerso in soluzione PBS 1x, tagliare qualsiasi grasso dalle corna uterine con piccole forbici chirurgiche. Mantenere i tessuti immersi in soluzione PBS 1x per tutta la dissezione. </li><li> Tenendo le corna uterine in posizione con le pinze, rimuovere uno dei siti di impianto dal dell&#39;utero con un taglio trasversale attraverso la regione inter-impianto, utilizzando i piccoli forbici chirurgiche (Figura 1D). Il sito di impianto contiene il feto, circondato dallamembrana corioallantoidea, e il uterino, decidua e tessuti placentari. </li><li> Utilizzando le pinze, tenere il sito al suo posto e fare una piccola incisione nella parete uterina adiacente al placentare e tessuti deciduali (Figura 1E). Tagliare lungo il perimetro della placenta / decidua finché questi separarsi sia dalla parete uterina e la membrana corioallantoidea che comprende il feto (Figura 1F). </li><li> Rimuovere la placenta e tessuti deciduali annessi e posto in soluzione PBS 1x (3-5 ml; vedere il punto 1.12). </li><li> Posizionare il feto circondato dalla membrana corioallantoidea attaccato ai tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con soluzione PBS 1x (3 - 5 ml). L&#39;idratazione di questi tessuti faciliterà la separazione della membrana corioallantoidea dalla parete uterina (vedere fase 1.14). </li><li> Utilizzando un paio di pinzette fine-tip, buccia delicatamente il tessuto deciduali (strato bianco-grigio) dalla superficie placentare. Eseguire questomuoversi con cautela per mantenere l&#39;integrità della placenta e dei tessuti deciduali (Figura 1G). </li><li> Posizionare la placenta e tessuti deciduali in due piatti etichettati separatamente Petri riempite con soluzione PBS 1x (3-5 ml). </li><li> Rimuovere delicatamente la parete uterina dalla membrana corioallantoidea con le pinzette fine-tip. Questi sono i tessuti uterini. </li><li> Posizionare i tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con una soluzione 1x PBS (3-5 ml). </li><li> Ripetere i passaggi da 1.8 tramite 1.15 finché non sono stati elaborati tutti i siti di impianto. </li><li> Raccogliere diversi uterino, decidua, e tessuti placentari per migliorare la resa delle celle durante la digestione enzimatica. La quantità di tessuti dipende dalla dimensione cucciolata; tuttavia, l&#39;isolamento dei leucociti richiede&gt; 2 pezzi di tessuto. Nota: Per informazioni più dettagliate in merito alla dissezione dei siti di impianto in giorni diversi gestazionali, visualizzare le immagini presenti nel secondo capitolo della Guida per investigatisu di mouse gravidanza 42. </li></ol> 2. uterino, deciduale e placentare Tissue dissociazione <ol><li> Etichetta diversi sterile 2 ml provette coniche con il nome di tessuto adeguato e inserire una fiala con 1.000 ml di soluzione enzimatica su ghiaccio. </li><li> Dalla piastra Petri riempita con una soluzione 1x PBS, trasferire due pezzi (100-150 mg) del uterina, decidua, o tessuti placentari per una etichetta 2 ml tubo conico. </li><li> Aggiungere 500 pl di soluzione enzimatica fredda in ciascuna 2 ml tubo conico. </li><li> Con sottili forbici sterili, cominciare dissociare il tessuto immerso nella soluzione enzimatica finché non viene finemente macinata. Nel corso del tempo, la sospensione svilupperà un aspetto lattiginoso. Questa operazione non deve superare più di 2 minuti per evitare un eccesso di manipolazione del campione. </li><li> Una volta che il tessuto è stato dissociato, aggiungere un extra di 500 ml di soluzione enzimatica fredda al tubo conico 2 ml. </li><li> Posizionare il tubo conico 2 ml su ghiaccio. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.6 con ciascun tessuto fino a quando sono stati elaborati tutti i tessuti. </li><li> Trasferire 2 ml provette coniche con il tessuto omogeneizzato (tessuto tritato + soluzione enzimatica) campioni dal ghiaccio in un incubatore a 37 ° C ed effettuare un&#39;agitazione orbitale dolce (80 rpm). Incubare per 30 - 35 min. Assicurarsi che la temperatura dell&#39;incubatrice è stabilizzata prima di iniziare il tempo di incubazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere le 2 ml conici con i tessuti dissociate dal termostato e disporli sul ghiaccio per evitare ulteriori digestione. </li><li> Etichetta sterili 50 ml provette coniche in base al tipo di tessuto. Togliere i coperchi e sostituirli con un colino cellula sterile (100 micron dimensione dei pori). </li><li> Versare i tessuti dissociate dalle ml 2 tubi coniche attraverso il filtro delle cellule utilizzando ~ 20 ml di soluzione 1x PBS. I frammenti di tessuto rimarranno nel filtro cella e la sospensione cellulare passeranno attraverso di esso. </li><li> Lavare il ditessuti ssociated nel colino cella 2 - 3 volte con 20 ml di soluzione 1x PBS utilizzando una pipetta di trasferimento. </li><li> Sciacquare i vuoti 2 ml provette coniche con la soluzione PBS 1x (1 ml) e versare il contenuto attraverso i filtri di cella. </li><li> Rimuovere i filtri cellulari dai tubi coniche ml 50 e sostituire i coperchi. Centrifugare le provette a 1.250 g per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Con cautela, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Il pellet cellulare contiene i leucociti isolati e cellule stromali. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno di coltura RPMI senza siero fetale bovino (FBS). Mescolare delicatamente. Non usare vortice. </li><li> Aggiungere 500 ml di FBS ordinate in una provetta di polistirene plastica da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 1100 xg senza il freno a RT a pellet cellule vitali mentre debris cellulare viene mantenuto all&#39;interfaccia PBS / FBS. </li><li> Aspirare il surnatante senza toccare il pellet. Il cell pellet contiene cellule per lo più vitali. </li><li> Facoltativamente: per concentrare le cellule mononucleate, utilizzare una soluzione satura polisaccaride 20%, come descritto di seguito. <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1.000 ml di RPMI terreno di coltura senza FBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20% di soluzione satura polisaccaride in una provetta di plastica di polistirene da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima a questa soluzione, secondo le istruzioni del produttore. Mentre stratificazione del campione, evitare di mescolare la soluzione satura polisaccaride 20% con la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. E &#39;molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e perdere il gradiente. Le cellule mononucleari si trovano nell&#39;interfaccia tra la soluzione satura polisaccaride 20% e la soluzione PBS 1x. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet cellulare contiene cellule mononucleari per lo più. Note: Per eseguire la vitalità di colorazione e colorazione intracellulare, vedere il passaggio 3. Per eseguire immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 4. Per eseguire la vitalità di colorazione e solo la colorazione extracellulare, vedere il passaggio 5. Per eseguire una coltura cellulare di leucociti isolati, vedere il passaggio 6. Per eseguire separazione delle cellule magnetico, vedi punto 7. </li></ol></li></ol> 3. Viability colorazione delle celle risolvibile <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1.100 ml di soluzione PBS 1x. Mescolare delicatamente con un micro-pipetta. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un tubo di plastica 5 ml polistirene. Aggiungere 400 ml di soluzione PBS 1x al tubo di polistirene da 5 ml. Questo tubo è un controllo per il tessuto auto-fluorescenza. Conservare a 4 ° C fino al punto 3.5. </li><li> Trasferire le restanti 1.000 ml di sospensione cellulare in una nuova provetta di polistirene plastica 5 ml. Aggiungere 1 ml di tintura viabilità e omogeneizzare delicatamente. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 1,000 &amp; #181; l di soluzione 1x PBS. Mescolare delicatamente a mano. </li><li> Centrifuga entrambi provette da 5 ml in polistirolo di plastica (i punti 3.2 e 3.3) a 1250 g per 10 minuti a 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare (passo 3,3) saranno utilizzati al punto 4. L&#39;pellet (punto 3.2), servirà come controllo per il tessuto auto-fluorescenza. </li></ol> 4. Immunofenotipizzazione <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 50 ml di anti-topo CD16 / CD32 (diluito 1: 100 in tampone FACS [0.1% di BSA, 0,05% di sodio azide, soluzione 1x PBS, pH 7.4]). Mescolare la sospensione cellulare con delicatezza. Non utilizzare il vortice. </li><li> Incubare la sospensione di cellule in provette di polistirene da 5 ml al buio a 4 ° C per 10 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 50 ml di ogni anti-leucociti anticorpo monoclonale che reagisce con marcatori di superficie cellulare extracellulari o anticorpo controllo isotipico corrispondenza (diluizioni degli anticorpi devono essere convalidati). Ad esempio, analizzare leucociti sottopopolazioni, utilizzare anti-moutilizzare gli anticorpi che reagiscono con i seguenti marcatori di superficie di leucociti-cell: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabella 1). </li><li> Una volta che gli anticorpi contro marcatori extracellulari sono stati aggiunti al tubo di polistirene di plastica da 5 ml, mescolare delicatamente. Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante questa incubazione, preparare e pre-riscaldare la soluzione tampone di fissaggio (diluito con acqua deionizzata, 1: 5) a 37 ° C, se necessario. Tenere il tampone a 37 ° C al buio fino a quando il suo utilizzo è necessario. </li><li> Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 500 ml di tampone FACS nel tubo di plastica polistirolo 5 ml e mescolare delicatamente. Questo passo è necessario per lavare le cellule ed eliminare ogni eccesso di anticorpo non legato. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. Nota: se non è richiesta la colorazione intracellulare, vedere punto 5. Se è necessaria colorazione intracellulare, eseguire permeabilizzazione e intracellularicolorazione lare qui, e poi procedere con la fissazione (passo 4.8). </li><li> Aggiungere 500 microlitri della soluzione di tampone di fissaggio pre-riscaldato al pellet e incubare al buio per 10 min a 37 ° C. </li><li> Dispensare 500 ml di tampone FACS nella provetta di polistirene di plastica da 5 ml. Mescolare delicatamente. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone FACS per ogni campione. Questi campioni possono essere analizzati mediante citometria a flusso. Acquisire subito i campioni per i migliori risultati. </li></ol> 5. Viability colorazione delle celle irreparabili <ol><li> Dopo immunofenotipizzazione extracellulare, risospendere il pellet cellulare in 500 ml di buffer di FACS. </li><li> Aggiungere 1 ml di 4 &#39;, 6-dicloridrato diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 200 mg / ml) appena prima di acquisire il campione. </li><li> Visualizzare i campioni entro 1-2 minuti dopo l&#39;aggiunta di DAPI utilizzando un citofluorimetro. </li></ol><ol><li> Preparare una stazione di lavoro sotto una cappa aspirante sterile. Pre-riscaldare il terreno di coltura RPMI a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1000 ml di tampone FACS per la conta cellulare. </li><li> Contare il numero di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o emocitometro e la soluzione blu 0,4% trypan, seguendo le istruzioni del produttore. Registrare il conteggio totale delle cellule vive. </li><li> Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 minuti per rimuovere il tampone FACS. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di terreno di coltura RPMI preriscaldata pipettando delicatamente 2 a 3 volte. </li><li> Piatto il numero desiderato di cellule in una piastra da 24 pozzetti sterili e incubare a 37 ° C. Il tempo di incubazione sarà determinato dalla domanda di ricerca. </li></ol> 7. ordinamento delle cellule magnetiche <ol><li> Impostare una stazione di lavoro pulito, con i seguenti materiali: colonne MS, separatore cellulare magnetico, 15tubi ml coniche, 30 micron filtri pre-separazione, e un multi-stand. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone MACS (0,5% di BSA, 2 mM EDTA, soluzione 1x PBS, pH 7,2). </li><li> L&#39;utilizzo di un contatore di cellule automatico o emocitometro e lo 0,4% trypan soluzione blu, contare e registrare il conteggio totale delle cellule vive. </li><li> Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere altri 500 ml di tampone MACS. </li><li> Procedere per eseguire la separazione magnetica seguendo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Determinare purezza, in citometria di flusso o microscopia. </li></ol>

Gli autori rilevano conflitti di interesse.

La raccolta di dati coerenti che registra le caratteristiche fenotipiche e abbondanza di leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale è essenziale per comprendere la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Sono state descritte diverse tecniche che facilitano l&#39;isolamento di leucociti infiltranti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale durante la gravidanza 31,38,39,43-46. Tuttavia, ogni tecnica è differente, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione, non specifica quantità di tessuto, e, soprattutto, non specifica sempre la vitalità delle cellule isolate. Il protocollo qui descritto permette l&#39;isolamento di infiltrazione leucociti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale con elevata redditività, e fornisce informazioni dettagliate sui reagenti commerciali, la preparazione di buffer, le quantità di tessuto, e tempi di incubazione convalidato nellaboratorio. Una delle fasi più critiche del processo di isolamento dei leucociti è la dissociazione dei tessuti; questa fase prevede omogeneizzazione meccanica e / o reazioni enzimatiche che può alterare l&#39;integrità delle proteine ​​extracellulari utilizzati nella caratterizzazione fenotipica 47. Il protocollo qui descritto offre un nuovo approccio che combina l&#39;uso di tecniche dolci dissociazione tissutale meccaniche ed enzimatiche per preservare l&#39;integrità dei marcatori extracellulari nei leucociti isolate dalla placenta e deciduali e uterini tessuti di topi. Enzimi singoli e combinazioni di enzimi differenti sono stati utilizzati per isolare leucociti infiltranti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale 31,32,39,44. In molti casi, questi enzimi che vengono preparati a concentrazioni specifiche a mano in laboratorio possono essere soggetti a errore umano. Qui, invece, un collagenasi purificata / prot neutro ready-to-usefacilità cocktail, Accutase, è stato implementato in laboratorio; come preparato enzimatico disponibile in commercio, è stato dimostrato di fornire risultati affidabili in coltura cellulare 48. Questa soluzione enzimatica è noto per staccare efficacemente macrofagi dalle piastre di coltura senza raschiare e, soprattutto, senza perdere superficie antigeni 48. Questo enzima preparato è stato anche utilizzato per elaborare la digestione dei tessuti del sistema nervoso umani e animali, con conseguente cellule isolate che rimangono vitali sostenibile per lunghi periodi, che ne consenta la successiva coltura 47. Inoltre, questa soluzione enzimatica preserva CD24 antigenicità in cellule isolate da tessuti del sistema nervoso centrale 47. Rispetto al Liberase-1, un altro cocktail di collagenasi e proteasi neutra, né Accutase nè Liberase-1 generare aggregati DNA libero; tuttavia, Accutase è più delicato di Liberase-1 durante la dissociazione dei tessuti 47. La collagenasi / co proteasi neutracktail utilizzato in questo protocollo ha anche dimostrato la superiorità di tripsina nella conservazione di CD44, un gambo cancro marcatore superficie cellulare 49. Gli studi di questo laboratorio hanno sempre osservato che questa soluzione enzimatica preserva antigeni di superficie del mouse leucociti. Infatti, le differenze informative sono state trovate in l&#39;espressione di marcatori extracellulari nei macrofagi (CD11b + F4 80 + cellule /), neutrofili (+ Ly6G + cellule CD11b), cellule NKT (CD3 + CD49b + cellule), le cellule T (CD3 + cellule) e B cellule (B220 + CD19 + cellule), tra cui CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L e CTLA4, e in rilascio di citochine. Pertanto, il metodo qui descritto è ottimale per immunofenotipizzazione di leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale nei topi, come mostrato nei risultati rappresentativi. Un importante vantaggio di questo metodo è la determinazione simultanea di diversi antigeni extracellulari ed intracellulari all&#39;interno del cancello redditività. Il colorante più utilizzato per devitalità cellulare Termine è ioduro di propidio (PI); tuttavia il suo uso è limitato in quanto può essere utilizzato solo in combinazione con FITC. Questo perché PI non può essere distinto adeguatamente dalla maggior parte fluorocromi eccitati da laser blu e rosso 50. Una soluzione è quella di utilizzare DAPI 50 o qualsiasi altro colorante che viene eccitato dal laser UV ma non da laser blu e rosso comunemente usati per immunofenotipizzazione. Questo protocollo permette immunofenotipizzazione di cellule vitali in quanto prevede l&#39;utilizzo di DAPI 50 per celle irreparabili o l&#39;uso della redditività tintura per cellule fissabili. Un secondo importante vantaggio del protocollo qui descritto è che permette l&#39;isolamento di leucociti con un alto rendimento di cellule vitali. I dati rappresentante mostra che il 70% e il 89% delle cellule isolate sono vitali. Questo è di grande importanza in quanto questo protocollo ha consentito lo studio delle proprietà funzionali delle cellule isolate da tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale. Fo l&#39;esempio, le culture dei deciduali e uterine macrofagi e lo studio di rilascio di citochine sotto stimolazione sono stati condotti con questo metodo. Per ottenere risultati soddisfacenti, l&#39;applicazione del protocollo descritto è importante quando si considerano i seguenti fattori: 1) la raccolta dei tessuti deve essere eseguita entro 5 a 10 minuti dopo l&#39;apertura della cavità peritoneale, e questi tessuti devono essere posti su ghiaccio per mantenere la vitalità di le cellule isolate; 2) omogeneizzazione tessuto meccanico deve essere effettuata con le forbici fine-tip e non può superare i 2 min da periodi più lunghi hanno dimostrato di ridurre la resa di cellule vitali; 3) la durata di incubazione con soluzione enzimatica deve essere inferiore a 1 ora dalla sua attività diminuisce dopo questo periodo di tempo; 4) la temperatura di incubazione con la soluzione enzimatica deve essere mantenuta a 37 ° C per ottenere l&#39;attività ottimale di questo cocktail di enzimi; 5) pellet di cellule maniplamento deve essere fatto delicatamente con micropipette perché l&#39;uso del vortice può danneggiare l&#39;integrità delle cellule (cellule isolate sono manipolazione differenziate e brusco può ridurre facilmente la loro vitalità); 6) e buffer temperature centrifuga devono essere mantenute alla stessa temperatura come la sospensione cellulare; 7) cellule isolate devono essere trattati per immunofenotipizzazione o utilizzati immediatamente come loro redditività riduce rapidamente; e 8) durante l&#39;esecuzione immunofenotipizzazione, i campioni devono essere acquisite mediante citometro immediatamente un flusso per i migliori risultati. Una limitazione di questo protocollo è il costo della soluzione enzimatica, che è più costoso di altri enzimi con funzioni simili, ad esempio, tripsina, dispasi II e collagenasi. Tuttavia, i vantaggi che questa soluzione enzimatica visualizza oltre gli enzimi descritti sono superiori. Oltre immunofenotipizzazione e coltura cellulare e la cernita, le future applicazioni di questo protocollo sono numerous e varia. Ad esempio, è ora possibile determinare metilazione del DNA, l&#39;espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (ad esempio, la fagocitosi, citotossicità, proliferazione delle cellule T e plasticità saggi, etc.), e la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno nei leucociti isolati da tessuti murini all&#39;interfaccia materno fetale. Infatti, descrizione di nuove e rare leucociti nei tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale può essere eseguita anche.

Tolleranza immunitaria in gravidanza è un periodo in cui i cambiamenti caratteristici si verificano all&#39;interno del sistema immunitario della madre. Queste modifiche permettono alla madre di tollerare il feto, un innesto semi-allogenico 1. Il feto esprime paterna complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) 2, e le cellule fetali sono stati trovati nel sangue materno 3; tuttavia, il feto non è respinta 4,5. Questo enigma non è pienamente compresa. L&#39;ipotesi più recente afferma che la tolleranza materno-fetale è creato durante il coito e la fecondazione 6,7 e mantenuto per sostenere una gravidanza a termine 8-10. La composizione della tolleranza materno-fetale è considerata un meccanismo di malattia durante i primi e ultime fasi della gravidanza, 10-16. Tolleranza materno-fetale prevede la partecipazione di varie sottopopolazioni di leucociti, comprese le cellule T (cellule T regolatorie, cellule Th1, Th2 e cellule Th17), macrophages, neutrofili, mastociti, cellule NK, e cellule NKT, cellule dendritiche e le cellule B, che il cambiamento nella densità e localizzazione per tutta la gravidanza 15,17-19. Tolleranza materno-fetale è arricchito all&#39;interfaccia materno-fetale 20 - sede anatomica in cui il sistema immunitario della madre interagisce con gli antigeni fetali 20,21. L&#39;interfaccia materno-fetale viene creato durante placenta quando le cellule del trofoblasto extravilloso fetali invadono la mucosa uterina 22-24. Sul lato fetale di questa interfaccia, le membrane che circondano il feto creano una superficie epiteliale specializzata all&#39;interno della placenta e le cellule syncytiotrophoblast controllano lo scambio di nutrienti attraverso il contatto diretto con il sangue materno 22. Sul lato materno dell&#39;interfaccia, la decidua recluta un pool eterogeneo di leucociti che nei topi rappresentano il 30% al 50% di tutte le cellule deciduali. Oltre alla loro partecipazione a MaternAl tolleranza immunitaria, queste cellule sono fattori chiave per diversi processi durante la gravidanza, per esempio., la protezione del tratto riproduttivo dalle infezioni, la fecondazione, l&#39;impianto dell&#39;embrione 7,25, decidual angiogenesi 26, rimodellamento vascolare 24,27, trofoblasto invasione 28, placentare Sviluppo 24,25, e, in ultima analisi, il lavoro e la consegna 15,17. Pertanto, lo studio dei leucociti coinvolti nella tolleranza materno-fetale è essenziale per chiarire la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Mentre l&#39;uso di immunoistochimica e immunofluorescenza ha generato i dati per la visualizzazione diretta e la localizzazione di uterina, decidua, o leucociti placentari 29,30, citofluorimetria analisi ha ulteriormente evidenziato specifici sottoinsiemi di leucociti in ciascuno di questi tessuti 31,32. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per determinare la densità e la proporzione di maternal-fetale interfaccia leucociti 33 e di espressione livelli di proteine ​​extracellulari e intracellulari 8-10,34. Analisi citofluorimetrica dei leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale richiede una cella singola sospensione. Per isolare leucociti infiltranti dal decidua, uterino, e tessuti placentari, sono stati utilizzati due metodi di dissociazione tissutale: meccanica ed enzimatica. Entrambi i metodi consentono la separazione dei leucociti infiltrati dalla matrice extracellulare (ECM) di questi tessuti. Dissociazione enzimatica dei tessuti è superiore alla dissociazione dei tessuti meccanica in quanto consente una resa superiore di leucociti con danni meno shear-force-associati 35. Di conseguenza, la dissociazione tessuto meccanico richiede pooling tessuti 36, che possono aumentare la variabilità e l&#39;eterogeneità dei campioni. Tuttavia, la dissociazione meccanica può essere la scelta quando l&#39;antigene di interesse può essere modificato per dissociazione enzimatica o quando la funzionalità della cellas di necessità interessi da preservare (ad es., la citotossicità delle cellule NK) 35. L&#39;uso di proteolisi con enzimi specifici per degradare la ECM elimina le basse rese osservati con la dissociazione meccanica. Diversi studi hanno riportato l&#39;uso di tripsina 32, collagenasi 37, DNase 31, dispasi 38, e cocktail commerciali di vari enzimi 32,39. Tuttavia, la natura e la concentrazione di diversi enzimi e la durata della digestione devono essere accuratamente definiti e convalidati, al fine di assicurare il mantenimento dell&#39;integrità degli epitopi antigenici superficie cellulare necessari per immunofenotipizzazione. Le varie strutture superficiali sono differenzialmente sensibili alla distruzione da diversi enzimi, con alcuni enzimi, come la tripsina, essendo noto per strippaggio epitopi superficie leucociti riconosciuti da molti anticorpi monoclonali. Introdotto nel presente documento è un metodo che utilizza un proteolytic e collagenolitica cocktail enzimatico, chiamato Accutase. Questa soluzione enzimatica è abbastanza delicato mentre ancora efficiente in dissociare tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale, e non richiede l&#39;aggiunta di altri reagenti dissociazione o siero per terminare la reazione di dissociazione. Inoltre, è pronto per l&#39;uso come fornito e, anche se il tempo di dissociazione deve essere convalidata, è più robusto rispetto ai sopra citati enzimi 40,41. L&#39;utilizzo di una combinazione di entrambi i tipi di disaggregazione tessuto migliora la qualità e la quantità di cellule ottenute; in tal modo, diversi studi hanno implementato l&#39;uso combinato di dissociazione meccanica ed enzimatica con risultati soddisfacenti 31,32,37. Il protocollo qui descritto è stato fondato e validato nel nostro laboratorio; si utilizza una combinazione di una dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta. Questo protocollo permette lo studio ulteriore isolamento e dileucociti infiltranti in tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale (utero, decidua, e placenta). Il seguente protocollo mantiene anche l&#39;integrità dei marcatori di superficie delle cellule e dei rendimenti cellule vitali sufficienti per applicazioni a valle come dimostrato dalle analisi di citometria di flusso. Infine, questo protocollo mantiene la consistenza della preparazione cellulare per l&#39;analisi e il confronto dei diversi tessuti murini che compongono l&#39;interfaccia materno-fetale.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Magentic Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase enzymatic solution</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse extracellular antibodies</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer solution</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td></td><td></td><td>laboratory constructed</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optical and fluorescence microscopes</td><td>Zeiss and Olympus</td><td>Zeiss LSM780 and Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Tolleranza immunitaria in gravidanza richiede che il sistema immunitario della madre subisce cambiamenti distintivi, al fine di accogliere e nutrire il feto in via di sviluppo. Questa tolleranza è iniziata durante il coito, stabilito durante la fecondazione e l&#39;impianto, e mantenuto per tutta la gravidanza. Mediatori attivi cellulari e molecolari della tolleranza materno-fetale sono arricchiti nel sito di contatto tra tessuti fetali e materni, noto come l&#39;interfaccia materno-fetale, che comprende la placenta e l&#39;utero e tessuti deciduali. Questa interfaccia è costituito da cellule stromali e leucociti infiltranti, e le loro caratteristiche fenotipiche abbondanza e cambiano nel corso della gravidanza. Leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale includono neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, le cellule T, cellule B, le cellule NK e cellule NKT che creano insieme il micro-ambiente locale che sostiene la gravidanza. Uno squilibrio tra queste cellule o qualsiasi inappropalterazione riate nei loro fenotipo è considerato un meccanismo di malattia in gravidanza. Pertanto, lo studio di leucociti che si infiltrano l&#39;interfaccia materno-fetale è essenziale al fine di chiarire i meccanismi immunitari che portano a complicazioni legate alla gravidanza. Qui descritto è un protocollo che utilizza una combinazione di dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta con proteolitica e cocktail enzimatica collagenolitica isolare i leucociti infiltranti dai tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale. Questo protocollo consente l&#39;isolamento di un alto numero di leucociti vitali (&gt; 70%) con sufficientemente conservati proprietà antigeniche e funzionali. Isolati leucociti possono poi essere analizzati da diverse tecniche, tra cui immunofenotipizzazione, separazione delle cellule, l&#39;imaging, immunoblotting, espressione di mRNA, coltura cellulare, e in vitro saggi funzionali quali reazioni contrastanti leucociti, la proliferazione, o saggi di citotossicità.

La dissezione dei tessuti murini dall&#39;interfaccia materno-fetale è mostrato in Figura 1; questa procedura prevede l&#39;apertura della cavità peritoneale (Figura 1A, B), corna uterine (Figura 1C), compresi i siti di impianto (Figura 1D), e la raccolta di tessuti uterini (Figura 1E), la placenta (Figura 1F), e tessuti decidua (Figura 1G) a 16.5 dpc. La Figura 2 mostra la morfologia dei macrofagi isolati (F4 / 80 +) raccolti dai deciduali e uterini tessuti a 16.5 dpc utilizzando cell sorting magnetico. Isolato macrofagi mantengono la capacità di rilasciare citochine (dati non mostrati). La resa di cellule vitali isolate dalla decidua, utero e placenta viene mostrato nella Figura 3, e la vitalità cellulare è maggiore del 70% in tutti i tessuti. La Figura 4 mostra la strategia di gating per l&#39;analisi polymorphonucle<html> leucociti ar e mononucleari all&#39;interno delle canottiere e cancelli viabilità, comprese le cellule T (CD45 + CD3 +), neutrofili (CD45 + Ly6G +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +), le cellule dendritiche (CD45 + CD11c +), e le cellule NK (CD45 + CD49b +) a 16,5 dpc. Un&#39;alta percentuale di macrofagi CD11c co-express. Figura 5 mostra neutrofili, macrofagi e cellule T nel decidua, uterina, e tessuti placentari a 16,5 dpc. Figura 6 illustra la strategia di gating per l&#39;analisi i linfociti nei canottiere e cancelli vitale, in particolare cellule T CD45 + (CD3 +) e delle cellule B (CD45 + B220 +) a 16.5 dpc. Le cellule T sono cellule CD4 + e CD8 + T. Tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale includono anche CD3 + CD4-CD8- (linfociti T gamma-delta) in proporzioni elevate. La Figura 7 mostra cellule T e cellule B nella decidua, uterina, e tessuti placentari a 16.5 dpc. jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. Tissue dissezione. Corna (A) uterini al 16,5 DPC in un mouse B6. Le corna uterine sono attaccati alla mesentere e dei vasi drenanti. Corna (B) uterini sezionati dal mesentere e ancora attaccati alla cervice. corna (C) uterini, compresi i siti di impianto e della cervice. (D) dissezione di un sito d&#39;impianto. (E) La dissezione dei tessuti uterini dal sito di impianto. (F) Separazione della placenta e decidua dal sito di impianto. (G) distacco della decidua (strato bianco-grigio) dalla placenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" width="500" /><html> Figura 2. I macrofagi isolati da deciduali e uterine tessuti. I macrofagi (F4 / 80 + cellule) isolati dai deciduali e uterine tessuti a 16.5 dpc utilizzando l&#39;ordinamento delle cellule magnetiche. 20X di ingrandimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. vitalità delle cellule isolate. Le cellule vitali (cellule DAPI- rappresentati con frecce) isolati da decidual, uterino, e tessuti placentari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> &quot;/&gt; Figura 4. strategia di gating per polimorfonucleati e leucociti mononucleari. Popolazione leucocitaria totale è stato sorvegliato nelle canottiere e cancelli di vitalità. Cellule cellule T (CD45 + CD3 +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +), neutrofili (CD45 + Ly6G +), le cellule dendritiche (CD45 + CD11c +) e NK (CD45 + CD49b +) sono stati gated all&#39;interno del cancello total-leucociti ( CD45 +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg" width="600" /> Cellule Figura 5. neutrofili, macrofagi e cellule T nei tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale. I neutrofili (CD45 + Ly6G +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +) e T (CD45 + CD3 +) sono stati gated all&#39;interno della redditività e total-leucociti (CD45 +) cancelli in decidua isolato, uterino, e le cellule placentari.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. strategia di gating per i linfociti. Mononuclear cellule sono state gated all&#39;interno delle canottiere e cancelli di vitalità. Le cellule T (CD3 +) e le cellule B (B220 +) sono stati gated all&#39;interno del cancello della redditività. Cellule CD4 + e CD8 + T sono state gated all&#39;interno del cancello a cellule T (CD3 +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7. sottopopolazioni linfocitarie nei tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale. Cellule T (CD3 +)e cellule B (B220 +) sono stati gated all&#39;interno del cancello redditività nel decidua isolato, uterino, e le cellule placentari. Cellule CD4 + e CD8 + T sono state gated all&#39;interno del cancello a cellule T (CD3 +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Marcatore cellulare </td><td> Fluorocromo </td><td> Clone </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> LIVE / MORTO </td><td> DAPI </td><td> - </td><td> Life Technologies </td><td> L23105 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> V450 </td><td> 30-F11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560501 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> FITC </td><td> 145-2C11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.062 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> APC </td><td> RM4-5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.051 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> PE-CF594 </td><td> 53-6,7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 562.283 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> APC-Cy7 </td><td> RA3-6B2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 552.094 </td></tr><tr><td> F4 / 80 </td><td> PE </td><td> BM8 </td><td> eBiosciences </td><td> 12-4801-82 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> APC-Cy7 </td><td> 1A8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560600 </td></tr><tr><td> CD49b </td><td> APC </td><td> DX5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560628 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> PE-Cy7 </td><td> HL3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 558.079 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco degli anticorpi utilizzato per leucociti sottoinsieme immunofenotipizzazione

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K Views.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Biologia dello sviluppo

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Medicina

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento di cellule immunitarie e non immunitarie da polmoni di topo per citometria a flusso

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo