Questo lavoro è stato supportato dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Questo lavoro è stato supportato anche, in parte, dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Si ringrazia Maureen McGerty (Wayne State University) per la sua lettura critica del manoscritto.

Questo protocollo è appropriato per leucociti isolamento dai basalis decidua e parietalis decidua in preparazione per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Inoltre, le cellule isolate possono essere utilizzati per la separazione delle cellule, colture cellulari, isolamento dell&#39;RNA, e citologia. Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l&#39;approvazione etica umana deve essere ottenuto dal Research Comitato Etico Locale e Institutional Review Boards. La raccolta e l&#39;utilizzazione di campioni umani a fini di ricerca sono state approvate dai Institutional Review Board dell&#39;Istituto Nazionale Eunice Kennedy Shriver delle saluti infantili e dello sviluppo umano (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Dipartimento di Salute e Servizi Umani (DHHS , Bethesda, MD, USA) e Wayne State University (Detroit, MI, USA). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutte le donne incinte prima della raccolta di campioni di tessuto. NOTA: Mentre si lavora con sangue animale, cellule o di pericoloAgenti OU come indicato in questo protocollo, è fondamentale che una corretta biosicurezza e le azioni di sicurezza di laboratorio essere seguite. 1. La dissezione dei tessuti umani deciduali NOTA: La piastra basale è la base sottostante e attaccato alla placenta e rappresenta la superficie materno. Le membrane chorioamniotic comprendono sacco amniotico e il corion. La piastra basale comprende i basale decidua e il corion include i parietalis decidua (Figura 1). <ol><li> Decidua Basalis <ol><li> Sezionare un pezzo della piastra basale da un cotiledone della placenta (Figure 1A e 1B). </li><li> Mettere su un tagliere sterile con i villi placentari rivolti verso l&#39;alto. Il lato mostrando la villi della placenta è di solito rosso sanguinante con il tessuto peloso in apparenza. La piastra basale è liscia e pallida di colore rosso. </li><li> Utilizzare taglienti, forbici a punta fine e pinze per rimuovere il villtessuti e vasi sanguigni unità organizzative. Mantenere il tessuto imbevuto di 1x PBS (Ca 2+ - e Mg 2+ - libera) durante il processo (Figura 1C). Raccogliere 2-3 di questi pezzi e risciacquare accuratamente con 1x PBS per rimuovere il sangue (Figura 1D). </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Sezionare un pezzo di membrane chorioamniotic (circa 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Mettere sul tabellone con il corion rivolto verso l&#39;alto. Il lato corionica contiene coaguli di sangue e di solito è giallo chiaro a colori. </li><li> Utilizzare pinze a punta fine per rimuovere il maggior numero di coaguli di sangue il più possibile (Figura 1E). Sciacquare la membrana in sterili 1x PBS per pulire il sangue in eccesso dalla membrana fino a quando la 1x PBS è pulita. </li><li> Utilizzare un raschietto cellulare usa e getta sterili per raschiare delicatamente lo strato deciduali dalla membrana. Applicare sterile 1x PBS sul membrane mentre il completamento di questo processo (Figura 1F). Raccogliere i tessuti deciduali e metterli in un tubo di plastica da 50 ml con sterile 1x PBS (Figura 1G). </li></ol></li></ol> 2. meccanica disaggregazione e digestione enzimatica <ol><li> Lavare il tessuto sezionato dai basale decidua (dal punto 1.1.3) o il parietalis decidua (dal punto 1.2.3) con sterile 1x PBS in un tubo di plastica da 50 ml. Raccogliere pellets tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante che si trova sopra il precipitato di tessuto con attenzione senza disturbare il pellet. NOTA: A questo punto, il pellet sono molto allentati perché contengono globuli rossi. Se il volume del pellet è circa o inferiore a 3 ml, risospendere il pellet in 6 ml di soluzione di distacco cellulare pre-riscaldato a 37 ° C. Se il pellet è più grande di 3 ml di volume, aggiungere più soluzione distacco cellulare (aggiungere circa 2 volte °e volume dei campioni di tessuto). </li><li> Trasferire i tessuti omogeneizzati (basale decidua + soluzione o decidua distacco delle cellule parietalis + soluzione distacco cellulare) per un tubo C. </li><li> Posizionare il tubo C nel dissociatore automatica ed eseguire il programma corrispondente. NOTA: Il programma per i basale decidua corre per 17 secondi con 668 colpi totali per correre. Il programma per i parietalis decidua corre per 37 secondi con 235 colpi totali per correre. Questi programmi sono stati personalizzati per isolare leucociti dalle basale decidua oi parietalis decidua con una buona resa e la vitalità cellulare. </li><li> Dopo la disgregazione meccanica dei tessuti, digerire i tessuti con una soluzione distacco cellulare disponibile in commercio come accutase; (Un cocktail che contiene enzimi proteolitici e collagenolitica) per 45 min a 37 ° C con agitazione. </li></ol> 3. Isolamento di leucociti <ol><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 10 ml di PBS 1x al DigeBustione miscela e farla passare attraverso un colino cella di 100 micron in un tubo di plastica da 50 ml. A seconda della viscosità della miscela di digestione, uno potrebbe essere necessario utilizzare diversi filtri cellulari per una miscela. </li><li> Riempire il tubo con 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la PBS 1x sopra i pellet cellulari attentamente e risospendere il pellet con 5 ml di tampone FACS ghiacciato. NOTA: per studiare i polimorfonucleati e leucociti mononucleari insieme, andare al passo 6.1; per studiare i leucociti mononucleari, passare alla Fase 3.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di 20% supporti gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) in una provetta di plastica da 15 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima al supporto gradiente di densità. Mentre stratificazione del campione, è importante non mescolare i media gradiente di densità con la sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a 4 ° C, senza il freno. E &#39;molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e lOsing il gradiente. I leucociti si trovano nell&#39;interfaccia tra il supporto gradiente di densità e il buffer FACS. </li><li> Rimuovere lo strato superiore che contiene il buffer e cellule detriti FACS molto attentamente con una pipetta. La banda all&#39;interfaccia contiene le cellule mononucleate deciduali e una porzione di leucociti polimorfonucleati. </li><li> Trasferire le cellule all&#39;interfaccia completamente in un tubo di plastica da 15 ml. Aggiungere almeno 3 volte più volume di tampone FACS. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per pelletizzare cellule. Aspirare il surnatante e lavare le cellule con tampone FACS. Pelletizzare le cellule con un&#39;altra centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per eseguire la coltura cellulare, vedere il passaggio 4. Per eseguire l&#39;ordinamento delle cellule, vedere il passaggio 5. Per effettuare immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 6. </li></ol> 4. Le domande - Colture cellulari <ol><li> Risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di terreno di coltura RPMI 1640. Contare le cellule vitali using un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%. </li><li> Aggiungere la quantità di terreno di coltura RPMI per effettuare una concentrazione cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. Le cellule sono ora pronti per la cultura. </li></ol> 5. Applicazioni - Isolamento dei macrofagi per colture cellulari primarie <ol><li> Per isolare cellule CD14 +, magneticamente etichettare le cellule dal punto 3.7 con microsfere CD14 (20 perline microlitri per 10 7 cellule), incubare per 15 min a 4 ° C, e CD14 + cellule separato da altri tipi di cellule, applicando un campo magnetico. Dopo 2 lavaggi con tampone e la rimozione del campo magnetico MACS, eluire le cellule CD14 + magneticamente a nuovo con tampone MACS. </li><li> Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in RPMI 1640. terreno di coltura le cellule sono pronte per la placcatura (Figura 2). </li></ol> 6. Applicazioni - immunofenotipizzazione <ol><li> Per utilizzare le cellule per immunophenotyping, risospendere le cellule a partire dal punto 3.7 in 1 ml di PBS 1x. Contare le cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o un emocitometro e una soluzione trypan blu 0,4%. </li><li> Etichettare le cellule con un colorante vitalità fissabile (Figura 3). Lavare le cellule due volte con tampone FACS e risospendere le cellule in tampone macchia. Incubare con un bloccante FcR per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere anticorpi coniugati a fluorocromi extracellulari. Ad esempio, in questo protocollo, utilizzare anti-CD3, anticorpi anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabella 1). Incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Dopo 2 lavaggi con 1x PBS, le cellule saranno analizzate in 500 ml di buffer di macchia con un citofluorimetro. Una rappresentazione della strategia gating utilizzato per analizzare i leucociti sub-popolazioni presenti nei tessuti deciduali è mostrato in Figura 4. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

Caratterizzazione delle proprietà funzionali e fenotipiche di leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale umano è essenziale per la comprensione dei meccanismi immunitari che portano a disturbi della gravidanza. Diverse tecniche sono state descritte per isolare leucociti dall&#39;interfaccia materno-fetale durante la gravidanza umana 10,14,25,28,37,42,43. Tuttavia, ciascuna di queste tecniche è distinta, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione,...

La gravidanza è caratterizzato da tre fasi distinte, immunologiche: 1) impianto e placentazione precoce associata ad una risposta pro-infiammatoria (cioè, l&#39;impianto assomiglia un &#39;ferita aperta&#39;); 2) il secondo trimestre e la maggior parte del terzo trimestre di gravidanza, quando omeostasi immunitaria è ottenuta attraverso uno stato prevalentemente antinfiammatoria all&#39;interfaccia materno-fetale; e 3) il parto, uno stato pro-infiammatorio 1-7. Le cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella regolazione della risposta infiammatoria all&#39;interfaccia materno-fetale in cui la loro abbondanza e il cambiamento di localizzazione durante la gravidanza 6-9. Negli esseri umani, l&#39;interfaccia materno-fetale rappresenta un&#39;area di contatto diretto tra materna (decidua) e fetale (corion o trofoblasto) tessuti. Questa interfaccia comprende: 1) la decidua parietalis che riveste la cavità uterina non coperto dalla placenta ed è in giustapposizioneal laeve corion; e 2) i basale decidua, che si trova nel piatto basale della placenta dove viene invasa da trophoblasts interstiziali 10 (Figura 1). L&#39;intimità di queste aree di contatto crea le condizioni per l&#39;esposizione fetale antigenica materno 11-13 sistema immunitario. Non sorprendentemente, leucociti comprendono fino al 30-40% delle cellule deciduali 8,9,14,15 in aggiunta alle cellule stromali tipici tipo e cellule ghiandolari 8,14,16. Il ruolo dei leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale comprende più processi che includono la limitazione del trofoblasto dell&#39;invasione 17, rimodellamento delle arterie spirali 18,19, mantenimento della tolleranza materno 12,20, e l&#39;avvio del lavoro 21-26. Leucociti sia del adattativa e arti innate del sistema immunitario, cioè, le cellule T, macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule dendritiche e cellule NK, sono state identificate nei tessuti deciduali, e loroproporzioni e lo stato di attivazione hanno dimostrato di variare spazialmente e temporalmente durante la gestazione 6-10,12,14,24,27-30. Perturbazioni nella popolazione e / o la funzione dei leucociti sono associati con aborto spontaneo 31, preeclampsia 32, ritardo di crescita intrauterino 32,33, e parto pretermine 7,24. Pertanto, lo studio delle caratteristiche fenotipiche e funzionali di leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale umano faciliterà la delucidazione delle vie immunologiche disregolato nei disturbi della gravidanza. Uno degli strumenti più potenti utilizzati per determinare il fenotipo e proprietà funzionali dei leucociti è citometria a flusso, la tecnologia che consente l&#39;analisi quantitativa di più parametri contemporaneamente 34-36. Per analizzare leucociti mediante citometria di flusso, è richiesto l&#39;isolamento dei leucociti in una cella singola sospensione. Pertanto, un metodo per separare infiltrazione leukocytes dall&#39;interfaccia materno-fetale è necessario per studiare la loro fenotipiche e funzionali. Diversi metodi sono stati descritti per isolare leucociti dall&#39;interfaccia materno-fetale umano 10,14,25,27,37-39. Mentre alcuni si applicano disaggregazione meccanica 10,25,27,38, altri usano digestione enzimatica 37,40 per la dissociazione dei tessuti. Perché disaggregazione meccanica produce una resa inferiore e ridotto la vitalità 41, e la dissociazione enzimatica può influenzare la vitalità e superficie cellulare marcatore ritenzione 42, il metodo qui descritto combina dolce dissociazione meccanica con enzimatica pretrattamento per aumentare la resa dei leucociti isolati, senza compromettere la vitalità cellulare. Una simile combinazione di metodi è stato dimostrato per essere efficace nell&#39;isolamento dei leucociti dai tessuti deciduali all&#39;interfaccia materno-fetale 39. Pertanto, il protocollo qui descritto comporta mechadisaggregazione nica con un dissociatore tessuto automatico che aumenta la coerenza risparmiando tempo e fatica rispetto a macinazione tradizionale con bisturi contrapposti, lame di rasoio o forbici chirurgiche 10,28. L&#39;enzima scelto per la dissociazione dei tessuti era Accutase. A differenza di uso comune collagenasi 43, dispasi 44, e 45 tripsina, Accutase (una soluzione distacco cellulare) combina proteolitici generale e le attività che contribuiscono al collagenolitica efficiente dissociazione ma delicato 46,47. Dopo la dissociazione, i leucociti sono arricchiti dalla popolazione totale delle cellule deciduali di gradiente di densità centrifugazione. Vari mezzi gradiente di densità sono stati precedentemente utilizzati, il più comune dei quali sono Percoll (una sospensione di particelle di silice colloidale) 48 e Ficoll (un polimero di saccarosio con un elevato peso molecolare sintetica) 49. L&#39;efficienza superiore di isolamento dal polimero saccarosio è stata previously mostrato 50, e il protocollo descritto qui ulteriormente dimostra che questo supporto gradiente di densità produce una sufficientemente elevata purezza dei leucociti mononucleari. Pertanto, il protocollo qui descritto combina la disaggregazione tessuto meccanico con dissociatore automatica tessuto, la digestione enzimatica con una soluzione distacco cellulare, e la separazione dei leucociti con un supporto gradiente di densità (1.077 + 0.001 g / ml) per isolare leucociti da tessuti deciduali umani. Questo protocollo è stato dimostrato per preservare antigeni di superficie cellulare con la vitalità cellulare. I leucociti isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni che includono immunofenotipizzazione con citometria di flusso e studi funzionali in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

Gravidanza è caratterizzata dalla infiltrazione di leucociti nei tessuti riproduttivi e all&#39;interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis). Questa interfaccia è il sito anatomico di contatto tra materna e tessuti fetali; Pertanto, è un sito immunologica di azione durante la gravidanza. Leucociti infiltranti all&#39;interfaccia materno-fetale svolgono un ruolo centrale in impianto, manutenzione di gravidanza, e la tempistica di consegna. Pertanto, caratterizzazioni fenotipiche e funzionali di questi leucociti forniranno informazioni sui meccanismi che portano a disturbi della gravidanza. Diversi protocolli sono stati descritti per isolare leucociti infiltranti dai basalis decidua e parietalis decidua; Tuttavia, la mancanza di uniformità nei reagenti, enzimi, e tempi di incubazione rende difficile confrontare questi risultati. Descritto qui è un nuovo approccio che combina l&#39;uso di dolci diss meccanici ed enzimaticitecniche ociation per preservare la vitalità e l&#39;integrità dei marcatori extracellulari e intracellulari nei leucociti isolati dai tessuti umani all&#39;interfaccia materno-fetale. A parte immunofenotipizzazione, coltura cellulare, e lo smistamento delle cellule, le future applicazioni di questo protocollo sono numerose e varie. Seguendo questo protocollo, i leucociti isolati possono essere utilizzati per determinare la metilazione del DNA, l&#39;espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (cioè, fagocitosi, citotossicità, la proliferazione delle cellule T, e plasticità, ecc), e la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno all&#39;interfaccia materno-fetale. Inoltre, utilizzando il protocollo descritto, questo laboratorio è stato in grado di descrivere nuove e rare leucociti all&#39;interfaccia materno-fetale.

. La dissezione dei tessuti umani all&#39;interfaccia materno-fetale (basalis decidua e decidua parietalis) è mostrato in Figura 1 Questa procedura prevede la dissezione della piastra basale, che comprende le basale decidua (Figura 1A - D). Il basalis decidua è ottenuto rimuovendo villi placentare (lato fetale) dalla piastra basale (Figura 1C). Il parietalis decidua viene raccolto raschiando delicatamente la membrana corionica (Figura 1E</stro...

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Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K Views.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l&#39;isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...