Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan sotto Concessione Numero 101-2221-E-002-064-MY3.

1. Realizzazione di dispositivo a microfluidi <ol><li> Utilizzare un software di impaginazione grafica (ad esempio, AutoCAD) per disegnare il contorno di una T-microcanali. Per il T-microcanali, i due canali di alimentazione sono 90 micron di larghezza e 2.500 micron di lunghezza, e il canale di confluenza è di 180 micron di larghezza e 3.000 micron di lunghezza. Collegare l&#39;estremità di ciascun canale a un individuo cerchio con un diametro di 1,100 micron. </li><li> Mark &#39;chiaro&#39; e &#39;buio&#39; per l&#39;esposizione e aree coperte, rispettivamente. Per un fotoresist negativo (ad esempio, SU-8), la forma della T-microcanale è &#39;chiaro&#39; e il circostante è &#39;scuro.&#39; </li><li> Utilizzare un generatore di pattern laser con una lunghezza d&#39;onda di 442 nm e una dimensione minima di 2 micron a trasferire il modello del T-microcanali su una fotomaschera cromo-on-glass. </li><li> Utilizzare fotomaschera, un substrato (ad esempio, un solo lato lucido wafer di silicio) e un fotoresist epossidica permanente (per esempio., SU-8) per produrre uno stampo attraverso un processo di litografia standard. Lo strato di fotoresist è 55.2 micron di spessore. In generale, lo spessore photoresist dovrebbe essere più sottile rispetto alla profondità di correlazione della lente obiettivo 17-19. </li><li> Utilizzare lo stampo e un materiale trasparente come polidimetilsilossano (PDMS) per fabbricare il T-20 microcanali. </li><li> Per il collegamento fluidico, utilizzare un tubo di acciaio inossidabile di 2 mm di diametro esterno di perforare fori passanti allineati ai modelli circolari sui PDMS. </li><li> Trattare le superfici delle PDMS e un vetrino con plasma di ossigeno a 60 W per 30 secondi. Fissare le PDMS al vetrino. Le superfici ossidate di due materiali creano un forte legame. Posizionare la struttura PDMS incollata su una piastra calda per 5 minuti a 120 ° C. </li><li> Inserire i tubi in Teflon nei fori per il collegamento fluidica. </li></ol> 2. Setup sperimentale <ol><li> Costruire il sistema schlieren microscala da un Hoffmamodulazione n microscopio a contrasto rimuovendo la piastra fessurata nel piano focale frontale del condensatore e sostituendo il modulatore con un coltello nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo 5X 3. La profondità di correlazione, che dipende dalla apertura numerica dell&#39;obiettivo 17-19, dovrebbe essere sufficiente a coprire l&#39;intera profondità del dispositivo microfluidico. La superficie del bordo della lama è annerito da ossido di alluminio anodico per ridurre la sua riflettività. </li><li> Montare la telecamera ad alta velocità per il tubo trinoculare del microscopio tramite un adattatore C-mount. Avere la camera il percorso ottico del microscopio attraverso un divisore di fascio. Collegare la fotocamera a un computer desktop tramite un cavo Ethernet. Impostare la correzione gamma per 1 per la telecamera in modo che la sua lettura in scala di grigi è proporzionale alla luminanza input. </li><li> Accendere la fonte di luce. Al fine di evitare un eccesso di calore, utilizzare LED (light emitting diode) di illuminazione. </li><li> Utilizzare un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, &lt;/ Em&gt; funzione imread in MATLAB) per ottenere i valori in scala di grigi di un&#39;immagine acquisita. Rimuovere il bordo della lama, regolare l&#39;illuminazione, l&#39;apertura e il tempo di esposizione in modo che la lettura media scala di grigio dell&#39;immagine è di circa 10% in meno rispetto al valore massimo. Questo indica l&#39;intensità di fondo per un cutoff 0% e si usa un valore di 230 per un&#39;immagine a 8 bit. </li><li> Inserire il filo del rasoio per bloccare completamente la luce incidente. Registrare la lettura media scala di grigi dell&#39;immagine. Questo indica l&#39;intensità di fondo per un cutoff 100% e il valore è di circa 15 per un&#39;immagine a 8 bit. </li><li> Regolare la posizione del bordo della lama in modo che la lettura media scala di grigio dell&#39;immagine acquisita si trova nel mezzo dei valori per 0% e 100% di taglio. Ora il grado di cutoff è impostato al 50%. </li><li> Preparare due fluidi trasparenti con noti indici di rifrazione 21 che sono completamente miscibili tra di loro costituenti. Per valutare la dipendenza della ind rifrazioneex sulla concentrazione della miscela, controllare la documentazione 21 o utilizzare l&#39;equazione di Gladstone-Dale 22. Se la curva è lineare sull&#39;intera gamma, raccogliere altri componenti del fluido. Quindi, scegliere una composizione designato sotto del quale l&#39;indice di rifrazione della soluzione varia linearmente con la concentrazione. Ad esempio, utilizzare diluire etanolo acquoso con una frazione di massa di 0,05 e acqua come i fluidi di lavoro. </li><li> Mettere la T-microcanali sul palco campione. Disporre il T-microcanali modo con il canale confluenti parallela al bordo della lama (Figura 1). </li><li> Preparare due siringhe identici: Una siringa è riempita con il fluido di lavoro che funge da fluido di riferimento (acqua), e la siringa B è riempito con l&#39;altro fluido di lavoro (diluito etanolo acquoso). La dimensione della siringa dipende dalla desiderata portata Q e la specificazione della pompa a siringa: Q = πd 2 V / 4, dove d è il diametro interno del syringe e V è la velocità del pistone. Pulsazione di flusso solito può essere evitato scegliendo una piccola siringa per aumentare V 23. </li><li> Raccogliere il liquido all&#39;uscita dalla T-microcanale in un becher. Assicurarsi che il tubo di uscita Teflon è fissato alla parete del recipiente e la sua estremità è sotto il livello del liquido nel becher così da evitare vibrazioni che deriverebbe dalla gocciolina di troncaggio. </li></ol> 3. Calibrazione <ol><li> Acquisire le immagini dei due fluidi di miscelazione e le immagini di riferimento. <ol><li> Ad un dato numero di Reynolds Re, impostare la portata delle pompe a siringa, Q. Q è calcolata da Q = μ (W + D) Re / 4ρ, dove μ e ρ sono la viscosità e la densità del fluido di lavoro, e W e D sono la larghezza e la profondità del canale confluenza del T-microcanali, rispettivamente. </li><li> Caricare una pompa con siringa A e l&#39;altra pompa con syringe B. Collegare le due insenature della T-microcanali per siringa A e B siringa via tubo in Teflon. Avviare le pompe siringa per consegnare i fluidi di lavoro nel T-microcanali alle portate di volume identico. </li><li> Attendere flusso costante fissa. La condizione di flusso costante è definita dalla comparsa di un pattern schlieren stazionaria. </li><li> Utilizzare il software telecamera controllata per registrare venti fotogrammi di miscelazione fluidica ad un frame rate di 30 fps. </li><li> Arrestare la pompa che viene caricato con siringa B. pompare il fluido di riferimento (acqua) solo attraverso un ingresso nel canale confluenza del T-microcanali a velocità costante. </li><li> Attendere fino a raggiungere condizioni di flusso costante e nessun modello schlieren si osserva. </li><li> Utilizzare il software della fotocamera controllato per acquisire l&#39;immagine di riferimento, in assenza di disomogeneità ottica è presente nel T-microcanali. Registra venti fotogrammi un frame rate di 30 fps. </li><li> Ripetere 3.1.1 a 3.1.7 in numero diverso di Reynolds: Re = 1, 5, 10, 20 e 50 in modo che nessuna struttura complessa flusso emerge nella regione confluenza del T-24 microcanali. </li></ol></li><li> Utilizzare un software di elaborazione delle immagini per dividere l&#39;immagine acquisita I (i, j) con l&#39;immagine di riferimento I 0 (i, j) 25, dove i e j sono gli indici di pixel. </li><li> Impiegare un CFD (Computational Fluid Dynamics) pacchetto per simulare la miscelazione dei fluidi designato nel T-microcanali. <ol><li> Costruire il modello tridimensionale per la geometria del T-microcanali. Discretizzare il dominio di flusso nelle reti strutturate. Per aumentare la precisione, impiegare maglia più fine in confluenza e la regione centrale del T-microcanali. </li><li> Assegnare le proprietà fisiche dei fluidi e stabilire le condizioni al contorno per il dominio di flusso. Durante il processo di soluzione, determinare il coefficiente di diffusione concentrazione-dipendente dalla concentrazione ottenuta nell&#39;ultimoiterazione 26 per aggiornare la concentrazione locale. </li><li> Esaminare le sensibilità dei risultati calcolati effettuando lo studio griglia 27. </li></ol></li><li> Per ogni nodo (x i, y i) sulla -plane xy, impiegano lo strumento di post-elaborazione CFD prendere i valori medi del campo di concentrazione attraverso la profondità del canale dalla regola trapezoidale: w (x i, y j) = {Σ k [w (x i, j y, z k) + w (x i, j y, z k + 1)] ∙ (z k +1 - z k) / 2} / D 28, dove D è la profondità del canale. Utilizzare lo schema di differenziazione centrale per calcolare la derivativo di concentrazione rispetto alla direzione trasversale flusso: (∂ w / ∂ y) i, j = [w (x i, y j +1) - w (x i, y j -1)] / (y j +1 - y j -1). </li><li> Per entrambi gradienti positivi e negativi, estrarre il rapporto tra i valori di grigio I / I 0 (ottenuto in 3.2) e il gradiente della frazione di massa ∂ w / ∂ y (ottenuto in 3.4) nelle posizioni specificate come y = 0 (centerline, streamwise direzione) o vari dato x (cross-flusso direzione). </li><li> Tracciare i risultati e determinare la relazione tra I / I 0 e ∂ w / ∂ y, I / I 0 </sub&gt; = C 1 ∂ w / ∂ y + C 2 (C 1 e C 2 sono costanti), con la regressione lineare. </li></ol> 4. quantificazione <ol><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,2 per la miscelazione nel dispositivo di microfluidica di destinazione. La profondità del dispositivo microfluidico destinazione deve essere identica o simile a quella del T-microcanali. Se si prevede un fenomeno instabile, acquisire un video clip (sequenza di immagini) al punto 3.1.4, invece. Il frame rate dovrebbe essere sufficiente per risolvere la dinamica del flusso transitorio chiaramente alta, mentre il tempo di esposizione deve essere identico al valore utilizzato in 2.4, 2.5, 3.1.4 e 3.1.7. </li><li> Utilizzare il rapporto ottenuto nel passaggio 3.6 per convertire il rapporto tra i valori di grigio al gradiente della frazione di massa nel dispositivo microfluidico destinazione. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per miscelazione fluidico in un dispositivo microfluidico, la tecnica schlieren microscala è in grado di misurare la grandezza di gradiente di concentrazione attraverso la quantificazione variazione dell&#39;intensità della luce. Poiché il principio di questa tecnica si basa sulla rilevazione l&#39;alternanza di propagazione della luce, i fluidi di lavoro e il dispositivo microfluidico devono essere trasparenti alla luce incidente. Inoltre, il protocollo richiede una relazione lineare tra l&#39;indice di rifrazione d...

Miscelazione di liquidi è una questione importante che si trova in molti processi industriali e sistemi biologici. Con l&#39;emergere di microfluidica, mescolando in microscala ha portato molta attenzione a causa della sua sfida in dominazione diffusione tra i meccanismi di trasporto di massa. Dal momento che la progettazione di una convalida quantitativa micromixer effettiva richiesta, diversi metodi di misura sono stati sviluppati 5-7. Tuttavia, la struttura tridimensionale, si trovano comunemente in micromixers efficienti 5, richiede una rappresentazione più accurata del campo di concentrazione che le tecniche di misurazione comuni non riescono a fornire. A causa del limite di visualizzazione angolo 8 o reazione cinetica 6, i suddetti metodi possono produrre risultati fuorvianti che non rappresentano correttamente per l&#39;omogeneità della miscela. Per fluidi otticamente trasparente di miscelazione in otticamente microstrutture trasparenti, microscala tecnica schlieren 3,9-14 </sup&gt; fornisce una valida alternativa per analizzare la miscelazione disomogeneità. In passato, microscala tecnica Schlieren è stato in gran parte utilizzato per visualizzare il flusso comprimibile 9-13, 15 o fase di pendenza 16. MicroScale tecnica schlieren benefici sia da un layout semplice ottica e alta sensibilità e consente non solo l&#39;indagine non invasiva della funzione portata specifica che causa disturbo ottico, ma è adatto per l&#39;uso nella valutazione di miscelazione. In questo lavoro, costruiamo il sistema schlieren microscala inserendo una lama di coltello nel piano focale posteriore dell&#39;obiettivo di un microscopio, descrivere una procedura di calibrazione per realizzare analisi quantitativa, e riportare una misura di convalida in un oscillatore microfluidica 4. Per implementare misurazioni, i fluidi di lavoro siano adeguatamente scelti in modo che l&#39;indice di rifrazione dei liquidi misti varia linearmente con la composizione e lo spessore del dispositivo microfluidico destinazione è identico al sullae utilizzato in calibrazione. Inoltre la concentrazione di specie, microscala tecnica schlieren può essere esteso per misurare il gradiente di altra grandezza scalare che è linearmente correlata all&#39;indice di rifrazione, come la temperatura o salinità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permanent Epoxy Negative Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single side polished silicon wafer</td>
			<td>Light Technology</td>
			<td>S4W1PP5SABUP1</td>
			<td>p-type, diameter: 100&#177;0.5 mm, thickness: 525 &#177;25 mm, orientation: (1 0 0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>kds210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10L2138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoffman modulation contrast microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N PLAN</td>
			<td>NA = 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife-edge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. high speed</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>NX7-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter HC 0.63x</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>541537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera operating software</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>MotionPro X Studio 2.02.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard-184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing, i.e. O.D. x I.D. 1/16 in. x 0.031 in.</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>58700-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro glass slide</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>S2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate</td>
			<td>Yeong-Shin</td>
			<td>HP-303DN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water, i.e. HPLC grade</td>
			<td>Alps Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl alcohol, i.e. reagent grade</td>
			<td>Nihon Shiyaku Reagent</td>
			<td>EA448652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image processing software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB R2009a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computational fluid dynamics package</td>
			<td>ESI group</td>
			<td>CFD-ACE+ 2008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mixing inhomogeneity in a microfluidic device by microscale schlieren technique

In questo lavoro, si introduce l&#39;uso della tecnica schlieren microscala per misurare la miscelazione disomogeneità in un dispositivo microfluidica. Il sistema schlieren microscala è costruita da un microscopio a contrasto di modulazione Hoffman, che fornisce un facile accesso al piano focale posteriore della lente obiettivo, rimuovendo la piastra fessurata e sostituendo il modulatore con un coltello. Il principio di funzionamento di microscala tecnica schlieren basa sulla rilevazione deflessione della luce causata dalle variazioni di indice di rifrazione 1-3. La luce deviata o fuoriesce o è ostruito dal bordo coltello per produrre un chiaro o una banda scura, rispettivamente. Se l&#39;indice di rifrazione della miscela varia linearmente con la sua composizione, la variazione locale di intensità della luce nel piano immagine è proporzionale al gradiente di concentrazione normale all&#39;asse ottico. L&#39;immagine micro-Schlieren dà una proiezione bidimensionale della luce disturbata prodotta da disomogeneità tridimensionale. Per realizzare l&#39;analisi quantitativa, si descrive una procedura di calibrazione che mescola due fluidi in una T-microcanali. Svolgiamo una simulazione numerica per ottenere il gradiente di concentrazione nel T-microcanali che è strettamente correlata con l&#39;immagine di micro-schlieren corrispondente. In confronto, si stabilisce una relazione tra le letture in scala di grigio dell&#39;immagine micro-Schlieren ei gradienti di concentrazione presentati in un dispositivo di microfluidica. Usando questo rapporto, siamo in grado di analizzare la disomogeneità di miscelazione dall&#39;immagine micro-schlieren socio e dimostrare la capacità della tecnica schlieren microscala con le misure in un oscillatore microfluidica 4. Per fluidi otticamente trasparenti, microscala tecnica schlieren è uno strumento diagnostico attraente fornire informazioni istantanee pieno campo che mantiene le caratteristiche tridimensionali del processo di miscelazione.

/ I 0 con il numero di Reynolds diverso per entrambi gradienti positivi e negativi della frazione di massa viene mostrato il rapporto I scala di grigi (figura 2) con una banda simmetrica che appare nel centro del T-microcanali. A basso numero di Reynolds, la coda del nastro schlieren viene espanso e offuscata dovuta alla dispersione attraverso l&#39;interfaccia di miscelazione. Poiché il numero di Reynolds aumenta, la lunghezza di diffusione accorcia portando ad una banda s...

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizzando disomogeneità Mescolando in un dispositivo a microfluidi da Tecnica microscala Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K Views.  National Taiwan University. Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and ventilator-induced lung injury (VILI). However, studies in microfluidic channels with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung currently face several challenges, especially due to difficulties in establishing appropriate cell culture conditions, including media flow rates, within a given culture environment. The presented protocol describes an image-based approach to evaluate the structure of NCI-H441 human lung epithelial cells cultured in an oxygen-impermeable microfluidic channel with dimensions physiologically relevant to the terminal bronchioles of the human lung. Using phalloidin-based filamentous-actin staining, the cytoskeletal structures of the cells are revealed by confocal laser scanning microscopy, allowing for the visualization of individual as well as layered cells. Subsequent quantification determines whether the cell culture conditions being employed are producing uniform monolayers suitable for further experimentation. The protocol describes cell culture and layer evaluation methods in microfluidic channels and traditional fixed-well environments. This includes channel construction, cell culture and requisite conditions, fixation, permeabilization and staining, confocal microscopic imaging, image processing, and data analysis.

The presented protocol describes the development and use of a phalloidin-based filamentous-actin staining technique with confocal laser scanning microscopy (CLSM) to visualize adherent cell layer structure in microfluidic dynamic-culture channels and traditional fixed-well static-culture chambers. This approach aids in evaluating cell layer confluency, monolayer formation, and layer-thickness uniformity.

Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...