Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Biomedical Imaging e concedere Bioingegneria # EB003307 e dalla carriera Premio Nazionale Science Foundation su AF

Dispositivo di design Microfluidic utilizzando CorelDraw o AutoCAD Principio di PDMS microvalvole dispositivi basati su: I dispositivi sono costituiti da tre strati: uno strato fluido contenente microchambers di varie dimensioni, un &quot;livello di controllo&quot; contenente le microcanali necessario attivare il percorso fluidico con microvalvole, e un mezzo sottile membrana PDMS associato per il livello di controllo. A riposo, a causa della conformità e idrofobicità di PDMS, le guarnizioni membrana (reversibile) contro la sua sede, quindi le camere rimangono isolate le une dalle altre, senza apporto di energia. Le valvole possono essere aperte mediante l&#39;applicazione di pressione negativa (ad esempio, vuoto casa), per cui la membrana PDMS devia verso il basso e si separa dalla superficie che supporta il muro tra due camere fluidico, collegando quindi il percorso fluidico. Chiusura della valvola può essere ottenuto a cambiare la regolazione della pressione dal vuoto alla pressione atmosferica. Strato fluidico e modelli livello di controllo sono stati progettati utilizzando CorelDraw o il software AutoCAD. Maschere che contengono questi disegni sono stati stampati ad alta risoluzione (8.000 a 20.000 dpi) su film trasparenza attraverso servizi commerciali (CAD / Arte, Bandon, OR) (maschere non mostrato). Fabbricazione di maestri silicio utilizzando le normali SU-8 fotolitografia <ol><li> Standard di SU-8 metodi di fotolitografia utilizzati per creare SU-8 &quot;maestri&quot; (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) per lo strato di microfluidica e il livello di controllo della valvola in una camera sterile (non mostrato in questo video). </li><li> Per facilitare il rilascio, prima della replica PDMS il SU-8, maestri erano silanizzata dall&#39;esposizione a un vapore di un fluorosilane ((tridecafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (TFOCS)), in un essiccatore vaso (senza seccare pellet) collegato a una fonte di vuoto. La camera di essiccatore deve essere posizionato all&#39;interno di una cappa chimica a causa dei fumi alla natura corrosiva dei vapori TFOCS. </li><li> Mettere una piccola porzione di un tovagliolo di carta assorbente all&#39;interno della camera essiccatore. Aggiungere una goccia di TFOCS al tovagliolo di carta e di evacuare l&#39;aria dalla camera. Applicare il vuoto per 1 minuto e spegnere. Chiudere il vuoto e attendere 30 minuti per la deposizione. Tenere il master in contenitori chiusi per un uso futuro. </li></ol> Stampaggio replica del PDMS dai maestri <ol><li> Lo strato fluidico e il livello di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS SU-8 da padroni. </li><li> Alla miscelazione PDMS pre-polimero e cross-linker (10:1 in peso. Ratio), de-bolla in un essiccatore per 10-15 minuti fino a quando bolle chiaro. </li><li> Tagliare tubo in silicone in 1-2 pezzi cm di lunghezza. Scegli la dimensione appropriata del tubo a seconda dell&#39;applicazione. Utilizziamo tubi 1,14 mm ID qui per una facile connessione a 1 / 16 pollice tubo con diametro esterno più tardi. </li><li> Usa Duco Cemento ® per tubi di colla sul regioni entrata del SU-8 padrone del livello di controllo. Fare attenzione a non usare troppa colla, come il tubo in silicone è costituito dai componenti stessi PDMS, e il tubo verrà incorporato nel dispositivo PDMS microfluidica, la creazione di prese d&#39;aria e fluido stretto / punti vendita. </li><li> Nel nostro dispositivo, le regioni di aspirazione sono stati progettati sulle maschere di entrambi i fluidi e gli strati di controllo, ma insenature tubi al silicone sono modellati solo in un unico livello (ad esempio, livello di controllo) del dispositivo. Per creare ingressi per lo strato di fluidica, abbiamo rimuovere manualmente o forare le poche sezioni della membrana che comprenderà le regioni d&#39;ingresso. Pertanto, dopo l&#39;allineamento e il montaggio, tutte microcanali (quelli che portano il flusso così come quelli che controllano le valvole) sono accessibili dalla parte superiore del dispositivo in modo che la superficie inferiore è planare, consentendo l&#39;imaging del dispositivo su un palco microscopio convenzionale. </li><li> Versare con cura de-bolle PDMS su entrambi i maestri, attorno al tubo nel controllo a livello di master. De-bolla di nuovo in un essiccatore. Dopo aver de-bolle è completo, messo in forno a 65 ° C per&gt; 1 ora per la stagionatura. </li><li> Rimuovere curato PDMS coperte maestri del forno. </li><li> Tagliare i singoli dispositivi dai maestri (ogni master contiene tre dispositivi identici) e spegnere buccia. </li><li> Rimuovere la colla dalle regioni di ingresso con un ago o un paio di pinze. </li><li> Prendere il controllo strato PDMS in camera bianca. </li></ol> PDMS sottile membrana di produzione <ol><li> Come mostrato nel principio dispositivo, lo strato centrale è costituito da un ~ 12 micron di spessore della membrana PDMS. </li><li> Mescolare 10:01 peso. rapporto di PDMS Prepolimero / miscela catalizzatore con esano (3:1 in peso. ratio) vortexando. </li><li> Entrare in una stanza pulita. (Un ambiente privo di polvere è fondamentale per garantire che le membrane PDMS sono esenti da difetti, le particelle di polvere può provocare membrane contenenti fori e / o difettoso legata allo stampo replica.) </li><li> Mettere un silanizzata 3 pollici di diametro di wafer sual mandrino vuoto di un filatore Solitec. Il wafer deve essere silanizzato (derivatizzati con fluorosilane) prima di PDMS filatura per facilitare il rilascio di PDMS da superfici di silicio. La ciotola in Teflon al di fuori del mandrino è stato avvolto con una pellicola in plastica per una facile pulizia. </li><li> Dispensare 2-3 ml di PDMS / Esano miscela sul wafer utilizzando un ago calibro 18 siringa (per ridurre al minimo le bolle). </li><li> Impostare i parametri di spin. Rotazione a 7000 rpm per 30 secondi, risultando in un film di PDMS ~ spessore 12 micron. </li><li> Riscaldare il wafer a 85 ° C per 4 minuti su una piastra calda per curare il film PDMS. </li></ol> Multistrato PDMS dispositivo incollaggio e montaggio <ol><li> Mettere il livello di controllo e la membrana PDMS in una camera di plasma di ossigeno. Accendere il plasma per 30 sec (30 psi di pressione ossigeno, portata 3-5 SCFH, 550W). Portare il livello di controllo in contatto con la membrana PDMS immediatamente (entro 5 minuti) dopo l&#39;attivazione di ossigeno. Parametri di sistema, come la pressione di ossigeno, portata e potenza plasma e tempo di trattamento, sono empiricamente configurate in base alle diverse applicazioni. </li><li> Attendere 5 minuti, e rimuovere lo strato di controllo dal wafer con la membrana. </li><li> Rimuovere le membrane sulle aree prese in modo che sia il controllo e strati fluidico sono accessibili dalla parte superiore tramite tubo. </li><li> Allineare il livello di controllo (con tubi di insenature) con lo strato fluidica (planare) sotto uno stereoscopio. Perché guarnizioni PDMS su PDMS, nessun legame permanente è necessaria. </li></ol> Controllati dal computer di apertura e chiusura di microvalvole PDMS di vuoto o di pressione <ol><li> Dopo Dispositivo di allineamento e il montaggio, inserire 1 / 16 di pollice OD (1 / 32 ID pollici) tubazione Tygon nelle insenature 1,14 mm ID silicone e collegare gli ingressi alle fonti di pressione o serbatoi fluido. </li><li> Per aprire e chiudere le valvole, le pressioni sono controllate da una linea di vuoto e una linea di pressione collegato tramite due regolatori di pressione per una serie di miniature a tre vie elettrovalvole. </li><li> Le elettrovalvole sono collegate all&#39;acquisizione di National Instruments dati hardware controllato via software Labview. </li><li> Funzionamento del dispositivo e la deflessione della membrana sono visualizzati con un colore CCD (SPOT RT, strumenti diagnostici, Sterling Heights, MI). </li></ol> Parallelo la miscelazione di due coloranti colore diverso in diversi volumi nanoliter definito Noi dimostrare il funzionamento di un mixer parallelo che permette di memorizzare e la miscelazione precisa sub-nanolitri volumi di soluzione acquosa a diversi rapporti di miscelazione: <ol><li> Lo strato fluidico contiene due array di microchambers: Lungo serie A, la dimensione del microchambers diminuisce, a partire da sinistra, da 200 micron x 400 micron a 200 micron x 40 micron; A 10 è un micron 500 x 40 micron da camera ed è utilizzati solo per la connessione fluidica in array A, a destra della camera di A 10 è un insieme di stanze simmetricamente l&#39;aumento nelle dimensioni. Le camere in B array sono progettati in modo tale che il volume aggiunto di ogni due camere adiacenti in diverse righe sempre uguale. A 0, 10r 0r A e B 10, B sono concepiti come rispettivi controlli per le soluzioni A e B senza mescolare. </li><li> Il livello di controllo ha due controllati in modo indipendente serie di valvole. Una serie di valvole 1} {V viene utilizzata per collegare due array da camera con i loro rispettivi insenature, mentre una seconda serie di valvole a V 2 {} viene utilizzata per collegare ogni coppia di camere a due array. </li><li> Riempire il microchambers aprendo set rubinetto 1} {V per permettere il flusso di due soluzioni coloranti per gli array A e B, rispettivamente. Portate di soluzione può essere raggiunta sia a mano o sotto vuoto tirando controllato con elettrovalvole. Se le bolle d&#39;aria forma nel microchambers, più soluzione può essere spinto per rimuovere le bolle, o il dispositivo può essere lasciato per qualche minuto e bolle scompariranno a causa della permeabilità all&#39;aria di PDMS. </li><li> Chiudere la valvola di 1} {V per isolare ogni camera in entrambi gli array. </li><li> Valvola di insieme aperto {V 2} per consentire la miscelazione dei fluidi tra le camere adiacenti in array differenti. ~ Miscelazione richiede solo 1-2 minuti per portare a termine questi volumi. </li><li> Chiudere 2} {V per spingere il liquido torna a ciascuna camera fluidica e camere di deformare tornare alla loro forma originale. Dal momento che i due array fluidico sono stati progettati con le camere di 11 misure diverse, 11 differenti rapporti di miscelazione sono prodotte in un unico passaggio di miscelazione. </li></ol> Un sistema integrato per microfluidica controllati dal computer perfusione di colture cellulari microfluidica Noi dimostrare un sistema di microfluidica che è in grado di perfusione automatica di molteplici soluzioni per una camera singola coltura cellulare. Ilingressi sono controllati da microvalvole, che può essere attivato in ogni singola sequenza di insenature, varie combinazioni, o tutti insieme. Il dispositivo è in grado di produrre sfumature o miscele di varie soluzioni. Questo dispositivo è composto anche da tre strati: uno strato fluido, un livello di controllo, e un mezzo sottile membrana PDMS. Passi di fabbricazione alternativa per il dispositivo: <ol><li> Le porte di ingresso per i canali fluidici e canali di controllo sono &quot;pugni&quot; con un diametro di 1,2 millimetri Harris Micro-Punch (Ted Pella, Inc.). Tubo è collegato alle prese utilizzando smussati 18 aghi calibro che vengono inseriti per il PDMS attraverso lo strato di controllo. Questo permette un imballaggio più densa di insenature che il tubo di silicone. La conformità del PDMS offre una tenuta di tutto il aghi per essere attuata efficacemente fluido o pressione pneumatica. </li><li> Come precedentemente descritto, l&#39;incollaggio della membrana sottile PDMS al livello di controllo viene eseguito utilizzando l&#39;esposizione a plasma di ossigeno. </li><li> Lo strato fluidico è preparato da stampaggio replica con PDMS pre-polimeri e cross-linker con un rapporto di 5:1 e in parte la cura per 25 minuti a 60 ° C in un forno a convezione. A questo punto, il livello parzialmente curata fluidica è ancora cattivo gusto, ma può essere rimosso dal master. </li><li> Lo strato fluidico manualmente è allineato al pre-assemblati di controllo e strati di membrana con uno stereoscopio. Il dispositivo assemblato viene posto su una piastra per 5 minuti a 80 º C. Quindi, le linee di valvole di controllo sono collegati al controller automatico e le valvole sono azionate fino a quando la membrana si stacca dallo strato fluido in tutte le sedi delle valvole mediante l&#39;applicazione di vuoto. Dopo &quot;staccare&quot; le valvole, il controller computer è impostato per scorrere le valvole e fuori mentre il dispositivo è inoltre curato il piano di cottura a 80 ° C per almeno 1 ora. </li></ol> Le caratteristiche del nostro sistema integrato di microfluidica: il dispositivo è in grado di perfusione automatica di 16 diverse soluzioni per una camera di coltura cellulare utilizzando un sistema di valvole multiplex. La progettazione dei canali assicura che la resistenza di tutte le insenature è equilibrata. Il nostro design microvalvola isola soluzioni e controlli risciacquo attraverso canali integrati per la rimozione rapida di liquido, che limita la contaminazione incrociata. Un mixer integrato a spina di pesce può essere attivato per produrre miscele di diverse insenature. Inoltre, ci sono quattro canali resistenza variabile che può essere attivata per modificare la portata.

<ol>
	<li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays.">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li></ol>

I principali vantaggi del nostro design microvalvola: <ol><li> Nessuna fonte di energia supplementare è necessario per chiudere il percorso fluidico, da cui il dispositivo caricato è facilmente trasportabile e </li><li> Il dispositivo può essere costruita da repliche PDMS da photolithographically-fantasia SU-8 stampi, consentendo microfabricating profonde (fino a 1 mm) canali con pareti laterali verticali (cioè l&#39;altezza delle caratteristiche possono essere specificati indipendentemente dalla loro larghezza) e la conseguente mol...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Clean silicon wafers</td>
<td>Supplies</td>
<td>Silicon Sense Inc.</td>
<td>3P0110TEST</td>
<td>3-inch diameter, P/Boron</td>
</tr>
<tr>
<td>"Master" wafers containing SU-8 patterns</td>
<td>Supplies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fabricated in house using standard photolithography procedures </td>
</tr>
<tr>
<td>Desiccators (2)</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>24987-048</td>
<td>One for silanization, one for PDMS de-bubbling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>OHAUS Corp.</td>
<td>SC6010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sheldon Mfg. Inc.</td>
<td>1330GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MiniVortexer</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>58816-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Headway Research Inc.</td>
<td>PWM32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma etcher</td>
<td>Equipment</td>
<td>Plasmatic Systems Inc. </td>
<td>Plasma Preen II-973</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Plate</td>
<td>Equipment</td>
<td>Torre Pines Scientific</td>
<td>HP30A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>Equipment</td>
<td>Diagnostic Instruments</td>
<td>SPOT RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solenoid valves</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lee Company</td>
<td>LHDA0511111H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Data acquisition board</td>
<td>Hardware</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6025E, CB-50LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabView</td>
<td>Software</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
<td>Reagent</td>
<td>United Chemical Technologies</td>
<td>T2492</td>
<td>Silanization must be done in a chemical fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS prepolymer and crosslinker</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow-Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hexane</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD	</td>
<td>HX0295-6	</td>
<td>

</td>
</tr>
<tr>
<td>Color Dyes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td>
<td>FD&C 110, 135, 150</td>
<td>Blue #1, Yellow #5, Red #3. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml disposable transfer pipets</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Weighing boats</td>
<td>Supplies</td>
<td>VWR </td>
<td>12577-027</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Tongue depressor</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Fisher Scientific	</td>
<td>11-700-555	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P100 dishes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-772E</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.</td>
<td>07625-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.	</td>
<td>06418-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duco Cement</td>
<td>Supplies</td>
<td>Devcon</td>
<td>6245</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>Tools</td>
<td>VWR</td>
<td>55411-050</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0053482 (25 Gauge)</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>#5 Forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-526B</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Seal wrap film</td>
<td>Supplies	</td>
<td>AEP Industries Inc.	</td>
<td>0153877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-406-16</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes	</td>
<td>Supplies	</td>
<td>BD Falcon	</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purple nitrile power-free gloves</td>
<td>Supplies 	</td>
<td>VWR 	</td>
<td>40101-348</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.2 mm Harris biopsy punch	</td>
<td>Tools</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>15074	</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays

Sistemi miniaturizzati microfluidici fornire soluzioni semplici ed efficaci a basso costo point-of-care diagnostica e analisi biomediche high-throughput. Controllo del flusso robusto e preciso volumi fluidici sono due requisiti fondamentali per queste applicazioni. Abbiamo sviluppato chip microfluidica con elastomerica polidimetilsilossano (PDMS) array microvalvola che: 1) non hanno bisogno di fonti di energia supplementare per chiudere il percorso fluidico, da cui il dispositivo di caricamento è molto portabile e 2) consentire microfabricating profonde (fino a 1 mm) canali con pareti verticali e con conseguente caratteristiche molto precise. Il microvalvole dispositivi basati su PDMS sono costituiti da tre strati: uno strato fluido contenente percorsi fluidici e microchambers di varie dimensioni, uno strato di controllo che contiene il microcanali necessario attivare il percorso fluidico con microvalvole, e un mezzo sottile membrana PDMS che è legato al controllo strato. Strato fluidico e livelli di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS da SU-8 maestri photoresist, e la sottile membrana PDMS è fatta da spinning PDMS ad altezze specificate. Il livello di controllo è legato alla membrana sottile PDMS dopo l&#39;attivazione di ossigeno di entrambe, e poi assemblati con lo strato fluido. Le microvalvole sono chiusi a riposo e può essere aperto mediante l&#39;applicazione di pressione negativa (ad esempio, vuoto casa). Microvalvola chiusura e apertura sono automatizzate tramite elettrovalvole comandate da un software. Qui dimostriamo due chip microfluidica microvalvola-based per due diverse applicazioni. Il primo chip permette di memorizzare e la miscelazione precisa sub-nanolitri volumi di soluzione acquosa a diversi rapporti di miscelazione. Il secondo chip permette di controllo computerizzato perfusione di colture cellulari microfluidica. I dispositivi sono facili da fabbricare e semplice da controllare. A causa della biocompatibilità di PDMS, questi microchip potrebbe avere vaste applicazioni in dispositivi miniaturizzati test diagnostici di base così come studi di biologia cellulare.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Dimostriamo protocolli per la produzione e l&#39;automazione elastomeriche polidimetilsilossano (PDMS) a base di array microvalvola che non hanno bisogno di energia supplementare per chiudere e dispongono photolithographically definito volumi precisi. Un parallelo subnanoliter-volume del mixer e un sistema integrato di perfusione microfluidica sono presentati.

Chips Microfluidic controllati con le matrici elastomeriche microvalvola

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  University of Washington. Dimostriamo protocolli per la produzione e l'automazione elastomeriche polidimetilsilossano (PDMS) a base di array microvalvola che non hanno bisogno di energia supplementare per chiudere e dispongono photolithographically definito volumi precisi. Un parallelo subnanoliter-volume del mixer e un sistema integrato di perfusione microfluidica sono presentati.

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Ricerca

Biologia

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Fabbricazione dei canali termoplastico Microfluidic

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Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

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Le domande Microfluidic per la diagnostica e getta

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Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assemblea dei nucleosomal matrici da ricombinanti core istoni e nucleosomi posizionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...