Gli autori desiderano ringraziare il Dr. John Harbell per il suo sostegno scientifico e il tempo dedicato al progetto dell&#39;IET. Gli autori desiderano anche ringraziare Beiersdorf AG (Germania), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Svizzera), Laboratoire Pierre Fabre (Francia), Harlan Laboratories (Regno Unito), e LVMH Parfume (Francia) per la partecipazione a Multi-Centro internazionale Pre e alla convalida Studi del Irritazione agli occhi di prova 15.

<ol>
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Spese di pubblicazione per questo articolo sono stati versati da MatTek Corporation.

Abbiamo presentato l&#39;oculare di prova (Figura 1) che è stato sviluppato per il modello di tessuto EpiOcular. L&#39;IET è in grado di separare sostanze irritanti e corrosive oculari (GHS categorie 1 e 2), combinato con materiali che non richiedono etichettatura (GHS nessuna categoria), con alto grado di sensibilità e specificità 17. L&#39;IET come presentato qui non discrimina tra GHS Categoria 1 da categoria 2 prodotti chimici. L&#39;EIT è stato convalidato per la classificazione e l&#39;etichettatura delle oculare potenziale di irritazione di una vasta gamma di sostanze chimiche, tra cui cosmetici e farmaceutici ingredienti. In concomitanza con altri test in vitro, l&#39;EIT servire come un sostituto per l&#39;occhio di coniglio test di irritazione in vivo. L&#39;IET utilizza due protocolli simili ma distinte per materiali liquidi e solidi, che variano nella durata dell&#39;esposizione e periodi di incubazione post-esposizione (Figura 1). L&#39;endpoint utilizzato nel IETè vitalità del tessuto, determinata con il saggio MTT, che è stato precedentemente utilizzato in validati modelli tessuti epiteliali umane 20,21. Per eseguire questo test, non è necessaria alcuna attrezzatura speciale oltre che delle apparecchiature standard di coltura cellulare. Dato l&#39;elevato livello di riproducibilità-tessuto tessuto, n = 2 tessuti invece del solito raccomandato n = 3 servono. La possibilità di usare n = 2 tessuti è un aspetto critico del protocollo, in quanto permette ad un operatore esperto per processare simultaneamente due tessuti, riducendo al minimo la variabilità del test che possono sorgere a causa del diverso trattamento dei singoli tessuti 14. Inoltre, utilizzando n = 2 tessuti per articolo di prova, l&#39;irritabilità di 10 sostanze di prova di uno stesso stato fisico (liquido o solido), insieme con i controlli positivi e negativi, può essere valutata utilizzando un kit (24 tessuti). Altri punti chiave che garantiscono la classificazione affidabile di materiali sono specifiche per il controllo positivo substance (vitalità del tessuto ≤50.0%), la riproducibilità tra tessuti duplicati (differenza &lt;20,0%), e letture OD controllo negativo (&gt; 0,8 e &lt;2,5). Durante la prova IET, è importante rispettare il protocollo convalidato e al dosaggio suggerito e orari risciacquo (Tabelle 3 e 4), in quanto deviazione dal protocollo o cambiamenti nei periodi di incubazione può causare risultati alterata. Allo stesso modo, le deviazioni dal tempo 3 ore per MTT incubazione si tradurrà in letture diverse MTT e possono influire risultato del test. Di tanto in tanto, una sostanza chimica di prova può avere proprietà ottiche o di altro tipo che possono interferire con il tessuto MTT viabilità saggio o la riduzione causa di MTT. Ad esempio, una sostanza chimica di prova può ridurre direttamente MTT in blu-viola prodotto di reazione, o può essere una sostanza colorata che assorbe la luce nella stessa gamma MTT formazan (~ 570 nm). Tuttavia, queste sostanze chimiche di prova saranno prESENT un problema solo, se al momento del saggio MTT, una quantità sufficiente di materiale è ancora presente (o assorbita) il tessuto. Per evitare questa interferenza, estese le procedure di lavaggio sono incorporati nel protocollo dell&#39;IET. Se il risciacquo non rimuove il TA e TA interferisce con la riduzione MTT, controlli aggiuntivi devono essere utilizzati per individuare e correggere per esso. In breve, se si sospetta riduzione diretta MTT della sostanza chimica in esame, 50 ml (o 50 mg per i solidi) della sostanza chimica in questione è incubato per 3 ore con la soluzione MTT lavoro a SCC (NC, 50 ml di acqua deionizzata sterile, dovrebbe essere eseguire contemporaneamente). Se la soluzione MTT diventa blu-viola, l&#39;articolo di prova si presume di aver ridotto la MTT. In questo caso la verifica funzionale mediante controlli tissutali freeze-ucciso deve essere eseguito per valutare se il materiale di prova è vincolante per il tessuto e porta ad un falso segnale di riduzione MTT. Se vi è la riduzione MTT sensibile del TA-esposto, controllo di tessuto ucciso(rispetto alla quantità nel tessuto vitale non trattato), la vitalità del tessuto medio del prodotto di prova deve essere corretto sottraendo la redditività media del controllo uccisi. L&#39;EIT sbaglia sul lato della sicurezza, come dimostrato dalla bassa incidenza di falsi negativi classificazioni 14,15,18. È importante sottolineare che nessuna delle categoria GHS 1 sostanze chimiche, che sono corrosivi per l&#39;occhio e che rappresentano il più grave pericolo per gli occhi, sono stati classificati come non irritante in questo saggio 14,15,18,19. Infine, uno dei principali vantaggi del RHCE in metodo di prova in vitro è la possibilità di testare liquido pulito e materiali solidi (che non è possibile con le culture, bidimensionali cellulare in immersione). L&#39;IET contribuirà in maniera significativa a determinare il potenziale di irritazione oculare di una vasta gamma di materiali secondo il sistema di classificazione ed etichettatura GHS dell&#39;ONU. La sostituzione degli animali per determinare oTossicità colare è stato un obiettivo della ricerca tossicologica per molti anni. Il metodo di prova EIT ha completato uno studio di validazione formale supportato da EURL ECVAM nel 2014 e la EpiOcular EIT è stato attuato negli indirizzi di test OECD l&#39;OCSE TG 492 nel 2015.

I prodotti di consumo come i cosmetici, detersivi, detergenti per la casa e comprendono una serie di sostanze chimiche che possono indurre gravi danni se si mettono in contatto gli occhi. Pertanto, le prove di questi agenti per l&#39;irritazione degli occhi è richiesto dalle agenzie di regolamentazione degli Stati Uniti e dell&#39;Unione europea per garantire la sicurezza dei consumatori 1. Una valutazione del potenziale di irritazione oculare di miscele e formulazioni è anche un requisito per il rispetto REACH (Registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche) La legislazione per l&#39;etichettatura degli ingredienti cosmetici ai sensi della direttiva europea sui cosmetici per il trasporto di prodotti chimici, e per l&#39;etichettatura dei pesticidi e prodotti per la casa 2. Attualmente, le agenzie di regolamentazione richiedono valutazione del pericolo oculare con il sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche (GHS) 3. GHS si basa principalmente sulla prova di irritazione oculare Draize, il più utilizzato test di irritazione oculare in cui sostanze estranee e mixtures vengono introdotti direttamente nel sacco congiuntivale dell&#39;occhio di coniglio 4. Secondo la classificazione GHS, GHS categoria 1 (corrosivi oculari) si riferisce per testare sostanze chimiche che causano gravi lesioni iniziale ai tessuti oculari o gravi danni agli occhi e la visione che non è completamente reversibile entro 21 giorni dopo l&#39;esposizione 3,5. GHS categoria 2 si riferisce a testare le sostanze chimiche che producono cambiamenti significativi negli occhi che sono completamente reversibili entro 21 giorni di esposizione. Sostanze chimiche di prova che non sono corrosivi o irritanti sono indicati come GHS No Categoria. Per più di 40 anni, l&#39;esame degli occhi coniglio Draize è stato criticato per la sua mancanza di riproducibilità, sovrastima delle risposte umane, e l&#39;uso di animali vivi 5-8. Queste preoccupazioni hanno spinto tante proposte per la raffinatezza, la riduzione e la sostituzione dei test in vivo 9. La necessità di alternative non animali convalidati è stata ulteriormente rafforzatacon l&#39;adozione del settimo emendamento alla direttiva sui cosmetici, che ha vietato l&#39;uso di animali nella valutazione della sicurezza dei prodotti cosmetici (nel 2005) e gli ingredienti (nel 2009) 2. Dal 1996, il modello tessuto corneale come ricostruito è stato ampiamente utilizzato nell&#39;industria cosmetica di valutare il potenziale di irritazione delle materie prime, formulazioni a base di tensioattivi, e miscele che sono progettati per l&#39;uso in composto, o in prossimità del, l&#39;occhio 10-13. L&#39;utilizzo del modello di tessuto RHCE consente l&#39;applicazione topica diretta del materiale di prova sulla superficie del tessuto nella sua forma non diluita nativa. In questo modo, le formulazioni non solubili in acqua possono essere testati senza diluizione con solventi. In risposta alle EURL di ECVAM (laboratorio di riferimento dell&#39;Unione europea Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi) richiesta di un metodo ampiamente applicabile, semplice, ed economico oculare Test (IET), che utilizza un single il tempo di esposizione ed è in grado di separare sostanze irritanti oculari e corrosive da materiali che non richiedono l&#39;etichettatura è stato sviluppato (Figura 1) 14. Sulla base dei risultati di 83 chimici (44 liquidi e 39 solidi), l&#39;EIT raggiunto 95,5 / 68,2 / e 81,8% di sensibilità / specificità e accuratezza (SS &amp; A) per liquidi, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS &amp; A per i solidi, e 97,6 / 68.3 / e 83,1% per la generale SS &amp; A. Nel 2007, uno studio di pre-validazione multi-laboratorio sponsorizzato dalla Cosmetics Europe (ex Colipa) sotto gli auspici del ECVAM EURL ha valutato la rilevanza e l&#39;attendibilità dell&#39;IET con l&#39;obiettivo di portare al 15 formale di convalida. In questo studio, 298 prove indipendenti sono state effettuate in sette laboratori indipendenti. I risultati dello studio hanno dimostrato accordo 99,7% in previsione con bassi coefficienti di variazione in tutti i laboratori partecipanti 15. Di conseguenza, nel 2010 il protocollo IET è entrato formale EURL ECVAMprogramma di convalida. Lo studio di validazione utilizzato 104 sostanze chimiche di prova codificati, comprese le sostanze individuali e miscele chimiche, per cui i dati in vivo di riferimento (Draize dati irritazione agli occhi) erano disponibili. Sulla base del successo di questo lavoro, un progetto di linee direttrici OCSE è stata presentata nel 2014. Si prevede che l&#39;IET contribuirà in modo significativo alla classificazione di irritazione oculare potenziale una vasta gamma di materiali secondo il sistema di classificazione ed etichettatura GHS dell&#39;ONU.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

Per rispettare il settimo emendamento alla legislazione direttiva sui cosmetici e REACH EU, sono necessari metodi alternativi non animali convalidati per la valutazione affidabile e preciso di tossicità oculare nell&#39;uomo. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare (IET), che utilizza un modello tridimensionale ricostruito umano cornea simile epiteliale (RHCE) tessuto che si basa su cellule umane normali. L&#39;IET è in grado di separare sostanze irritanti e corrosive oculari (GHS Categorie 1 e 2 combinati) e quelli che non necessitano di etichettatura (GHS nessuna categoria). Il test utilizza due protocolli separati, uno progettato per prodotti chimici liquidi e un secondo protocollo simile per articoli di prova solidi. Il modello di predizione IET utilizza un unico periodo di esposizione (30 min per liquidi, 6 hr per solidi) e un singolo vitalità del tessuto cut-off (60,0% come determinato mediante saggio MTT). Sulla base dei risultati di 83 sostanze chimiche (44 liquidi e 39 solidi) EIT raggiunto 95,5 / 68,2 / e 81.8% sensitivity / specificità e accuratezza (SS &amp; A) per liquidi, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS &amp; A per i solidi, e 97.6 / 68.3 / e 83,1% per la generale SS &amp; A. L&#39;IET contribuirà in modo significativo alla classificazione della potenziale di irritazione oculare di una vasta gamma di prodotti chimici liquidi e solidi, senza l&#39;uso di animali per soddisfare i requisiti di prova regolamentari. Il metodo EpiOcular IET è stato implementato nel 2015 negli indirizzi di test OCSE TG 492.

Risultati EIT rappresentativi condotti con 10 articoli di prova (TA) e controlli negativi e positivi sono presentati nella Tabella 6 e nella Figura 3. La media OD = 1.31 per il NC corrisponde alla vitalità del tessuto 100%, quindi il PC (media OD = 0.41) avevano vitalità del tessuto relativo del 31,2%. Quando il protocollo IET è stata eseguita in 15 esperimenti indipendenti valide in 7 laboratori utilizzando il protocollo un&#39;esposizione liquida e in 8 esperimenti validi indipendenti in 4 laboratori, utilizzando il protocollo di esposizione solido, la vitalità media dei tessuti per il PC utilizzando il protocollo di liquido era 36,4 ± 4,0 % e 32,3 ± 6,4% per il protocollo solidi. In tutti i casi, i risultati del controllo positivo sono stati al di sotto del valore di taglio del 60,0% 15. Come mostrato in figura 3, TA1, TA2, TA4, TA7 e TA8 aveva Viabilità tessuto&gt; 60,0% e quindi sono stati classificati come &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10 aveva Viabilità tessuto X04, 60,0% e, pertanto, sono stati classificati come &quot;io&quot;. La differenza di vitalità del tessuto tra i tessuti duplicati era &lt;20,0% per tutte le agenzie di viaggi, con l&#39;eccezione di TA2. Pertanto, i risultati per tutti gli articoli di prova, con l&#39;eccezione di TA2, sono stati considerati &quot;qualificato&quot; quando si sono incontrati tutti i criteri di accettazione dell&#39;EIT (sezione 10.2). A causa della variabilità tra tessuti duplicati per TA2 nel primo esperimento, un secondo esperimento era necessaria per ottenere risultati EIT qualificati. Il metodo di prova IET come qui descritto utilizzando il modello di tessuto RHCE è stato utilizzato per la valutazione di irritazione oculare in diversi studi di convalida multilaboratory, compresa la convalida formale EURL ECVAM / Cosmetici Europa 15,17-19. In tutti gli studi, l&#39;IET ha dimostrato di essere riproducibile e fu in grado di identificare correttamente i prodotti chimici (sia le sostanze e miscele) che non richiede classificazione e l&#39;etichettatura per irritazione agli occhi o lesioni oculari gravi accondo UN GHS 15,17-19. Il metodo di prova IET soddisfatto i criteri di accettazione del Group Management Validation (VMG) per irritazione agli occhi per la sensibilità, specificità e accuratezza complessiva e attualmente è in attesa di attuazione formale in sostituzione parziale in vivo coniglio Draize test 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figura 1: Schema di protocollo dell&#39;IET per articoli di prova liquidi e solidi Abbreviazioni utilizzate: AM, terreno di coltura;. SCC, condizioni di coltura standard; PBS, Dulbecco Phosphate Buffered Saline; RT, temperatura ambiente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figura 2:. La configurazione piastra da 96 pozzetti standardizzato per la prova di vitalità del tessuto MTT Due 200 microlitri aliquote sono TRAnsferred nei rispettivi pozzetti di una piastra a 96 pozzetti pre-etichettati. Abbreviazioni utilizzate: NC, controllo negativo; PC, controllo positivo; TA1-TA20, articoli di prova 1-20; Vuoto, soluzione estraente. 96- configurazione della piastra MTT viene utilizzato con foglio di calcolo Excel progettato per calcolare la vitalità del tessuto RHCE e risultati dell&#39;EIT. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figura 3: risultati dell&#39;EIT ottenuti per gli articoli 10 prova, Carolina del Nord e dei controlli di PC che utilizzano il modello di tessuto RHCE Il grafico è generato da un foglio di calcolo di Excel progettato per presentare i risultati dell&#39;IET.. Sostanze chimiche di prova che hanno ridotto la vitalità del tessuto ≤ 60,0% rispetto al NC sono classificati come sostanze irritanti (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e prodotti chimici di prova che aveva vitalità del tessuto&gt; 60,0% sono classificati come non-irritanti (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Tempo per le fasi di lavoro di protocollo IET (un giorno di lavoro per un operatore) Iniziare </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ogni riga corrisponde ad una coppia di tessuti </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ordine di passi: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Liquidi: </td><td> PBS </td><td> TA Esposizione </td><td> Post- Ammollo </td><td> Post- <td> MTT Reazione </td><td> MTT Estrazione </td><td> Misura </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> dopo </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3:. Calendario del campione per la prova di articoli di prova liquidi passi Protocollo tra cui pre-bagnare i tessuti con DPBS, Applicazione degli articoli di prova (TA), risciacquo e post-immersione, periodo di post-incubazione, saggio MTT, Estrazione di MTT, e misurazione di MTT OD sono presentati in colonne. Tempi per i tessuti duplicati sono organizzate in righe. L&#39;intero test test 10 agenzie di viaggi ed i controlli possono essere rifiniti in un giorno. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Ora di inizio per le fasi di protocollo dell&#39;EIT (2 giorni di lavoro per un operatore) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ogni riga corrisponde ad una coppia di tessuti </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Giorno 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 2 ° giorno (giorno successivo) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ordine di passi: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Solidi: </td><td> PBS </td><td> TA Esposizione </td><td> Post- Ammollo </td><td> Post- Incubaction </td><td> MTT Reazione </td><td> MTT Estrazione </td><td> Misura </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 6 ore </td><td> 26 min </td><td> 18 ore </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 00:56 </td&gt; <td> dopo </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 00:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 4: calendario del campione per la prova di articoli di prova solidi. Passi Protocollo tra cui pre-bagnare i tessuti con DPBS, Applicazione degli articoli di prova, risciacquo e post-immersione, periodo di post-incubazione, MTT assay, Estrazione di MTT, e misurazione di MTT OD sono presentati in colonne. Tempi per i tessuti duplicati sono organizzate in righe. L&#39;intero test di prova di 10 agenzie di viaggi e dei controlli viene effettuata nel corso di un periodo di due giorni. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Importo </td><td> Reagente </td><td> Condizioni di conservazione </td><td> Fonte </td><td> Descrizione </td><td> Data di scadenza </td></tr><tr><td> 1 flacone, 2 ml </td><td> MTT Concentrato (MTT-100-CON) </td><td> Al riparo dalla luce (-20 ° C) </td><td> MatTek </td><td> Congelati concentrato MTT </td><td> 2 mesi </td></tr><tr><td> 1 flacone, 8 ml </td><td> MTT diluente </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Per diluire MTT concentrato prima dell&#39;uso nel test MTT </td><td> 2 mesi </td></tr><tr><td> 1 bottiglia, 60 ml </td><td> Isopropanolo (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Soluzione solvente </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabella 5: MTT-100 Kit dosaggio dei componenti. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Codice N ° </td><td> Tessuto </td><td colspan="2"> Dati grezzi </td><td colspan="2"> Blank dati corretti </td><td rowspan="2"> media di OD </td><td rowspan="2"> % Della vitalità </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0.388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.480 </td><td> 0,484 </td><td> 0.480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0.508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0.149 </td><td> 0,144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> significare </td><td> Dif. </td><td> media di </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Classificazione </td></tr><tr><td></td><td> di OD </td><td> di OD </td><td> Viabilità [%] </td><td> di Viabilità </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1.314 </td><td> 0.041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0,043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0.127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0.333 </td><td> 76,1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0.030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0.078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0.101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75,0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> IO </td><td> qualificato </td></tr></tbody></table> Tabella 6:. I risultati ottenuti dell&#39;IET per 10 articoli di prova, Carolina del Nord e PC controlli I tavoli sono produced da un foglio di calcolo Excel progettato per calcolare la vitalità del tessuto e dei risultati dell&#39;EIT. Sostanze chimiche di prova che hanno ridotto la vitalità del tessuto ≤ 60,0% rispetto al NC sono classificati come sostanze irritanti (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e prodotti chimici di test che ha avuto la vitalità del tessuto&gt; 60,0% sono classificati come non-irritanti (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare, che utilizza un modello di tessuto tridimensionale ricostruito epiteliali della cornea, come l&#39;essere umano (RHCE). Il test è in grado di discriminare tra irritanti oculari e materiali corrosivi (GHS categoria 1 e 2 combinati) e quelli che non richiede etichettatura (GHS nessuna categoria).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.0K Views.  MatTek Corporation.  Abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare, che utilizza un modello di tessuto tridimensionale ricostruito epiteliali della cornea, come l'essere umano (RHCE). Il test è in grado di discriminare tra irritanti oculari e materiali corrosivi (GHS categoria 1 e 2 combinati) e quelli che non richiede etichettatura (GHS nessuna categoria). 

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

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Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

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Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow Camera

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Crescita degli strati cellulari endoteliali umani e ovini sulle membrane biomateriali

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificazione dell'organizzazione del collagene fibrilla con strumenti a base di trasformata curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...