Gli autori desiderano ringraziare per ZEBET al BfR (Germania), BASF SE (Germania), IIVS Inc. (USA), Zet-LSL (Austria) per la partecipazione in studio multicentrico di validazione internazionale della EpiDerm Modified SIT (5 ).

I. condizionamento del tessuto - Giorno 0 <ol><li> Una volta ricevuta la EPI-200-SIT kit EpiDerm, controllare tutti i componenti del kit per l&#39;integrità (per i dettagli vedi tabella kit di reagenti e attrezzature specifiche). </li><li> Per ogni tre tessuti EpiDerm, preparare uno sterile 6 pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. </li><li> In condizioni sterili, aprire il sacchetto di plastica contenente il 24 pozzetti contenenti i tessuti EpiDerm e rimuovere la garza sterile. </li><li> Usa pinza sterile per rimuovere ogni inserto contenente il tessuto EpiDerm e posto l&#39;inserto nel vuoto a 24 pozzetti. Durante questa fase, rimuovere qualsiasi residuo di spedizione agarosio che aderisce ai lati esterni della inserto assorbente da dolci su carta da filtro sterile. </li><li> Entro i prossimi 5 minuti, ispezionare visivamente i tessuti. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti che sono completamente coperti di liquido. </li><li> Utilizzando un tampone sterile punta del cotone, accuratamente asciugare la superficie dei tessuti. Cerca di non toccare il tessuto direttamente - effetti capillari sono sufficienti per eliminare l&#39;umidità dalla superficie del tessuto. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione la superficie del tessuto, il trasferimento di tre tessuti alla riga superiore del 6-pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. Fuoriuscire eventuali bolle d&#39;aria intrappolate sotto gli inserti. </li><li> Luogo il 6-pozzetti contenenti gli inserti in incubatore per 60 ± 5 minuti di pre-incubazione a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% RH (umidità relativa). </li><li> Alla fine del ± 60 5 minuti pre-periodo di incubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori nei pozzi inferiore del 6 pozzetti. Posizionare le piastre di nuovo nel incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per una notte di pre-incubazione (18 ± 3 ore). </li><li> Mettere il resto del terreno di coltura in frigorifero (5 ± 3 ° C). Dopo la notte di pre-incubazione, sostanze chimiche in esame può essere applicata ai tessuti EpiDerm. Nota: La procedura di pre-incubazione può essere abbreviato in caso di consegna tardiva dei tessuti (ad esempio se i tessuti arriva il Mercoledì, invece di Martedì). </li></ol> II. Esposizione chimica - Giorno 1 <ol><li> Preparare un 6 pozzetti per composto chimico in esame, compilando la riga superiore solo con 0,9 ml per pozzetto di terreno di coltura. </li><li> Circa 5 minuti prima della prevista esposizione a sostanze chimiche, rimuovere il 6-pozzetti contenenti la pre-condizione tessuti dal termostato. </li><li> Valutare la superficie dei tessuti e rimuovere l&#39;umidità con punte di cotone sterile. </li><li> Etichettare tutti i 6 e coperchi piastra con i codici del materiale di prova o di nomi. </li><li> Dose i tessuti con i prodotti chimici prova a intervalli di 1 minuto per facilitare il risciacquo delle sostanze chimiche di prova dopo l&#39;esposizione. Mantenere le piastre con i tessuti dosato nel cappuccio sterile, fino a quando il tessuto ultima è dosato. </li><li> Per testare sostanze chimiche liquide, dispensare 30 microlitri della soluzione direttamente in cima al tessuto e posizionare la rete di nylon sulla superficie dei tessuti. Se necessario, delicatamente posizione la maglia con il bulbo di vetro a capo pipetta Pasteur. Non premere sulla superficie del tessuto. </li><li> Per semisolidi prova, utilizzare una pipetta spostamento positivo per erogare 30 microlitri direttamente sopra il tessuto. Se necessario diffondere la chimica con pipetta Pasteur per coprire la superficie del tessuto il più possibile. </li><li> Per i materiali solidi, poco prima applicazione della sostanza in esame, inumidire la superficie del tessuto con 25 ml di DPBS sterile. Ciò permetterà di migliorare il contatto della superficie del tessuto con la sostanza chimica di prova. Riempire un cucchiaio 25 mg calibrato applicazione vivi (o qualsiasi altro strumento appropriato) con circa 25 mg di materiale finemente prova a terra. Applicare la chimica solida prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una lampadina a capo pipetta Pasteur di svuotare completamente il cucchiaio. Agitare delicatamente gli inserti di migliorare la diffusione del solido sulla superficie. </li><li> Per le sostanze test con consistenza cerosa, cercare di formare un &quot;cookie come&quot; piatto pezzo di circa 8 mm di diametro e metterlo in cima al tessuto, che è stato precedentemente bagnato con DPBS sterile. Per migliorare il contatto tra la sostanza di prova e dei tessuti, appesantire il &quot;cookie&quot; con un acciaio inossidabile o di un aiuto di plastica. </li><li> Applicare DPBS come il controllo negativo e il 5% SDS come controllo positivo ai tessuti di controllo. </li><li> Dopo la somministrazione del tessuto scorso, il trasferimento di tutti i piatti per 35 ± 1 minuti alla umidificata incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). </li><li> Dopo il 35 ± 1 minuti di incubazione a 37 ° C togliere tutti i piatti dal termostato. Posizionare le piastre all&#39;interno della cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti di esposizione chimica è completata per il tessuto prima dosato. </li><li> Successivamente avviare la procedura di lavaggio utilizzando il un inserto per intervallo di tempo minuto (per assicurazionee che il tempo di esposizione totale per ogni inserto è di 60 minuti). </li><li> Utilizzare una bottiglia di lavaggio per lavare i tessuti con DPBS sterile. Riempire il tessuto inserire 15 volte utilizzando un flusso costante di DPBS e svuotarlo (Nota:. Per i tessuti con una maglia di nylon, lavare la superficie del tessuto 5 volte e rimuovere la rete accuratamente con la punta, pinze taglienti In seguito, proseguono con gli altri 10 lavaggi). </li><li> Dopo il 15 risciacquare con la bottiglia di lavaggio, completamente immergere il 3 volte inserto in 150 DPBS ml e agitare per rimuovere il resto del materiale di prova. </li><li> Infine, sciacquare l&#39;inserto tessuto una volta dal di dentro e una volta dall&#39;esterno con DPBS sterile. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l&#39;inserto, e assorbente che sulla carta assorbente sterile. </li><li> Trasferire gli inserti di tessuto cancellati per la nuova piastra a 6 e in precedenza pre-riempite con terreno di coltura. Tutti questi passaggi (14-18) deve essere effettuata entro 1 minuto per ogni inserto. </li><li> Dopo l&#39;ultima tessuto è risciacquato accuratamente asciugare la superficie di ogni tessuto con un tampone di cotone sterile con punta. </li><li> Incubare i tessuti nell&#39;incubatrice per i prossimi 24 ± 2 ore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). Nota: Ogni tecnico saggio non dovrebbe testare più di 6 sostanze in esame inclusi i controlli negativi e positivi in una corsa di prova singola (set), per poter seguire il protocollo come descritto di seguito </li></ol> III. Mezzo di scambio - Giorno 2 <ol><li> Dopo il 24 ± 2 ore post-incubazione, trasferire gli inserti nella parte inferiore del 6 pozzetti, pre-riempita con 0,9 ml di media. Media da file superiori possono essere raccolti per l&#39;analisi degli endpoint addizionale (citochine, chemochine, ecc.) Analisi degli endpoint secondario è facoltativo. </li><li> Continuare con la post-incubazione (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per un altro 18 ± 3 ore. </li></ol> IV. MTT Assay Fattibilità - Giorno 3 <ol><li> Etichettare due piastre da 24 pozzetti con i nomi chimici o codici. Una piastra servirà per l&#39;incubazione del tessuto con MTT e l&#39;altra per la fase di estrazione. </li><li> Preparare la soluzione MTT da scongelamento il concentrato MTT (5 mg / ml) e diluire con il diluente MTT. Concentrazione finale della soluzione MTT è di 1 mg / ml. </li><li> Pipettare 300 ml di soluzione MTT in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti. </li><li> Rimuovere il 6-pozzetti da incubatore, asciugare la parte inferiore degli inserti su una carta assorbente, e trasferirli in 24 pozzetti pre-riempite con MTT. </li><li> Posizionare il 24 pozzetti in incubatrice (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) e incubare per 3 ore ± 5 min. Rispettare rigorosamente le 3 ore ± 5 minuti il ​​tempo di incubazione per evitare di scostamento tra MTT letture diverse. </li><li> Quando l&#39;incubazione MTT è completo, utilizzare una pompa di aspirazione per aspirare delicatamente il medium MTT da tutti i pozzi. </li><li> Riempire i pozzetti con DPBS ed aspirare di nuovo. Ripetere questa lavaggio due volte di più e fare in modo che i tessuti sono a secco dopo l&#39;aspirazione ultima. </li><li> Dopo il trasferimento lava gli inserti di un nuovo 24-pozzetti. Immergere gli inserti pipettando gentilmente 2 ml di soluzione estraente (isopropanolo) in ogni inserto. Il livello si alzerà sopra il bordo superiore dell&#39;inserto, così completamente sommergere i tessuti. </li><li> Sigillare il 24 pozzetti (per esempio con Parafilm o con borsa di tenuta) per inibire l&#39;evaporazione estraente. Estrarre il MTT dai tessuti per almeno 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente su un agitatore (~ 120 rpm). Estrazione durante la notte senza agitazione può anche essere usato. </li><li> Dopo il periodo di estrazione è completa, perforare gli inserti con un ago da iniezione o bulbo perline pipetta Pasteur e consentire l&#39;estratto a correre nel pozzo da cui ha tratto l&#39;inserto. </li><li> Scartare l&#39;inserto forato e pipetta la soluzione nel bene su e giù per tre volte fino a quando non è omogenea. </li><li> Per ogni tessuto, trasferire due aliquote 200 microlitri della soluzione viola formazano in un piatto fondo piatto da 96 pozzetti per microtitolazione. Trasferire i duplicati secondo il disegno piastra fissa dato nel foglio di calcolo che accompagna questo protocollo video. Per spazi vuoti, usare isopropanolo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) degli estratti MTT in uno spettrofotometro piastra a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d&#39;onda di 570 nm (540-580), senza un filtro di riferimento. </li><li> Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico dei risultati (Figura 1). </li><li> Una sostanza in esame è etichettato &#39;irritante&#39; (R38 o categoria GHS 2) la vitalità del tessuto percentuale determinata mediante test MTT è &lt;50% rispetto al controllo negativo. Nota: MTT è tossico, quindi assicuratevi di indossare guanti protettivi quando si maneggia. Proteggere MTT e il suo modolutions dalla luce, dal momento che MTT è sensibile alla luce. Usare la soluzione MTT poche ore dopo la preparazione perché si degrada nel tempo. </li></ol> Qualità saggio V. Controlli <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT kit Criteri di accettazione: Modelli in vitro RHE dovrebbero fornire dati coerenti, di alta qualità nel tempo, non solo durante il processo di convalida (8). Linee guida consigliate per assicurare a lungo termine la riproducibilità del test e le prestazioni sono &quot;caratterizzazione completa di cellule o tessuti, il campionamento di ciascun lotto ... per le prestazioni e l&#39;uso regolare dei controlli e prodotti chimici di riferimento per fornire garanzia di costanza di rendimento saggio&quot; (9) . Oltre a criteri di accettazione del test descritta di seguito, ogni lotto di produzione di EpiDerm è il controllo di qualità testati dal produttore nei confronti di un prodotto chimico di riferimento aggiuntivo (1% Triton X-100). Il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità del tessuto al 50% (ET-50) per il Triton X-100 è determinata. Per EpiDerm, media annua ET-50 i valori hanno spaziato da 5,9 ore a 7,5 ore. Il lotto di CV molto per tessuti di controllo negativo (cioè la variabilità della redditività di base) è stato in media sotto il 7,5% per ogni anno dal 1996. Il ET50 valore di ogni lotto di produzione deve rientrare nel 2 deviazioni standard rispetto alla media storica Triton X-100 ET50 fondata nel 1996 (cioè ET-50 = 6.7 ore, limite inferiore = 4.8h accettazione; limite di accettazione superiore = 8.7h), al fine per essere rilasciato per l&#39;utilizzo da parte del fabbricante. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 1: controllo negativo: L&#39;OD assoluto del controllo negativo (NC), tessuti (trattati con DPBS sterili) nel MTT-test è un indicatore della vitalità del tessuto ottenuto in laboratorio di test dopo la spedizione e l&#39;archiviazione delle procedure e in particolari condizioni di utilizzo. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la media OD 570 di tessuti NC è ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 2: controllo positivo Una soluzione al 5% SDS (in H 2 O) è usato come controllo positivo (PC) e testato in concomitanza con le sostanze chimiche di prova. Significa Concurrent che il PC deve essere testato in ogni test, ma non più di un PC di test è richiesto per giorno. Vitalità del controllo positivo dovrebbe essere entro l&#39;intervallo di confidenza al 95% dei dati storici. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la vitalità dei tessuti PC media espressa come% del tessuto di controllo negativo è del 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 3: Deviazione Standard (SD) L&#39;irritazione cutanea è previsto dalla vitalità medio determinato il 3 singoli tessuti e quindi la variabilità delle repliche di tessuto devono essere accettabilmente basso. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la SD calcolato Viabilità singoli tessuti% dei 3 identicamente trattati replica è &lt;18%. </li></ul> Rappresentante Risultati <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3" /> </div> Figura 1 I risultati ottenuti per 6 articoli di prova, CN e controllo da PC -. Parte del foglio di calcolo automatico per il calcolo dei risultati. Test di prodotti chimici che hanno ridotto la vitalità del tessuto al di sotto del 50% riferito a NC sono classificate come irritanti. Il test è ottimizzato per fornire risultati che sono sufficientemente lontano dalla classificazione cut-off (50% vitalità), aumentando così la robustezza del test. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiale </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Elencare le materie" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

In questo video, abbiamo dimostrato il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per i test di irritazione cutanea in vitro di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Quando si esegue questo metodo, è importante lavorare in condizioni asettiche e di seguire rigorosamente il protocollo validato, in quanto deviazione dal protocollo possono causare risultati diversi. Alcune modifiche del test sono possibili, tuttavia, le modifiche al protocollo dovrebbero essere discusse direttamente con gli autori. L&#39;unica limitazione di questo metodo è una possibile interferenza della sostanza in esame con l&#39;endpoint MTT. Una sostanza colorata o quella che riduce direttamente MTT (e mima quindi deidrogenasi dei mitocondri cellulari) possono interferire con l&#39;endpoint MTT. Tuttavia, queste sostanza in esame sono un problema solo se al momento del test MTT (ossia 42 ore dopo l&#39;esposizione della sostanza in esame), una quantità sufficiente di sostanza in esame sono ancora presenti sul (o nel) tessuti. Nel caso di questa eventualità, il (vero) riduzione MTT metabolica e il contributo di un materiale di prova o di colore (false) riduzione MTT diretto da parte del materiale in esame può essere quantificata mediante una procedura descritta in dettaglio nella procedura standard di funzionamento del test forniti da MatTek Corp.

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) è stato sviluppato<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E convalidato<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Il SIT EpiDerm utilizza il 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Ricostruito epidermico umano (RHE) EpiDerm modello. La procedura descritta in questo protocollo permette di discriminazione tra gli irritanti di categoria GHS 2 e non irritanti<sup&gt; (6)</sup&gt;. Il test viene eseguito nel corso di un periodo di tempo 4 giorni, composto di pre-incubazione, 60 minuti di esposizione, 42 ore di post-incubazione e vitalità saggio MTT. Dopo aver ricevuto i tessuti e pernottamento pre-incubazione (giorno 0), i tessuti hanno argomenti esposti a sostanze chimiche in esame (giorno 1), che può essere liquido, semi-solidi, solidi o cera. Tre i tessuti sono utilizzati per ogni sostanza chimica di prova, così come per il controllo positivo (5% aq. Soluzione SDS), e un controllo negativo (DPBS). L&#39;esposizione chimica dura 60 minuti, 35 minuti di cui sono conservati i tessuti in un incubatore a 37 ° C. Le sostanze in esame vengono poi rimossi dalla superficie del tessuto da una procedura di lavaggio estesa. Gli inserti di tessuto sono cancellati e trasferiti a mezzo fresco. Dopo un periodo di 24 ore di incubazione (Giorno 2), il mezzo è scambiata. Il mezzo può essere salvate per ulteriori analisi delle citochine o di altri endpoint di interesse. Dopo lo scambio di media, i tessuti vengono incubate per altre 18 ore. Al termine della 42h intero post-incubazione (giorno 3), i tessuti vengono trasferiti in soluzione MTT giallo e incubate per 3 ore. La risultante viola-blu sale formazan, formato principalmente attraverso il metabolismo mitocondriale, viene estratto per 2 ore con isopropanolo. La densità ottica del formazan estratto è determinato utilizzando uno spettrofotometro. Una sostanza chimica è classificato come un irritante la vitalità del tessuto rispetto al controllo negativo tessuti trattati è ridotta sotto il 50%. Questa procedura può essere utilizzata come sostituzione completa dei test di irritazione cutanea coniglio vivo per la identificazione dei pericoli e di etichettatura dei prodotti chimici in linea con le normative UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

In questo video, dimostriamo il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici.

Un In Vitro</emPelle> Test di Irritazione (SIT) con l&#39;epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Video: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

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Ricerca

Biologia

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Un In Vitro Test di Irritazione (SIT) con l'epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello