MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.

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None of the authors have competing or conflicting interests.

La procedura qui presentata è un mezzo efficace per la fabbricazione di microiniezione cannule e microiniettori che aiuteranno a chiarire i substrati molecolari del comportamento motivato. Questo metodo offre diversi vantaggi. In primo luogo, con la produzione di propri impianti e microiniettori, nuovi parametri sperimentali possono essere rapidamente ottimizzati, cioè, non c&#39;è bisogno di aspettare per i componenti su misura per arrivare. In secondo luogo, a causa del piccolo diametro della cannula, più cannule possono essere impiantati simultaneamente. Questo riduce il tempo chirurgico necessario, che può migliorare la sopravvivenza, e permette anche impianti multipli per animale. In terzo luogo, il software utilizzato per controllare le camere operante accomoda prontamente orari rapporto progressive da un paradigma rapporto fisso può essere rapidamente convertito in un rapporto di paradigma progressista semplicemente applicando un elenco di parametri di transizione evento che contiene la pianificazione di rinforzo desiderato. Essereampiamente utile, una procedura di microiniezione generico è stato presentato che dovrebbe essere ampiamente applicabile per la microiniezione di quasi qualsiasi reagente attualmente disponibili. Di conseguenza, prevediamo che questa tecnica continuerà ad essere di grande utilità simile in futuro con lievi modifiche. Cambiando solo poche variabili, questo approccio può essere applicato a una vasta serie di reagenti. Parametri che più comunemente manipolabili includono la lunghezza che microinjector sporge dalla cannula, volume di iniezione, e la velocità di iniezione. Ad esempio, si può desiderare l&#39;iniettore di sporgere più lontano dalla punta della cannula per evitare la cicatrice gliale che si forma tipicamente intorno agli impianti croniche. Inoltre, si può desiderare di iniettare un volume maggiore. Per microiniezioni virus striatali, un volume di 1 ml è tipicamente usato e questo volume è tipicamente iniettato in un periodo di tempo più lungo (spesso 7 - 10 min più 3 - 10 min tempo di diffusione supplementare) rispetto a tale usod per i reagenti farmacologiche (in genere 0,3 - 0,5 microlitri oltre 2-3 minuti più 1 - 3 min tempo di diffusione aggiuntivo). L&#39;utente deve consultare la letteratura e / o empiricamente determinare i parametri più adatti per le loro esigenze. Indipendentemente, il successo di questa procedura è criticamente dipendente da 4 variabili: 1) la lunghezza della cannula, 2) Lunghezza microinjector, 3) qualità del modello microinjector spruzzo, e 4) l&#39;integrità del sistema prima dell&#39;iniezione. Poiché posizione microiniezione dipende dalla profondità che microinjector sporge dalla cannula, è imperativo che entrambe le cannule (Fase 1.2.8) e lunghezza microinjector (post-piegatura, Step 2.2.1) sono entrambi noti ed uniforme precisamente tra tutti i soggetti . Questo può essere facilmente controllato da prontamente rifiutando qualsiasi attrezzo che non è la lunghezza desiderata al ri-misurazione finale. Inoltre, la posizione di iniezione può essere previsto solo se si verifica immediatamente sotto la cannula guida. Pertanto, qualsiasi microinjector che does Non spruzzare un lungo, ruscello un&#39;ammenda di prova (punti 2.4.6) devono essere respinti. Un&#39;iniezione qualità è anche legato alla integrità del sistema prima dell&#39;iniezione. Se dopo l&#39;erogazione tutta l&#39;acqua dall&#39;iniettore (prima del riempimento con reagente) punti multipli sono notati in laboratorio pulire, quindi una perdita necessario porre rimedio (Nota sul punto 2.4.8). Inoltre, se la bolla (Fase 2.4.9) che separa il farmaco dall&#39;acqua nel tubo PE20 è non uno, singola bolla (dopo il riempimento della microinjector con il reagente), allora l&#39;iniettore è parzialmente ostruito. Questo zoccolo potrebbe o impedire o deviare l&#39;iniezione. Anche questo può essere facilmente rimediato (nota nel passaggio 2.4.8). Qualora si volesse microinject mentre l&#39;animale è nel telaio stereotassico ci sono tre alternative. In primo luogo, si potrebbe aumentare la lunghezza del collare microinjector tale da poter essere bloccata dal manipolatore stereotassico e anche estendere quanto basta per consentire il collegamento di tubi PE20. In secondo luogo, ile potrebbe temporalmente impiantare una cannula e utilizzare il microinjector serie qui presentata. In terzo luogo, si potrebbe usare disegnato e pipette di vetro lucido. 16,17 Una limitazione significativa della procedura qui presentata è che è meglio condotta in ratti ben trattati, che hanno familiarità con la procedura. Ratti utilizzati per i dati descritti nella sezione dei risultati richiesta alcuna speciali procedure di manipolazione, perché lo stesso investigatore ratti trattati quotidianamente per più di 2 mesi. Questo comprendeva osservazione quotidiana e manipolazione della protesi chirurgica per almeno 2 settimane. Tuttavia, ratti possono essere rapidamente abituati da una serie di tecniche che vengono utilizzati per prima il test di inibizione pre-impulso, che può essere influenzata da stress. Queste tecniche speciali assuefazione sono state ben descritto in precedenza. 43 Oltre a queste procedure, è opportuno che i ratti sono abituati alla procedura di microiniezione in cui vengono utilizzati microiniettori accorciati duanello iniezioni &quot;sham&quot;. Durante queste finte iniezioni, è fondamentale che il microinjector non sporga nel tessuto al fine di limitare i danni ai tessuti. In altre parole, il microinjector dovrebbe essere non più di 14 mm piegato. Così, l&#39;assuefazione approfondita necessaria all&#39;attuazione ottimale di questa tecnica potrebbe essere considerata come una limitazione. Mentre diversi paradigmi comportamentali esistono per misurare la motivazione, il rapporto progressivo è comunemente utilizzato per quantificare lo sforzo che il soggetto è disposto a esercitare per ottenere un rinforzo. Il rapporto paradigma progressivo produce misura nota come punto di interruzione, che è spesso definito come il numero massimo di presse a leva nell&#39;ultimo rapporto completato;.. Per esempio, la massima risposta che ha generato un rinforzo 21 Il rapporto progressivo è sensibile al rinforzo grandezza. Ad esempio superiore cocaina (o saccarosio) dosi producono un elevato punto di interruzione e cocaina inferiore (o saccarosio) dosi producono una bassa breakpmisto. 21,22 conseguenza, punto di interruzione è un proxy utilizzato di routine per la motivazione e / o rafforzare l&#39;efficacia. 21,23-26 Perché l&#39;intenzione del punto di interruzione è quello di determinare quando l&#39;animale si blocca, un parametro importante del paradigma progressista rapporto è la durata della sessione. Lunghezze sessione finiti può mettere un tappo di falso su valori di breakpoint e questo può essere aggravato da pretrattamenti che anormalmente diminuire il tasso di auto-somministrazione o che post aumento rinforzo pausa. Questo confound può essere superato da qualsiasi numero di approcci,.. Es sessioni che terminano quando l&#39;animale è trattenuto rispondenti, per un multiplo dell&#39;intervallo media inter-infusione 44 Una variante più comunemente applicato di questo approccio è quello di terminare le sessioni volta rispondere ha stato trattenuto da qualche valore empiricamente determinato che si tiene costante tra i soggetti. Abbiamo fornito il metodo per applicare questo approccio nella Fase 4.4.9.11.

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cannula Tubing</td>
			<td>Amazon Supply/ Small Parts</td>
			<td>HTXX-26T-60</td>
			<td>26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obturator</td>
			<td>Amazon Supply/ Small Parts</td>
			<td>GWXX-0080-30-05</td>
			<td>33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector Wire</td>
			<td>MicroGroup</td>
			<td>33RW 304</td>
			<td>33 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>3924AC</td>
			<td>Liquid, Non-gel, can be autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector Plastic Tubing</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>427406</td>
			<td>PE20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Weight Hemostats</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501241-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-016</td>
			<td>150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52100-77</td>
			<td>Dumont, Dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Tool</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>285</td>
			<td>Two-speeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut-off Disc</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3602</td>
			<td>15/16&#34; x 0.025&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PhD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ul Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7001KH</td>
			<td>Needle Style: 25s/2.75&#34;/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operant Software</td>
			<td>Coulbourn</td>
			<td>Graphic State</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operant Chambers</td>
			<td>Coulborun</td>
			<td>Habitest</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Qui illustriamo esempi di risultati ottenibili con il procedimento sopra descritto. Indicato prima è una zona tipica che è trasfettata da vettori virali (Figura 3). In generale, un volume di transfettate ~ 1 mm 3 è ottenuta nel tessuto striatale. Il volume della regione trasfettate può essere quantificata attraverso le sezioni seriali utilizzando il metodo di Cavalieri 32 Soprattutto, il volume transfettate dipende da molti fattori quali il tipo di tessuto che viene trasfettato.; sierotipo virale; promotore; frequenza e il volume iniettato; numero di particelle iniettate; iniettato pH; e se reagenti iperosmolari, come mannitolo, sono stati utilizzati. 33,34 Tipicamente, microinject 10 12 particelle / ml, 1 ml / laterali su 10 min, e consentire ulteriori 7 min prima di sostituire otturatori. Inoltre, l&#39;iniettato è generalmente intorno a pH 8. Successivamente, dimostriamo che la motivazione può essere manipolato da una espressione del transgene (Figura 4)o farmacologica microiniezione reagente (Figura 5). Nella Figura 4, abbiamo espresso un recettore Designer Esclusivamente Attivato da Designer Drugs (DREADDs). La regione del recettore codificante DREADD è stata seguita da una voce sito ribosoma interno e una cassetta mCitrine. Il mCitrine permette comoda visualizzazione delle cellule trasfettate. Il DREADD è stato accoppiato a G proteine ​​eterotrimerica Gαq. Attivazione del DREADD Gαq accoppiamento può stimolare astrociti, 28,35 e il DREADD stesso può essere attivato mediante somministrazione sistemica di clozapina-N-ossido (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 ratti sono stati formati per Leva risponde per l&#39;etanolo rinforzo, dove 3 presse a leva ceduto 1 possibilità di bere durante le sessioni quotidiane 1 hr oltre 60 giorni contigui. Successivamente, i ratti sono stati costretti in astinenza, e DREADDs Gαq accoppiati sono stati espressi in nucleo accumbens astrociti core. Dopo tre settimane di astinenza, la motivazione di auto-ADMI<html> Nister etanolo è stata misurata mediante punto di interruzione. 21,27-30 attivazione del nucleo accumbens astrociti di base, tramite somministrazione sistemica CNO, è diminuita la motivazione di ratti di riprendere etanolo autosomministrazione dopo astinenza rispetto al veicolo. È importante sottolineare che CNO ha avuto alcun effetto in una coorte altrettanto qualificato che esprimeva proteina fluorescente verde al posto del DREADD. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante regione striatale ventrale trasfettate da virus microiniezione. Questa immagine illustra la regione di nucleo accumbens astrociti che sono state trasfettate seguendo il metodo di cui sopra. I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l&#39;autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati in tale pubblicazione e il materiale supplementare di accompagnamento.blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Figura 4. Motivazione dei ratti ad auto-somministrarsi l&#39;etanolo è stato ridotto attivando un transgene che era over-espresso in nucleo accumbens astrociti fondamentali. Virus è stato microiniettato e motivazione misurata tramite punto di interruzione dopo aver lasciato una settimana per il virus di esprimere. Il transgene espresso è stato un designer recettore Esclusivamente Attivato da Designer Drugs (DREADDs). Un ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04) seguita da una post-hoc Scheffé rivelato che l&#39;attivazione del DREADD dalla somministrazione sistemica di clozapina-N-ossido (CNO, 3 mg / kg, ip ) ha ridotto significativamente la motivazione di ratti ad auto-somministrarsi etanolo dopo astinenza rispetto al veicolo CNO ha avuto alcun effetto in una coorte altrettanto qualificato che esprimeva Green Fluorescent Protein (GFP) al posto del DREADD. I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l&#39;autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati in tale pubblicazione e il materiale supplementare di accompagnamento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Figura 5. microiniezione di gap bloccanti giunzione aumentato la motivazione dei ratti di auto-amministrare etanolo dopo astinenza Due bloccanti divario di giunzione sono stati valutati per il loro effetto sulla motivazione (misurata tramite punto di interruzione) di ratti di auto-amministrare etanolo:. Meflochina e 18- alfa-glicirretico acida (18-α). Una ANOVA a due vie ha rivelato che la microiniezione di bloccanti gap-junction nel nucleo accumbens nucleo ha aumentato la motivazione dei ratti di auto-amministrare etanolo dopo l&#39;astinenza (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). I dati sono ristampati da Bull et al., 13 con l&#39;autorizzazione del titolare del copyright. Dettagli possono essere trovati nella suddetta pubblicazione eil materiale supplementare di accompagnamento.

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Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K Views.  Virginia Commonwealth University School of Medicine. Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented. 