Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili. Poiché le regioni cerebrali sono tenute congelate dal raccolto attraverso la dissezione, le molecole bersaglio vengono preservate e il ricercatore ha il tempo di sezionare e immagazzinare attentamente le regioni di interesse. Identificare le regioni di interesse può essere inizialmente impegnativo.
L'uso di punti di riferimento cerebrali comuni man mano che emergono e si allontanano attraverso le sezioni in relazione alle regioni desiderate renderà chiara l'identificazione. Dopo aver rimosso il cervello dai topi adulti eutanasiati di tipo selvatico CD-1, flash congelare il tessuto per 60 secondi in azoto liquido o isopentane. Pre-raffreddare con ghiaccio secco e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
24 ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita su una pila di confezioni congelatrici scongelate. E incastro i lati della matrice tra due confezioni congelatrici assicurandosi di lasciare circa mezzo centimetro tra il fondo delle fessure del rasoio e la parte superiore delle confezioni. Impostare una lastra di vetro congelata per la dissezione riempiendo una scatola isolata con ghiaccio fino a circa cinque centimetri dall'alto.
Quindi posizionare uno strato di ghiaccio secco di 2,5 centimetri sopra. E coprirlo con fogli di plastica nera. Posizionare una lastra di vetro sopra la plastica.
E ghiaccio secco intorno ai bordi del piatto. Rimuovere la matrice cerebrale congelata dal congelatore e inserire il cervello, lato corteccia verso l'alto, nella matrice. Lasciare che il tessuto equilibra alla temperatura nella scatola per 10 minuti.
Tenere aperto il coperchio durante questo periodo. Utilizzare le forcep fredde per regolare la posizione del cervello nella matrice in modo che il seno sagittale e il seno trasversale si allineano con le scanalature perpendicolari del blocco. Una volta che il cervello è in posizione, posizionare una lama di rasoio refrigerata vicino al suo centro e premerla di circa un millimetro nel tessuto.
Quindi, posizionare una lama refrigerata ad ogni estremità del cervello e premere fino in fondo nella matrice. Quindi iniziare ad aggiungere lame refrigerate all'estremità rostrale, posizionandole nelle fessure una alla volta e premendole delicatamente di un millimetro nel tessuto. Continuare ad aggiungere lame a intervalli di un millimetro, lavorando verso l'estremità caudale.
Quando tutte le lame sono in posizione, premere verso il basso sopra con le dita, il palmo o un oggetto smussato e scuoterle lentamente da un lato all'altro per spostarle attraverso il tessuto. Una volta che le lame hanno raggiunto il fondo delle fessure, afferrare ogni lato del gruppo di lame e liberarle dalla matrice dondolando avanti e indietro. Dopo aver liberato il gruppo di lame, posizionarle sul lato rostrale sulla piastra di vetro e mettere il ghiaccio secco accanto o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni per una separazione più semplice.
Quindi posizionare la pila con bordi affilati verso il basso e separare le lame spostando la pila tra il pollice e le dita. Allineare la sezione sulle piastre di vetro da rostrale a caudale e separare il tessuto dalle lame flettendole tra le dita o separandole con una seconda lama refrigerata. A volte, il tessuto può attaccarsi a entrambi i lati di una lama e si deve fare attenzione a mantenere l'orientamento rostrale a caudale.
Prima di iniziare la dissezione, apri l'Allen Mouse Brain Atlas o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Utilizzare forcep o lame refrigerate per capovolgere la sezione. E assicurati che la regione di interesse sia coerente in tutta la sezione.
Tagliare nella sezione con un bisturi pulito o un pugno, spingendo il metallo delicatamente ma saldamente nel tessuto. Dondolandolo avanti e indietro per fare il taglio. Dopo aver raccolto la regione di interesse, posizionarla in tubi pre-refrigerati pre-refrigerati da 1,5 millimetri e conservarli a meno 80 gradi Celsius.
Per elaborare il tessuto, aggiungere tampone RIPA freddo per l'estrazione proteica o un guanidinio contenente solvente per l'estrazione dell'RNA e omogeneizzarlo immediatamente con un down di vetro o un omogeneizzatore meccanico. Per convalidare questo metodo, la corteccia prefrontale mediale è stata raccolta da topi maschi adulti di tipo selvatico CD-1 e sono stati caratterizzati RNA e proteine. Se analizzato con elettroforesi capillare, l'RNA degradato mostra una perdita nell'intensità delle bande ribosomiche 28S e 18S, così come uno striscio tra 25 e 200 nucleotidi.
Mentre l'RNA di alta qualità mostra bande ribosomiali distinte poco o nessun segnale nella regione a basso peso molecolare. L'RNA ottenuto utilizzando il metodo di dissezione congelata è stato confrontato con l'RNA preparato da tessuto appena raccolto. Entrambi i metodi producono RNA con alti numeri di integrità e forti bande ribosomiali.
Per confermare che questo metodo può essere utilizzato per preservare il microambiente del tessuto sezionato per un'analisi successiva, l'RNA è stato estratto dalla corteccia prefrontale mediale sezionata che era stata immagazzinata per diverse settimane. Tutti i campioni hanno prodotto RNA di alta qualità con bande ribosomiali distinte e numeri di integrità dell'RNA superiori agli otto. Per confermare l'integrità proteica dei campioni sezionati congelati, la proteina è stata raccolta, trasferita alla nitrocellulosa e alla sonda con anticorpo contro l'alto peso molecolare bersaglio KCC2 e l'actina proteica a basso peso molecolare.
In tutti i casi le bande erano affilate e distinte senza prodotti di degradazione percepibili. È importante mantenere i tessuti congelati durante tutto il processo in quanto ciò preserva il microambiente delle sezioni e mantiene la morfologia della sezione per il confronto con le immagini dell'atlante cerebrale. Le regioni di interesse raccolte in questo modo possono essere conservate per diversi mesi a -80 gradi Celsius e possono essere utilizzate in molte applicazioni downstream, tra cui RT-qPCR, RNA-Seq, analisi western blot e HPLC.
Questo metodo è stato utilizzato per esplorare i cambiamenti molecolari all'interno dei sistemi limbici dei roditori perinatale esposti al THC e ad altri cannabinoidi per capire meglio come questi farmaci possono influenzare lo sviluppo cerebrale.
