Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Nota: fare riferimento ai documenti CLSI M7-A10 e M100-S25 e / o ISO / FDIS 20776-1 per tutti i dettagli del metodo di riferimento microdiluizione in brodo di sensibilità agli antibiotici 2, 3, 4 I metodi di riferimento consentono di opzioni in alcuni dei. specifiche procedure per la preparazione inoculo e pannello MIC di produzione per ottenere lo stesso risultato finale. Il metodo qui descritto si riferisce ad un agente antimicrobico, dalbavancina, e alcuni dei passi rappresentano uno dei diversi modi potenzialmente il metodo di riferimento può essere fatto. Le opportune precauzioni di sicurezza (in coerenza con livello di biosicurezza 2) dovrebbero essere utilizzati 10. Il pannello formato MIC utilizzato ai fini di questa pubblicazione viene proiettato in Tabella 1. 1. Conservare Dalbavancina Polvere <ol><li> Al ricevimento di diagnostica grado dalbavancina in polvere, conservare a -20 ° C in un ambiente essiccato in un congelatore non sbrinamento. Prima dell&#39;uso, la polvere deve equilibrare araggiungere RT prima dell&#39;apertura. </li></ol> 2. Preparare MIC del pannello diluizioni <ol><li> Preparare una soluzione madre non superiore a 1.600 mg / ml di dalbavancina in ordinata (puro) DMSO in tubi di vetro o di plastica sterili, e utilizzare lo stesso giorno di preparazione o conservare a -20 a -60 ° C o al di sotto per un uso futuro in un congelatore non sbrinamento. Prendere in considerazione la potenza di dalbavancina quanto previsto sulla documentazione ricevuta con la polvere, quando si pesa la polvere (vedi equazione 1 per esempio 800 mg / ml di brodo di preparazione). </li><li> Diluire la diluizione azione simile allo schema come mostrato nella colonna 1 (&quot;Sorgente concentrazione&quot;) nella tabella 2 con DMSO pulito in tubi di vetro o di plastica sterili. Utilizzare una pipetta per la misurazione di diluente e un altro pipetta per aggiungere la dalbavancina azione iniziale per il primo tubo. Per ogni successiva concentrazione dalbavancina magazzino usare una nuova pipetta. </li><li> Preparare 100X finale concent pannello MICdiluizioni razione (concentrazioni intermedie) con DMSO pulito. Come mostrato nelle colonne 2-4 della tabella 2, unire volumi appropriati di sorgente e DMSO per ottenere concentrazione intermedia desiderato (volumi da utilizzare dipenderà dal numero di pannelli MIC da effettuare). </li><li> Preparare 0.004% P80: Preparare una soluzione fresca di lavoro stock del 2% P80 con l&#39;aggiunta di 0,1 ml a 4,9 ml P80 dH 2 O. Sterilizzare passando attraverso un filtro e uso soluzione 0,22 micron nello stesso giorno di preparazione. Preparare 0,004% P80 diluente facendo una diluizione 1: 500 del 2% P80 (ad esempio, 0,3 ml di 2% P80 a 149,7 ml di CAMHB). </li><li> Ulteriori diluire le concentrazioni intermedie preparata al punto 2.2 1: 100 in catione regolato Mueller Hinton Broth (CAMHB) supplementato con 0,004% (v / v) polisorbato-80 (-80 P) P-80 e / o LHB (per streptococchi) aggiunto a doppia concentrazione finale per aggiunta di inoculo (passo 4.3) si tradurrà in una diluizione 1: 2. Vedere colonne 6 e 7 nella tabella 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Preparare Pannelli MIC <ol><li> Dispensare 50 ml di ciascuna soluzione dalbavancina preparata al punto 2.3 in appositi pozzi del pannello MIC e includere i supporti in un solo bene (controllo della crescita bene). Una pipetta multicanale con punte sterili può essere utilizzata in questa fase. </li><li> Utilizzare i pannelli immediatamente o sigillare con film plastico, posto in sacchetti di plastica e mettere subito in un congelatore non sbrinamento a ≤-20 ° C (preferibilmente a ≤-60 ° C) fino al momento dell&#39;uso. Se si utilizzano i pannelli congelati, rimuovere sigilli e posizionare i pannelli individuali sul banco di laboratorio per 15-30 minuti (fino al contenuto dei pozzetti siano scongelati) prima di procedere alla inoculazione pannello. </li></ol> 4. Inoculare Pannelli MIC, eseguire la purezza e l&#39;installazione Colony Conte <ol><li> Selezionare alcune colonie ben isolate da un 18-24 ore agar sangue o altra piastra agar non selettivo. Toccare la parte superiore di ogni colonia con un&#39;ansa sterile o tampone e trasferimento a 1-5 ml CAMHB o sAline fino torbidità è equivalente a uno standard McFarland 0,5. Valutare torbidità per confronto visivo al 0,5 McFarland o con un dispositivo fotometrico. </li><li> Entro 15-30 minuti dalla preparazione, diluire l&#39;inoculo 1: 100 in CAMHB (100 ml in 10 ml CAMHB). Per la maggior parte dei batteri testati contro dalbavancina, ad eccezione di S. pneumoniae, questa diluizione fornirà una concentrazione finale di ben 5 x 10 5 CFU / ml (intervallo accettabile è 2-8 x 10 5 CFU / ml). Per S. pneumoniae, concentrazione batterica basata sul confronto di torbidità a 0,5 McFarland è tipicamente molto meno, quindi, diluire l&#39;inoculo 1:25 (400 ml in 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Entro 15 minuti dopo la preparazione dell&#39;inoculo, trasferire 50 ml di inoculo finale in ciascun pozzetto (ad eccezione del controllo di sterilità e) del pannello MIC preparato al punto 3. pipetta multicanale con punte sterili può essere utilizzata in questa fase. </li><li> Eseguire un controllo di purezzatrasferendo e diffondendo un&#39;aliquota 1-10 microlitri dal controllo della crescita positivo anche utilizzando un&#39;ansa sterile per un agar non selettivo (per esempio, TSA con il 5% di sangue di montone). </li><li> Configurazione conteggio delle colonie prelevando 10 microlitri dal controllo della crescita e con un singolo canale pipetta e punta sterile e trasferimento a 10 ml di soluzione salina (1: 1.000 diluizione). Mescolare e trasferire 100 ul con un singolo canale pipetta e punta sterile per un mezzo adatto non selettivo agar (ad esempio, TSA con il 5% di sangue di montone) e si sviluppa su tutta la superficie agar con un&#39;ansa sterile, ripetendo due volte in diverse direzioni per assicurare una distribuzione uniforme del inoculo (diluizione 1:10). </li></ol> 5. Pannelli Incubare MIC, Colonia di Conte e piastre Purezza <ol><li> Sigillare ogni pannello MIC o una pila di non più di 4 pannelli in un sacchetto di plastica, con nastro di plastica o con un coperchio di plastica aderente prima incubazione. In alternativa, inserire pannello MIC vuoto sul top di pila di non più di 4 pannelli MIC, mettere un tovagliolo di carta umida in un contenitore di plastica, pannelli luogo MIC nel contenitore di plastica e nei pressi del contenitore in modo sicuro con coperchio. </li><li> Incubare pannelli MIC in un incubatore ambiente a 35 ° C ± 2 ° C per 16-20 ore (stafilococchi ed enterococchi) e 20-24 ore (streptococchi) entro 30 min di inoculazione. Incubare il conteggio delle colonie e le piastre di purezza nelle stesse condizioni, tranne streptococchi incubare in un incubatore CO 2 al 5%. </li></ol> 6. Leggere il MIC e Colonia Conte Piatti; Controllare Purezza Piastra <ol><li> Leggere il MIC come concentrazione minima che inibisce completamente la crescita batterica nei pozzetti rilevate tramite occhio nudo. </li><li> Contare le colonie sulla piastra conta delle colonie. Moltiplicare ogni colonia fattore di diluizione (1: 10.000) (ad esempio, 50 colonie è equivalente a 5 x 10 5 CFU / ml). Un intervallo accettabile è 20-80 colonie (2-8 x 10 5 CFU / ml) e viene utilizzato come approguida ximate. </li><li> Controllare piatto purezza. Se tutte le colonie sono simili alle colonie utilizzati nel passaggio 4.1, quindi l&#39;inoculo può essere considerato puro. Se ci sono altre colonie presenti, allora esiste la possibilità di un contaminante di essere presente nel pannello MIC e il test deve essere ripetuto. </li></ol> 7. controllo di qualità Risultati. <ol><li> Fare riferimento alla Tabella 3 per i range attesi di ceppi di controllo qualità CLSI. Riportare i risultati di prova solo se isolati di risultati MIC dalbavancina per organismo di controllo della qualità (s) sono all&#39;interno del range atteso. </li><li> Se si ottiene una MIC di ≥0.25 ug / ml per ogni S. clinica aureus isolare, ripetere il test dalbavancina MIC e / o inviare ad un laboratorio di riferimento per la verifica. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. 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Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

Sandra McCurdy è un dipendente di Durata Therapeutics; Specialisti del laboratorio, Inc., datore di lavoro di Laura Koeth e Jeanna Fisher, è stata incaricata da Durata Therapeutics per preparare il manoscritto. Spese di pubblicazione per questo articolo sono stati versati dagli specialisti del laboratorio, Inc.

I seguenti dettagli di metodo sono presentati per ulteriori considerazioni durante la preparazione per i test dalbavancina MIC. Il disegno del pannello MIC dipenderà dal numero di agenti antimicrobici da testare (es., Da solo o più agenti dalbavancina) e le specie di batteri da testare. Le concentrazioni Dalbavancina dovrebbero comprendere i punti di interruzione interpretative per tutte le specie batteriche da testare e l&#39;intera gamma di diluizioni previste per almeno un ceppo di controllo di qualità. La serie di diluizioni antimicrobico può essere organizzata in righe o colonne a seconda del numero di agenti antimicrobici e / o isolati / piastra e metodo di inoculazione. Il volume di dalbavancina in polvere e il brodo deve essere calcolata per assicurare che quantità ottimali vengono prodotti e rifiuti è minima. Per l&#39;esempio utilizzato in questa pubblicazione, volumi si basano sui preparazione di due pannelli MIC. Cation regolato Mueller Hinton brodo deve essere preparata e sterilizzato in autoclave secondo uomole istruzioni e la sterilità dei mezzi di comunicazione di produttori di realizza- verificati. MIC pannelli possono essere realizzati ed utilizzati sullo stesso giorno di preparazione oppure possono essere testati con microrganismi di controllo di qualità e pannelli convalidati conservati congelati per un uso futuro. È importante utilizzare tecniche sterili durante tutta la procedura. Non ci sono criteri rigorosi per la verifica della concentrazione di inoculo con conta delle colonie. Conta delle colonie possono essere controllati inizialmente per ciascuna specie testate e / o periodicamente per convalidare il passo diluizione effettuata al punto 4.2. È importante che la validità dello standard 0,5 McFarland viene anche controllato regolarmente con E. coli ATCC 25922 utilizzando una procedura analoga al punto 4.5. Se i risultati non sono equivalenti a 1-2 x 10 8 UFC / ml, un nuovo standard McFarland 0,5 dovrebbe essere ottenuto. Se i conteggi delle colonie dai pozzi MIC sono al di fuori del range accettabile (2-8 x 10 5 CFU / ml consente e MIC per l&#39;isolato clinica (s) variano da the atteso distribuzione normale (ad es. 0,03-0,12 ug / ml per S. aureus) e / o risultati MIC per isolare il controllo della qualità (s) sono al di fuori del range attesi, test di convalida è necessario e metodo di modifica può essere giustificata. Si suggerisce che una convalidato 0.5 standard di McFarland viene utilizzato per ripetere il conteggio delle colonie (s) e se i risultati sono ancora una volta al di fuori dei risultati attesi, la diluizione inoculo eseguito nella fase 4.2 deve essere regolato di conseguenza e il MIC ripetuto. Si noti che un controllo della purezza è necessaria anche se si esegue un conteggio delle colonie perché la procedura conteggio delle colonie utilizza un volume diluito che non necessariamente rilevare concentrazioni minori di organismi contaminanti. Per un test MIC può essere considerata valida, la crescita accettabile deve avvenire nel controllo della crescita bene. Per la maggior parte dei batteri che saranno testati contro dalbavancina (es., Stafilococchi, streptococchi ed enterococchi, la crescita sarà visto come un pulsante (tipicamente&gt; 2 mm) e meno frequently, la crescita può apparire come torbidità nel pozzo. A differenza di alcuni agenti antimicrobici che possono presentare effetti di trascinamento come aumentano le concentrazioni, gli endpoint dalbavancina sono in genere ben definiti. Ci sono vari dispositivi di visualizzazione allo scopo di favorire la lettura microdiluizione test, che possono essere utilizzati per leggere Dalbavancina piastre contenenti fino a quando non vi è alcun compromesso nella capacità di discernere crescita nei pozzetti. Le fasi critiche all&#39;interno del protocollo riguardano le parti del procedimento che sono legati alla solubilità di dalbavancina e l&#39;aggiunta di P80. È importante che la concentrazione massima di dalbavancina utilizzato è non superiore a 1,600 g / ml, che DMSO viene utilizzato come solvente e che concentrazioni intermedie sono preparati in DMSO prima di effettuare le diluizioni brodo in modo che la concentrazione finale di DMSO in MIC Pannello pozzi non è maggiore di 1%. DMSO è igroscopico e quindi, l&#39;uso di bottiglie precedenti di DMSO era un consideration per quanto riguarda la dalbavancina solubilità. Tuttavia, mentre un piccolo studio BMD con ceppi di controllo di qualità ha dimostrato che questo non essere una variabile importante (vedi la sezione risultati), è buona norma utilizzare bottiglie nuovi o di recente apertura di DMSO. E &#39;anche importante che P80 viene aggiunto al brodo nella fase finale di preparazione di diluizione del farmaco ed è ad una concentrazione finale di 0,002% in MIC bene. La procedura BMD qui incluso utilizza preparazione di pannelli MIC utilizzando 50 microlitri / pozzetto a dalbavancina e P-80 concentrazioni due volte la concentrazione finale dell&#39;inoculo con aggiunta di 50 microlitri / pozzetto in modo che il volume finale / pozzetto è di 100 microlitri. Questo metodo consente un formato del pannello MIC da produrre per la sperimentazione di entrambi S. aureus e S. pneumoniae perché il sangue lisato di cavallo può essere aggiunto al inoculo. Metodi alternativi per la preparazione di pannelli MIC utilizzando 100 microlitri / pozzetto con aggiunta di fino a 10 microlitri / pozzetto sono descritti nelProcedure CLSI e ISO. Il punto di interruzione suscettibile dalbavancina per S. aureus è ≤0.12 mg / ml (FDA foglietto illustrativo). Come mostrato in recente sorveglianza, la maggior parte degli isolati sono inibiti dalla Dalbavancina a livelli di 0,06 mg / ml 15. Con un punto di interruzione suscettibile vicino alla MIC modale, qualsiasi variazione di MIC come risultato di differenze metodo può influenzare i tassi di suscettibilità. Poiché la procedura BMD per dalbavancina include alcuni passaggi unici (in particolare, l&#39;uso di DMSO in preparazione del magazzino e diluizioni di droga intermedi e 0,002% P80 nel MIC bene, è imperativo che il metodo è seguito esattamente. L&#39;organismo S. aureus QC (ATCC 29213) con un chiaro MIC dalbavancina modale di 0,06 mg / ml, è stato un buon indicatore di variazione metodo e deve essere usata come metodo per validare il metodo BMD. Se i risultati MIC sono con il range atteso di ,03-,12 mg / ml, ma sono trend sia al basso o high lato di questa gamma, un&#39;ulteriore validazione del metodo è garantito. L&#39;aggiunta di 0,002% P80 è raccomandato per tutti gli organismi pertinenti Gram-positivi (staphylococcci, enterococchi e streptococchi.) Tuttavia, è da notare che è stato dimostrato che lisato sangue di cavallo agisce simile a P-80 rispetto al suo anti-binding capacità e che l&#39;aggiunta di P-80 a CAMHB + LHB ha alcun effetto aggiuntivo sulla dalbavancina streptococchi risultati MIC. Non vi è alcun metodo di diffusione del disco per il test dalbavancina e per la scarsa correlazione tra BMD e risultati AD, test di sensibilità della dalbavancina con il metodo AD non è raccomandato 12, 14. Il metodo BMD deve essere usato per la futura valutazione dalbavancina suscettibilità e come standard di riferimento per lo sviluppo di test di sensibilità antimicrobici commerciali.

Dalbavancina è un lipoglycopeptide semi-sintetico che è stato approvato dalla FDA nel maggio 2014 per il trattamento delle infezioni della pelle e pelle struttura batteriche acute causate da Gram-positivi 1. L&#39;obiettivo primario di dettagliare questo metodo in un formato video è quello di fornire indicazioni chiare agli laboratorio e di ricerca gli scienziati clinici per i test e la comunicazione dei risultati dalbavancina suscettibilità accurati e riproducibili. La determinazione di un agente antimicrobico MIC con metodi commerciali è eseguita di routine in laboratori clinici per la valutazione dell&#39;attività di un agente in vitro contro i batteri patogeni. Il metodo qui descritto è il metodo di microdiluizione brodo, come raccomandato dal CLSI e ISO 2,3,4. Dal momento che la dalbavancina metodi suscettibilità commerciali non sono attualmente disponibili (al momento della pubblicazione) e la diffusione del disco e dei metodi di diluizione in agar non sono attualmente Fo dalbavancina, metodi di diluizione riferimento brodo sono le opzioni attualmente disponibili 12,14. Dato che questo metodo di riferimento non è un commerciale e approvato dalla FDA metodo diagnostico in vitro, laboratori clinici negli Stati Uniti che utilizzano questa procedura per il test del paziente devono rispettare i requisiti normativi per un test sviluppato in laboratorio (LDT). Si prevede che come l&#39;uso dalbavancina aumenta, più laboratori avranno necessità di testare questo composto. Test Vancomicina come surrogato per la determinazione di dalbavancina sensibilità di S. aureus è stato convalidato 5. Tuttavia, la dalbavancina può essere attiva contro vancomicina intermedio S. aureus (VISA) e, quindi, i medici possono richiedere i risultati dalbavancina MIC. Inoltre, i risultati MIC per altre specie batteriche possono essere richiesti. Il punto di interruzione suscettibile FDA per la dalbavancina contro S. aureus è stato istituito a ≤0.12 mg / ml. FDA assegnato solo suscettibilitàcategoria bile a causa della mancanza di dati sulla isolati resistenti. La distribuzione normale MIC tra wild type S. aureus isolati è tra 0,03-,12 mcg / ml, con una chiara MIC modale di 0,06 mg / ml. Una leggera variazione nei risultati MIC causa della differenza di metodo, oltre alla variazione intrinseca BMD di ± una diluizione, potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo sui tassi di suscettibilità. 6 Simile ad altri agenti lipoglycopeptide, test di sensibilità la dalbavancina può essere difficile a causa solubilità e le dimensioni relativamente grandi della molecola e le sue proprietà di legame 7,8,9. Il metodo BMD riferimento qui descritto comprende due passaggi specifici che sono unici per agenti insolubili e / o agenti lipoglycopeptide: (1) l&#39;uso di DMSO per la preparazione delle soluzioni madre e (2) aggiunta di 0,002% P-80 nel pannello MIC finale diluizioni. L&#39;obiettivo di questa pubblicazione è quello di fornire il video chiarezza al metodo BMD dalbavancina e per SPECIFICHElly concentrarsi su questi passaggi chiave, per garantire risultati accurati e riproducibili MIC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

Test di sensibilità antimicrobica (AST) viene effettuata per valutare l&#39;attività in vitro di agenti antimicrobici contro vari batteri. I risultati AST, che sono espressi come in concentrazioni minime inibenti (MIC) sono utilizzati nella ricerca per lo sviluppo antimicrobica e monitorare lo sviluppo di resistenza e in ambito clinico per l&#39;orientamento terapia antimicrobica. Dalbavancina è un lipoglycopeptide semi-sintetico agente antimicrobico che è stato approvato maggio 2014 dalla Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento delle infezioni della pelle e pelle struttura batteriche acute causate da Gram-positivi. Il vantaggio di dalbavancina rispetto agli attuali terapie anti-stafilococco è la sua lunga emivita, che permette il dosaggio una volta alla settimana. Dalbavancina ha attività contro Staphylococcus aureus (inclusi sia S. aureus [MSSA] e meticillino-resistente Staphylococcus aureus [MRSA] sensibile alla meticillina), stafilococchi coagulasi-negativi, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus gruppo anginosus, β-emolitici streptococchi e vancomicina enterococchi sensibili. Simile ad altri agenti lipoglycopeptide recenti, l&#39;ottimizzazione di CLSI e ISO brodo metodi di test di sensibilità comprende l&#39;uso di dimetilsolfossido (DMSO) come solvente nella preparazione soluzione madre e polisorbato 80 (P80) per alleviare l&#39;adesione dell&#39;agente di plastica. Prima degli studi clinici e durante lo sviluppo iniziale di dalbavancina, studi di sensibilità non sono stati effettuati con l&#39;uso di P-80 e MIC risultati tendevano ad essere 2-4 volte maggiore e similmente superiore MIC risultati sono stati ottenuti con il metodo della diluizione suscettibilità agar. Dalbavancina era prima incluso nell&#39;aggiornamento microdiluizione in brodo CLSI tabelle metodologia nel 2005 e modificato nel 2006 per chiarire l&#39;uso di DMSO e P-80. La procedura di microdiluizione brodo (BMD) mostrato qui è specifico per dalbavancina ed è in conformità con i metodi CLSI e ISO, con particolare step-by-step e focnoi sui passaggi critici aggiunto per chiarezza.

Metodi MIC standardizzati sono necessari al fine di monitorare lo sviluppo di resistenza, un obiettivo importante di vari programmi di sorveglianza antimicrobici. Risultati Dalbavancina MIC per isolati raccolti in Europa e Stati Uniti nel 2011-2013 erano &lt;0,25 mg / ml per il 99,9% di S. aureus e il 100% di streptococchi (tabella 4). Per valutare l&#39;importanza di utilizzare fresca (sigillato) DMSO, test triplicato di MIC dalbavancina BMD per QC ceppi di S. aureus ATCC 29213, ed E. faecalis ATCC 29212 e duplicare test per S. pneumoniae ATCC 49619 è stata effettuata utilizzando (1) DMSO da fiale sigillate, (2) DMSO da una bottiglia 1 L che era entro la data di scadenza ed era stato precedentemente utilizzato per 2 anni e (3) una aliquota di DMSO dallo stesso 1 L bottiglia (campione 2) che è stato permesso di sedere in una coppa aperta per 72 ore prima dell&#39;uso. Dalbavancina risultati MIC con pannelli realizzati con tutti e tre i campioni DMSO erano simili e well&#39;ambito gamme QC accettabili (Tabella 5). La perdita di attività dalbavancina dopo esposizione della soluzione di riserva di plastica e senza l&#39;aggiunta di P-80 è stata ben documentata 7. In 2 ulteriori studi, l&#39;aggiunta di P-80 per le soluzioni madre iniziali e intermedie (Tabella 6) e l&#39;uso di tubi di vetro o di plastica per la preparazione delle soluzioni madre iniziali e intermedie (Tabella 7) non ha avuto effetto sulla i risultati dalbavancina MIC. C&#39;era anche alcun effetto sui risultati MIC dalbavancina quando polipropilene e polistirene piatti provenienti da tre produttori sono stati utilizzati (tabella 7). La presenza di sangue di cavallo lisato nei brodi di collaudo di streptococchi ha dimostrato di avere un&#39;attività tensioattivo simile, paragonabile a P-80 7, 8. Il metodo di riferimento dalbavancina per streptococco include sia P-80 e lisato cavallo sangue ,tuttavia, a differenza di stafilococchi ed enterococchi, risultati dalbavancina MIC per streptococchi sono simili (entro +/- 1 diluizione) con e senza l&#39;aggiunta di P-80. Come è stato precedentemente presentato e illustrato in figura 1, la diluizione dalbavancina agar (AD) microfoni sono tipicamente 2-8 volte superiore rispetto al riferimento di corrente BMD 12, 13, 14. Diversamente BMD, l&#39;aggiunta di 0,002% P-80 non fa influenzare la dalbavancina AD MIC risultati 12. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Equazione 1: Esempio di Dalbavancina soluzione madre Preparazione fasi di preparazione per 25 ml di 800 mg / ml soluzione dalbavancina.. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figura 1. Confronto tra Dalbavancina e Vancomicina BMD a AD. I risultati dello studio che ha confrontato dalbavaNCIN e vancomicina BMD e AD MIC risultati per selezionare isolati batterici Gram-positivi. Media (A) Dalbavancina e (B) Vancomicina microdiluizione in brodo e agar diluizione MIC risultati in mg / ml per 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulasi negativi stafilococchi (CNS), 5 Enterococcus faecalis e 14 Streptococchi (Gruppi A, B, e C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> La </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0.12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td&gt; <td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> Sol </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0.03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0.25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancina </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> Le concentrazioni sono espressi in mg / ml dopo 50 microlitri / pozzetto inoculazione </td></tr></tbody></table> Tabella 1. MIC Piatto Formato. La mostra posizione 96 formato pozzetti di diluizioni Dalbavancina e pozzetti di controllo positivi utilizzato come esempio in questa pubblicazione il video <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Fonte Conc. (mg / ml) </td><td> Volume Fonte (ml) </td><td> Volume DMSO (ml) </td><td> Intermedio Conc. in DMSO (mg / ml) </td><td> Volume Intermedio Conc. (ml) </td><td> Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Dopo diluizione 1: 100 in CAMHB (mg / ml) </td><td> Finale Pannello Conc. Messaggio inoculazione (mg / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 200 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 100 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 12.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 6.25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 &lt;/ td&gt; <td> 0.5 </td><td> 3.13 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 1.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 0.8 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Questa tabella è stata modificata da CLSI M100-S25, Tabella 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Schema per la preparazione in diluizione agenti antimicrobici insolubili in acqua da Usato in brodo diluizione test di suscettibilità. I volumi di soluzioni di lavoro dalbavancina e diluenti per la preparazione di MIC finalesoluzioni Dalbavancina di ,002-2 mg / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Controllo Qualità Strain </td><td> Previsto Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Previsto Dalbavancina MIC Risultati per ceppi di controllo di qualità di 3, 11 risultati dei controlli qualità. CLSI per ceppi suggerite per essere testati con isolati clinici al fine di verificare la corretta metodologia <img alt="Tabella 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabella 4. Distribuzione delle Dalbavancina Risultati MIC (numero ad ogni MIC) da USA ed europea 2011-2013 SurveillANCE Studio 15. Dalbavancina MIC risultati di uno studio pubblicato di recenti isolati clinici come indicatore della dalbavancina corrente attività in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolare # </td><td colspan="3"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = fiamma non aperto sigillato 10 ml fiale </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = bottiglia 1L aperto frequenti </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = bottiglia 1L aperto frequenti - seduto su una panchina nel bicchiere scoperto per 72 ore </td></tr></tbody></table> Tabella 5. Dalbavancina MIC Risultati (mg / ml) con DMSO Archivio e intermedio diluizioni preparazione con DMSO da 3 fonti. I risultati di uno studio che ha confrontato MIC dalbavancina effetto dell&#39;utilizzo di diversi solventi DMSO in preparazione dello stock dalbavancina e diluizioni intermedie. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolare Numero </td><td rowspan="2"> Replicare Numero </td><td colspan="2"> Dalbavancina MIC (mg / ml) </td></tr><tr><td> DALB w / P80 in DMSO </td><td> DALB w / o P80 in DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus DP80-002SA clinica </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700.699 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes clinici: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clinica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clinica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Dalbavancina MIC risultati utilizzando DMSO Archivio e intermedio diluizioni preparazione con e senza 0.002% P-80. I risultati di uno studio che ha confrontato MIC dalbavancina effetto di aggiungere 0.002% P-80 a dalbavancina magazzino e diluizioni intermedie. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isolare </td><td rowspan="3"> Replicare Numero </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Diluizione della Tubi </td><td colspan="4"> Micropiastra (Tipo di plastica) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poly-propilene, Greiner </td><td colspan="3"> Polistirolo </td></tr><tr><td> Bicchiere </td><td> Plastico </td><td> 1 ora di plastica </td><td> 1h Plastica / Intermedio 1 ora </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Vetro = azione iniziale fatta in bottiglia di vetro, utilizzato immediatamente per rendere concentrazione intermedias in tubi di plastica, utilizzati immediatamente per fare diluizioni brodo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastica = stock iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, usato immediatamente per rendere concentrazioni intermedie in tubi di plastica, utilizzate immediatamente per effettuare diluizioni brodo. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 hr plastica = azione iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare concentrazioni intermedie in tubi di plastica, utilizzati immediatamente per fare le concentrazioni in brodo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastica 1 ora / Intermedio 1 hr = azione iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare concentrazioni intermedie in tubi di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare le concentrazioni in brodo. </td></tr></tbody></table> Tabella 7. Dalbavancina MIC risultati utilizzando diluizioni della preparazione in plastica e vetro Tubi e tipi di lastre in plastica MIC. Risultati ofa la dalbavancina studio MIC che ha confrontato effetto dell&#39;utilizzo tubi di plastica o di vetro durante la preparazione le soluzioni madre e anche effetto di utilizzare diverse fonti e tipi di plastica per micropiastre.

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A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Un riferimento brodo di microdiluizione per Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Test della Sensibilità di batteri che crescono aerobico

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.7K Views.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...