The research work presented in this manuscript was supported by a grant (HL107319 to Alan Daugherty and HL107326 to Lisa A. Cassis) from the National Institutes of Health of the United States of America. The content in this manuscript is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The publication of this manuscript was sponsored by DURECT Corporation.

Etica Dichiarazione: studi del mouse vengono eseguiti con l&#39;approvazione della University of Kentucky Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC numero di protocollo: 2006-0009). I topi vengono sacrificati a terminazione utilizzando un sovradosaggio cocktail di ketamina (~ 210 mg / kg) e xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Calcolo del AngII Importo NOTA: Questo protocollo usa l&#39;esempio di infusione di AngII (1.000 ng / kg / min) per 4 settimane a 4 recettore LDL maschio - / - topi alimentati con una dieta ricca di grassi saturi. <ol><li> Pesare studiare topi prima di calcolare la quantità di AngII necessaria per infusione. </li><li> Utilizzare il modello (Tabella 1) per calcolare la massa AngII necessaria per l&#39;esperimento. Utilizzare il &quot;Mean pompaggio Rate&quot; indicato nella Istruzione di pompe come il &quot;tasso di pompaggio&quot; al punto 4 del modello. Nel modello, registrare i passaggi 1-5 manualmente, e Piazza di 6-10 vengono calcolati automaticamente. <ol><li> Nel modello, supporre chetopi guadagnerà 1 g di peso corporeo durante l&#39;infusione di AngII 1.000 ng / kg / min per 4 settimane. NOTA: Ogni topo può avere molto diverso peso corporeo che dipenderà da molte variabili, come il ceppo di topi e la dieta. Usiamo abitualmente &quot;0&quot; o &quot;1 g&quot; sulla base della nostra esperienza da studi precedenti. </li><li> Calcolare un volume totale di 300 ml di soluzione di AngII per ogni mouse dal momento che ogni pompa richiede circa 250 ml. </li></ol></li></ol> 2. Scioglimento AngII <ol><li> Conservare liofilizzato fiale Angii a -20 ° C. Equilibrare le fiale Angii a RT prima dell&#39;apertura. </li><li> Pesare la massa calcolata AngII (7,3 mg come mostrato in tabella 1) in un tubo di plastica sterile. NOTA: Per Merck Index, non usare tubi di vetro per la dissoluzione da una soluzione acquosa di AngII ha una forte affinità per il legame al vetro. </li><li> Aggiungere il volume calcolato di soluzione fisiologica sterile (1.200 μl) nel tubo di plastica contenente il liofilizzato AngII, berretto, e mescolare bene per inversione fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Numeri del mouse etichetta # 1, # 2, # 3, # 4 e sui singoli tubi di plastica sterili con tappo (0,5 - 1,5 ml). Preparare la soluzione AngII sotto cappa laminare per ogni mouse sulla base del peso corporeo come calcolato nel passo 1.2 e Tabella 1. <ol><li> Per esempio, pipettare 3,6 ml di soluzione salina sterile nella provetta # 1, poi 296,4 ml soluzione AngII, e mescolare bene pipettando su e giù delicatamente. </li></ol></li><li> Numeri del mouse Etichetta su tubi di plastica con tappi (4 ml, sterili). Questi saranno utilizzati per l&#39;incubazione di pompe come descritto nel punto 3.13. </li></ol> 3. La pompa osmotica Riempimento <ol><li> Ottenere pompe in due parti distinte: il corpo principale della pompa e il moderatore flusso (Figura 1). Ogni scatola ha 10 corpi pompa e moderatori di flusso che vengono avvolti singolarmente. Registrare il numero di lotto. NOTA: Indossare sempreguanti perché gli oli trasferiti dalle mani alla carcassa esterna di pompe possano influire negativamente la funzione di pompaggio. Utilizzare guanti sterili, garze, tubi, aghi di riempimento, e pesare le barche per preparare le pompe, per evitare il rischio di infezione dall&#39;impianto. </li><li> Aprire solo il numero di corpi pompa e moderatori flusso necessari per lo studio, in quanto questi non possono essere memorizzati una volta aperti. Se sono necessari più di 10 pompe, in modo che i numeri di lotto delle pompe sono gli stessi per uno studio, dal momento che le pompe di lotti differenti hanno differenti volume di riempimento medio e pompa Rate. </li><li> Pesare ogni pompa (che comprende sia il corpo principale e il flusso moderatore), e prendere nota del peso di 4 cifre decimali (ad esempio, 1,1443 g di mouse # 1). Questo peso, denominato &quot;Pump Peso vuoto&quot; nel modello (Tabella 1), viene utilizzato per calcolare il rapporto pieno. </li><li> Applicare l&#39;ago di riempimento pompa per un 1 cc siringa sterile e compilare accuratamente la siringa con la soluzione AngII dal modo appropriatonumerato tubo di plastica. È importante evitare aspirando aria nella siringa. </li><li> Rimuovere tutte le bolle d&#39;aria con attenzione dalla siringa mentre l&#39;ago è posizionato verso il basso. Tenere l&#39;ago / siringa in questa posizione per impedire l&#39;introduzione di bolle nella pompa. </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago riempimento nel corpo della pompa. Fare avanzare la punta dell&#39;ago nella pompa. Non appoggiare la punta dell&#39;ago saldamente sul fondo della pompa. </li><li> Spingere lo stantuffo della siringa lentamente per riempire la pompa con la soluzione AngII. Un&#39;ombra scura all&#39;interno della pompa indica il livello di riempimento. Il volume di riempimento è di circa 246 ml, secondo le istruzioni. </li><li> Arrestare riempimento della pompa ed eliminare accuratamente l&#39;ago non appena una goccia di liquido aumenta dalla pompa. </li><li> Inserire flusso moderatore nella pompa attraverso il foro sulla parte superiore del corpo della pompa fino a quando non si vede gap tra la testa del moderatore flusso e la parte superiore del corpo pompa (Figura 1). </li><li> Inserimento di moderato nel corpo pompa porta a qualche liquido fuoriuscito dall&#39;apertura del moderatore flusso. Cancella accuratamente tutto il liquido in più che avrebbe potuto trapelato durante il posizionamento di moderatori. </li><li> Pesare pompa riempita. Registrare il peso sotto &quot;Pump Peso riempito&quot; nel modello. </li><li> Calcolare il grado di riempimento (%) = (Pump peso &quot;pieno&quot; - &quot;vuoto&quot;) x 1.000 / dire volume di riempimento x 100. <ol><li> Calcolare riempimento Rapporto come indicato nella tabella 1. Idealmente, il grado di riempimento deve essere uguale o superiore a 100%. Pompa refill se il rapporto di riempimento è &lt;95% (comportando un bolle d&#39;aria che può essere presente in pompa). </li></ol></li><li> Mettere pompa riempita nel etichettato 4 ml di tubo (passo 2.5) con la testa rivolta verso l&#39;alto moderatore. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione salina sterile per coprire la pompa. Tenere la pompa in tubo di soluzione fisiologica fino impianto. </li><li> Porre le provette in un incubatore 37 ° C. Pompe Incubare O / N (almeno 12 ore) per consentire priming parziali, e poi impiantare in topi. Pompazione di AngII inizia circa 24 ore dopo l&#39;impianto, che consente ai topi per recuperare da un intervento chirurgico prima di qualsiasi stress potenziale derivante durante AngII infusione. </li></ol> 4. Preparazione per Pompa impianto <ol><li> Autoclave (modalità gravità, ciclo di asciugatura, 15 min) garze, tamponi di cotone e strumenti chirurgici, tra cui forbici, emostatico, forcipe, punti metallici e spillatrice almeno 1 giorno prima dell&#39;intervento. </li><li> In una stanza procedura, preparare vaporizzatore per l&#39;anestesia con isoflurano. Aprire teli sterili in una cappa a flusso laminare, e posizionare ogiva per l&#39;anestesia isoflurano. Mettere betadine, il 70% di etanolo, acqua sterile, perlina sterilizzatore, frizione delle mani antisettico, tamponi, garze, e le pompe riempiti in una cappa laminare. </li><li> Don una maschera e abito, quindi aprire un drappo esterna in una cappa laminare con le mani pulite. Indossare guanti sterili e aprire la confezione interna sterile. </li></ol> 5. Procedura chirurgica di pompa impianto <ol><li> Posto del mouse in un cham ad induzioneber con afflusso di isoflurano ad un flusso di 1.5 - 2%. Monitorare il mouse per altri 2-3 minuti dopo decubito. Shave un&#39;area delle dimensioni di un quarto, sulla spalla sinistra oa destra. </li><li> Posizionare il mouse in una cappa laminare, con il naso a filo con un cono collegato a deflusso isoflurano (Figura 2A). Posizionare la testa del topo verso mano dominante del chirurgo. Usare pomata veterinario sugli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Assicurarsi che il mouse ha alcuna risposta alla stimolazione del dolore prima dell&#39;intervento. Ad esempio, la risposta del pedale è un buon indicatore per il dolore. </li><li> Tampone e pulire zona rasata con betadine seguita da tre salviette con il 70% di etanolo. Don o cambiare i guanti sterili. </li><li> Utilizzare un bisturi chirurgico per effettuare una ~ 1 cm un&#39;incisione dietro l&#39;orecchio sopra la scapola della gamba anteriore. Questa incisione dovrebbe essere perpendicolare alla coda. Prestare attenzione per tagliare i tessuti solo la pelle e non sottostante. </li><li> Tenere forceps in una mano per aprire incisione, e utilizzare l&#39;altra mano per fare un tunnel sottocutaneo sotto la pelle utilizzando un emostatico (Figura 2B). </li><li> Anticipo punta emostatico verso la coda, e creare una tasca per la pompa. Questo si ottiene aprendo attentamente le ganasce della pinza emostatica sotto la pelle per aprire un sacchetto. Ritirare il hemostat da incisione. </li><li> Inserire la pompa nella incisione con la testa moderatore posizionata verso la parte posteriore del mouse (Figura 2C). Spingere delicatamente la pompa completamente in tasca. Ci dovrebbe essere spazio sufficiente per chiudere la ferita senza tensione o stiramento della pelle. </li><li> Una volta che una pompa è stata inserita, pizzicare saldamente entrambi i lati dell&#39;incisione, raddrizzando modo che i bordi si incontrano, e inserire 1 o 2 clip ferita per chiudere (Figura 2D). Controllare il sito di incisione per garantire che non vi è completa chiusura della ferita, e che la pompa non è premendo direttamente sul sito. </li><li> Applicare la crema lidocaina topica(4% in peso / peso) con un mouse di cotone swab.Remove pulita dal cono di naso, e posizionarlo su una piastra elettrica fino a quando non riprende conoscenza. Dopo il recupero, il mouse viene riportata alla sua gabbia. </li><li> Mettere strumenti chirurgici in uno sterilizzatore tallone per 10 secondi tra i topi. Lasciare strumenti raffreddare prima dell&#39;uso. Guanti puliti con frizione con prodotto antisettico tra i topi. Monitorare tutti i mouse fino a raggiungere il pieno recupero. </li><li> Monitorare topi da vicino dopo l&#39;intervento chirurgico. Iniettare un bolo di soluzione fisiologica sterile (0,2 - 0,3 ml) per via sottocutanea se un topo mostra segni di sofferenza, disidratazione o perdita di peso apparente. Osservare topi almeno due volte al giorno per i primi 10 giorni, e almeno una volta al giorno successivamente. Eseguire immediatamente una necroscopia se eventuali topi muoiono durante AngII infusione. Rimuovere clip ferita tra 7 - 14 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 6. Fare la raccolta, Riparazione, secco, e imaging di aorte <ol><li> Tagliare aprire il torace del mouse e cavità addominale ventrale, taglio open atrio destro, defluire in con soluzione fisiologica attraverso ventricolo sinistro del cuore per rimuovere il sangue nell&#39;aorta, e quindi raccogliere l&#39;aorta 27. </li><li> Mettere aorte raccolte in provette di plastica contenenti almeno 3 ml di paraformaldeide al 4% o al 10% di formalina neutra tamponata per 24-48 ore 27. </li><li> Rimuovere accuratamente i tessuti avventiziali. Aorta perno su cera nera con degli spilli. Acquisire immagini aortica con lo stesso ingrandimento. Include un righello in ciascuna immagine per la calibrazione, come mostrato nella figura 3. </li></ol> 7. En face Imaging di aortas <ol><li> Tagliare dell&#39;aorta aperta longitudinalmente attraverso la curvatura esterna ed interna di arco aortico, e tagliare rami principali aperte, tra cui anonima, sinistra carotide e succlavia sinistra. Pin dell&#39;aorta appartamento con avventiziale esterno posa accanto alla cera nera. </li><li> Acquisire it quadro volto della superficie intimale dell&#39;aorta allo stesso ingrandimento. Includere un righello in ogni immagine per la calibrazione, come spettacolon in figura 4. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+AT2+receptors+augments+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysms+and+atherosclerosis.">Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis.</a> Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+receptor-associated+protein+attenuates+angiotensin+II-induced+atherosclerosis+in+hypercholesterolemic+mice+without+influencing+abdominal+aortic+aneurysms.">Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms.</a> Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).</li><li>Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording,+a+tail-cuff+method.">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> J Vis Exp. (27), e1291 (2009).</li></ol>

La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Alzet.

Pompe osmotiche offrendo AngII sottocutanea è un approccio di routine per indurre aneurismi aortici nei topi. Sulla base dei dati provenienti da molti laboratori, ci sono state scoperte coerenti che questo è un metodo affidabile e riproducibile per studiare sia AAAs 3,4 e TAA 22-26 nei topi. Pertanto, questo modello di topo è considerato un modello che riassume molte caratteristiche di aneurismi aortici umani e fornisce approfondimenti meccanicistici in queste malattie devastanti. Mentre l&#39;invecchiamento è un fattore di rischio per AAA negli esseri umani, non è stato sistematicamente studiata per AAA AngII-indotta nei topi. Tuttavia, sembra incidenza e la gravità di AAA AngII-indotti sono simili nei topi all&#39;età di 8 - 48 settimane 4,5,7. Attualmente, ci sono solo pochi studi che riportano TAA AngII-indotta nei topi all&#39;età di 8 - 24 settimane 22-26, che non presentavano differenze correlati all&#39;età sulla formazione TAA. Topi di sesso femminile hanno una molto più bassa incidenza di AAA di topi maschi infuso con AngII 4,28. Vale anche la pena notare che l&#39;incidenza di AngII indotta AAA è molto più alto rispetto ai topi in iper normo-cholesterolemic, che è oltre il 50% rispetto a meno del 30%, rispettivamente. Inoltre, la rottura aortica è frequente (circa 10 - 30%) sia in topi normo- e ipercolesterolemici durante AngII infusione. L&#39;infusione di AngII ad una velocità di 1.000 ng / kg / min in topi ipercolesterolemici, come recettore LDL - / - mice nutriti con una dieta occidentale o apolipoproteina (apoE) - / - mice nutriti con una dieta normale o occidentale, ha effetti massimi su AAA sviluppo 3,4,29. Questa velocità di infusione è ottimale per uno studio in cui la manipolazione di un gene di interesse nei topi ipercolesterolemici si prevede di ridurre AAA. Se una manipolazione nei topi ipercolesterolemici dovrebbe aumentare AAA, si raccomanda di infusione AngII ad una velocità di 500 ng / kg / min o inferiore 30. In contrasto AAAs, non c&#39;è demonstrated associazione tra genere maschile o ipercolesterolemia e AngII indotta TAA 25. Tuttavia, analogamente a AAA, se la manipolazione di un gene di interesse è previsto per aumentare TAA, si consiglia una velocità di infusione inferiore a 1.000 ng / kg / min per AngII infusione. E &#39;anche importante sapere che incidenza e la gravità degli aneurismi dell&#39;aorta AngII-indotti variano tra i singoli topi e tra gli studi. Se i topi non sviluppano aneurismi aortici, una potenziale possibilità è che AngII potrebbe non essere stato consegnato con successo in topi. Per la convalida di infusione ad una velocità elevata di AngII, ad esempio 1.000 ng / kg / min, la misurazione della pressione sanguigna è raccomandato prima e durante l&#39;infusione AngII utilizzando un metodo tail-polsino non invasivo 31. AngII infusione ad una velocità di 1,000 ng / kg / min aumenta la pressione sanguigna sistolica nei topi. Inoltre, le concentrazioni plasmatiche possono essere renina misurati durante AngII infusione o in cessazione dal AngII ha un feedback negativo su rsecrezione enin. Pertanto, AngII infusione porta ad una diminuzione della concentrazione di renina nel plasma. Se un mouse infuso con AngII non ha patologie apparenti aortici, nessun aumento della pressione sanguigna, e nessuna diminuzione della concentrazione della renina plasmatica, indicherebbe che AngII non è stato consegnato in modo efficiente attraverso il mini-pompa osmotica impiantato. Consigliamo di rimuovere questo mouse dallo studio. E &#39;anche importante notare che alcuni topi non sviluppano aneurismi aortici, nonostante un aumento della pressione sanguigna sistolica e una diminuzione della concentrazione plasmatici di renina. Questi topi devono rimanere nello studio. In sintesi, AngII infusione si ottiene impianto sottocutaneo utilizzando pompe osmotiche per indurre aneurismi aortici nei topi. Questo metodo offre AngII costantemente ad un tasso definito per durate designati che vengono utilizzati per studiare sia AAA e TAA.

Aneurismi aortici mostrano espansione luminale permanente dell&#39;aorta che fa presagire la rottura e di solito porta alla morte. Questa malattia si verifica in entrambe le regioni dell&#39;aorta addominale e toracica, che sono definiti come aneurismi dell&#39;aorta addominale (AAA) e aneurismi dell&#39;aorta toracica (TAA), rispettivamente. A causa di una comprensione incompleta dei meccanismi molecolari e processi patofisiologici, non esiste una terapia medica provata che può impedire l&#39;espansione o la rottura di entrambi i tipi di aneurismi aortici. Poiché è difficile acquisire campioni ed effettuare esperimenti in esseri umani direttamente, ricerca incentrata sulla definizione di meccanismi AAAs è stato frequentemente estrapolata da modelli animali. Un modello animale comunemente usato è l&#39;infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII) in topi. Rispetto ad altri approcci chirurgici per indurre AAA nei topi, come intra-aortica perfusione elastase o applicazione peri-aortici di cloruro di calcio che richiedono laparotomia 1,2, questo metod non richiede l&#39;immissione nella cavità del corpo e richiede competenze chirurgica minima 3,4. Infusione sottocutanea di AngII attraverso pompe osmotiche per indurre AAA è stato inizialmente segnalato in bassa densità-lipoproteine ​​(LDL) del recettore - / - topi nutriti un grasso arricchito dieta satura 3, e successivamente in apoE - / - mice nutriti con una dieta normale di laboratorio 4. Molti studi recenti hanno inoltre dimostrato che AngII induce AAA nei topi normolipidemici 5-7. L&#39;approccio di infondere AngII è stato applicato per indurre AAA ed esplorare meccanismi molecolari, nonché lo sviluppo di potenziali strategie terapeutiche (ad esempio, 5-15), in quanto questo modello riassume molte caratteristiche osservate in AAA umani. Ad esempio, i fattori di rischio di AAA umane quali il fumo, l&#39;invecchiamento, e il sesso maschile anche aumentano AAA AngII-indotta nei topi 16,17. L&#39;associazione di ipercolesterolemia con AAA negli esseri umani richiede un chiarimento. Tuttavia, ha essereit coerente che ipercolesterolemia aumenta AngII-indotta nei topi AAA 18. Patologie di AAA AngII indotte nei topi sono molto eterogenea e sono caratterizzati da una profonda infiltrazione di macrofagi, degradazione del collagene, la formazione trombotica e la risoluzione, e neovascolarizzazione 19-21. In contrasto con la posizione aortica infrarenale più comune di AAAs nell&#39;uomo, AngII indotta nei topi AAAs verificano nella regione aortica surrenale. Un&#39;altra caratteristica onnipresente di AngII indotta AAA è la rottura mediale transmurale, che porta alla trombosi transmurale. Non è chiaro se la rottura transmurale elastina si verifica negli esseri umani in quanto lo sviluppo patologico di AAA negli esseri umani non è stato studiato esclusivamente per mancanza di tessuti aneurismatiche da fasi precedenti. AngII infusione in topi porta anche ad una profonda espansione della regione aortica toracica, che è prevalentemente limitato alla aorta ascendente, che è la regione più comune per TAA nell&#39;uomo <sup&gt; 19,22-26. Simile a AAA AngII-indotta, TAA indotto durante AngII infusione anche ricapitolare molte caratteristiche di umana TAA 25. Tuttavia, a differenza di AAA AngII-indotta, TAA AngII-indotta non sono associati con ipercolesterolemia e non hanno differenze di genere. L&#39;obiettivo generale di infusione sottocutanea AngII in topi è quello di studiare le caratteristiche patologiche e meccanismi molecolari di AAA e TAA.

<table><tbody><tr><td>Angiotensin II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>compound used to induce aortic aneurysms</td></tr><tr><td>Alzet Osmotic Pumps</td><td>DURECT Corporation</td><td>Alzet Model 2004</td><td>feasible for 28-day infusion in mice weighed &gt; 20 g</td></tr><tr><td>Saturated fat-enriched diet</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice</td></tr></tbody></table>

subcutaneous angiotensin ii infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Le 4 del recettore LDL maschio - / - mice descritti nella sezione protocollo sono stati sacrificati dopo 4 settimane di AngII infusione. Aorte sono state raccolte, pulite, e ripreso visualizzare dilatazioni aortiche. Come mostrato in figura 3, aorte hanno diverse caratteristiche diverse tra cui l&#39;espansione della regione surrenale (AAA, Figura 3A), l&#39;espansione della regione ascendente (TAA; Figura 3B), o l&#39;espansione di entrambe le regioni (presenza di entrambi AAA e TAA; Figura 3C), mentre la morfologia di un mouse sono abbondantemente normale (Figura 3D). Dilatazione dell&#39;aorta addominale viene quantificato misurando la larghezza massima ex vivo della regione surrenale, come illustrato dalla linea rossa nella Figura 3A. Per misurare la dilatazione dell&#39;aorta ascendente, aorte veniva aperto e riposte, come mostrato nella Figura 4. Superficie intimale è stata misurata nella regione aortica ascendente (zona circondata da thlinee rosse e nella Figura 4A) per quantificare TAA. Un righello è stato incluso in ogni immagine di standardizzare le misurazioni, come mostrato in entrambe le figure 3 e 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . Figura 1. Immagine rappresentativa della pompa osmotica pieno Ogni pompa contiene due parti separate: un corpo principale e un moderatore di flusso. Dopo aver riempito il corpo pompa con AngII, il moderatore portata è inserito per sigillare la pompa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> Figura 2. Processo di chirurgia pompa impianto (A) del mouse viene posizionato in una cappa laminare con un cono che è continuamente rilasciando isoflurano e ossigeno.; (B) un emostatico diritta viene inserito nella incisione cutanea per fare un tunnel sottocutaneo; (C) La pompa è inserito attraverso la<html> incisione cutanea delicatamente; (D) L&#39;incisione cutanea viene pinzato dopo l&#39;inserimento della pompa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> Figura 3. immagini aortica (ex vivo) da topi infusi con AngII AngII 1.000 ng / kg / min è stato infuso in recettore LDL maschio -. / - Mice per 28 giorni. (A) AAA accompagnata da trombosi; Linea rossa (2.05 mm) mostra la misura della larghezza massima aortica nella regione surrenale. (B) Ascendente dilatazione aortica (TAA) con grossolanamente normale dell&#39;aorta addominale; (C) dilatazioni profonde sia ascendente e surrenali regioni aortici (TAA e AAAS); (D) dell&#39;aorta grossolanamente normale senza dilatazione apparente di crescente o soprarenale regione aortica. 4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. En immagini di volti di regioni dell&#39;aorta toracica da topi infusi con AngII Angii 1.000 ng / kg / min è stato infuso in recettore LDL maschio -. / - Topi per 28 giorni. Superficie delineata da una linea rossa rappresenta la regione aortica ascendente compreso parte dell&#39;arco aortico. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> Dose richiesta </td><td></td><td> 1.000 </td><td colspan="2"> ng / kg / min </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> Inizia il peso corporeo (il più grande del mouse) </td><td> 24.8 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Totale stimato del peso corporeo </td><td> 1 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> Tasso di pompaggio </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> pl / h </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Number di topi </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="2"> Dose per ora per animali </td><td></td><td> 1518 </td><td> ng </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Conc necessario </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> ng / ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> Per 300 la soluzione ul </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> mg / 300 ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> SOLUZIONE NECESSARIO </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> Totale AngII (mg) </td><td></td><td> 7.3 </td><td> mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="2"> Disciolto in soluzione salina &amp;# 160; </td><td></td><td> 1.200 </td><td> pl </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Topo </td><td> Peso corporeo </td><td> Fattore di diluizione </td><td colspan="2"> Volume (ml) </td><td colspan="2"> Pompa Peso (g) </td><td> Rapporto Riempito </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salino </td><td> Vuoto </td><td> Pieno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263,7 </td><td> 36.3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Fattore di diluizione = peso corporeo del peso del mouse / corpo del grande topo </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Topo </td><td> Peso corporeo </td><td> Fattore di diluizione </td><td colspan="2"> Volume (ml) </td><td colspan="2"> Pompa Peso (g) </td><td> Rapporto Riempito </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Salino </td><td> Vuoto </td><td> Pieno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296,4 </td><td> 3.6 </td><td> 1,1443 </td><td> 1,3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1,1677 </td><td> 1,4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263,7 </td><td> 36.3 </td><td> 1,1438 </td><td> 1,3904 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Calcolo per 28 giorni infusione tramite pompe osmotiche.

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Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Impianto sottocutaneo di pompe osmotiche fornisce un modo conveniente per la consegna prolungata e costante di composti. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per lo studio sia aneurismi dell&#39;aorta addominale e toracica nei topi.

Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

37.1K Views.  University of Kentucky.  Impianto sottocutaneo di pompe osmotiche fornisce un modo conveniente per la consegna prolungata e costante di composti. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per lo studio sia aneurismi dell'aorta addominale e toracica nei topi. 

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been widely used to measure aortic dimensions in mouse models of aortic aneurysms. Aortic aneurysms are defined as permanent dilations of the aorta, which occur most frequently in the ascending and abdominal regions. Sequential measurements of aortic dimensions by ultrasound are the principal approach for assessing the development and progression of aortic aneurysms in vivo. Although many reported studies used ultrasound imaging to measure aortic diameters as a primary endpoint, there are confounding factors, such as probe position and cardiac cycle, that may impact the accuracy of data acquisition, analysis, and interpretation. The purpose of this protocol is to provide a practical guide on the use of ultrasound to measure the aortic diameter in a reliable and reproducible manner. This protocol introduces the preparation of mice and instruments, the acquisition of appropriate ultrasound images, and data analysis.

Ultrasound imaging has become a common modality to determine the luminal dimensions of thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice. This protocol describes the procedure to acquire reliable and reproducible two-dimensional ultrasound images of the ascending and abdominal aorta in mice.

Formazione immagine di ultrasuono dell'Aorta toracica ed addominale in topi per determinare le dimensioni di Aneurysm

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been ...

Medicina

Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm

According to the Center for Disease Control, aortic aneurysms (AAs) were considered a leading cause of death in all races and both sexes from 1999-2016. An aneurysm forms as a result of progressive weakening and eventual dilation of the aorta, which can rupture or tear once it reaches a critical diameter. Aneurysms of the descending aorta in the chest, called descending thoracic aortic aneurysms (dTAA), make up a large proportion of aneurysm cases in the United States. Uncontained dTAA rupture is almost universally lethal, and elective repair has a high rate of morbidity and mortality. The purpose of our model is to study dTAA specifically, to elucidate the pathophysiology of dTAA and to search for molecular targets to halt the growth or reduce the size of dTAA. By having a murine model to study thoracic pathology precisely, targeted therapies can be developed to specifically test dTAA. The method is based on the placement of porcine pancreatic elastase (PPE) directly on the outer murine aortic wall after surgical exposure. This creates a destructive and inflammatory reaction, which weakens the aortic wall and allows for aneurysm formation over weeks to months. Though murine models possess limitations, our dTAA model produces robust aneurysms of predictable size. Furthermore, this model can be used to test genetic and pharmaceutical targets which may arrest dTAA growth or prevent rupture. In human patients, interventions such as these could help avoid aneurysm rupture, and difficult surgical intervention.

We describe a surgical protocol to consistently induce robust descending thoracic aortic aneurysms in mice. The procedure involves left thoracotomy, thoracic aorta exposure, and placement of a sponge soaked in porcine pancreatic elastase on the aortic wall.

Modello chirurgico murine dell'elastasi topica indotta decrescente all'aneurtica toracica

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Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the regulatory mechanism of RDN on hypertension remains elusive. Thus, it&#39;s essential to establish a simpler RDN model in mice. In this study, osmotic mini pumps filled with Angiotensin II were implanted in 14-week-old C57BL/6 mice. One week after the implantation of the mini-osmotic pump, a modified RDN procedure was performed on bilateral renal arteries of the mice using phenol. Age-sex-matched mice were given saline and served as sham group. Blood pressure was measured at baseline and every week subsequently for 21 days. Then, renal artery, abdominal aorta and heart were collected for histological examination using H&#38;E and Masson staining. In this study, we present a simple, practical, repeatable, and standardized RDN model, which can control hypertension and alleviate cardiac hypertrophy. The technique can denervate peripheral renal sympathetic nerves without renal artery damage. Compared to previous models, the modified RDN facilitates the study of the pathobiology and pathophysiology of hypertension.

Here, we present a protocol for renal sympathetic denervation (RDN) in mice with hypertension induced by Angiotensin II infusion. The procedure is repeatable, convenient and allows to study the regulatory mechanisms of RDN on hypertension and cardiac hypertrophy.

Miglioramento della denervazione renale ha attenuato l'ipertensione indotta dall'infusione di angiotensina II

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse models, are applied to advance the understanding of the disease pathogenesis and to identify potential therapeutic targets. Testing novel drug candidates to block AAA growth in these models generally requires repeated drug administration during the time course of the experiment. Here, we describe a compiled protocol for AAA induction, insertion of an intravenous catheter to facilitate prolonged therapy, and serial AAA monitoring by 3D ultrasound. Aneurysms are induced in apolipoprotein E (ApoE) deficient mice by angiotensin II release over 28 days from osmotic mini-pumps implanted subcutaneously into the mouse back. Subsequently, the surgical procedure for external jugular vein catheterization is conducted to allow for daily intravenous drug treatment or repeated blood sampling via a subcutaneous vascular access button. Despite the two dorsal implants, the monitoring of AAA development is readily facilitated by sequential semi-automated 3D ultrasound analysis, which yields comprehensive information on the expansion of aortic diameter and volume and on aneurysm morphology, as illustrated by experimental examples.

This protocol describes the consecutive implantation of an osmotic pump to induce abdominal aortic aneurysm by angiotensin II release in apolipoprotein E (ApoE) deficient mice and of a vascular access port with a jugular vein catheter for repeated drug treatment. Monitoring of aneurysm development by 3D ultrasound is effectively conducted despite dorsal implants.

Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

<meta charset="utf8"></head><body>Indagine sui meccanismi molecolari alla base dell'aneurisma dell'aorta addominale murina

A Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model by Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration

Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening disease associated with high mortality rates. It is characterized by the permanent dilation of the abdominal aorta with at least a 50% increase in arterial diameter. Various animal models of AAA have been introduced to mimic the pathophysiological changes and study the underlying mechanisms of AAA. Among these models, the calcium chloride (CaCl2)- and elastase-induced AAA models are commonly used in mice. However, these methods have certain limitations. Traditional intraluminal porcine pancreatic elastase (PPE) perfusion is associated with high technical difficulty and a high rupture rate, while periadventitial administration of PPE yields inconsistent results. In addition, the CaCl2-induced AAA model lacks human AAA features, such as atherothrombosis and aneurysm rupture. Therefore, the combined application of CaCl2 and PPE has been proposed as an approach to enhance success rates and induce greater diameter increases in AAA animal models. This manuscript presents a comprehensive protocol for establishing a mouse AAA model through periaortic infiltration of PPE and CaCl2 in the infrarenal segment of the abdominal aorta. By following this protocol, we can achieve an AAA formation rate of approximately 90% with technical simplicity and reproducibility. Further ultrasound and histological experiments confirm that this model effectively replicates the morphological and pathological changes observed in human AAA.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Sviluppo e caratterizzazione di un modello murino per l'aneurisma dell'aorta addominale

This manuscript presents a protocol for establishing a mouse abdominal aortic aneurysm model using calcium chloride and elastase, combining the advantages of previous modeling methods. This model can be utilized to investigate the pathophysiological mechanisms underlying abdominal aortic aneurysms.

Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening disease associated with high mortality rates. It is characterized by the permanent dilation of the ...

Surgically Induced Cardiac Volume Overload by Aortic Regurgitation in Mouse

Aortic regurgitation (AR) is a common valvular heart disease that exerts volume overload on the heart and represents a global public health problem. Although mice are widely applied to shed light on the mechanisms of cardiovascular disease, mouse models of AR, especially those induced by surgery, are still paucity. Here, a mouse model of AR was described in detail which is surgically induced by disruption of the aortic valves under high-resolution echocardiography. In accordance with regurgitated blood flow, AR mouse hearts present a distinctive and clinically relevant volume overload phenotype, which is characterized by eccentric hypertrophy and cardiac dysfunction, as evidenced by echocardiographic and invasive hemodynamic evaluation. Our proposal, in a reliable and reproducible manner, provides a practical guide on the establishment and assessment of a mouse model of AR for future studies on molecular mechanisms and therapeutic targets of volume overload cardiomyopathy.

<meta charset="utf8"></head><body>Sovraccarico di volume cardiaco indotto chirurgicamente mediante rigurgito aortico nel topo

This protocol presents a practical guide on the surgery for creation of aortic regurgitation (AR) in the mouse. Assessment of the AR mouse by echocardiography and invasive hemodynamic measurement recapitulates its clinically relevant characteristics of volume overload-induced eccentric hypertrophy, suggesting its promising application in the study of cardiac hypertrophy.

Sovraccarico di volume cardiaco indotto chirurgicamente mediante rigurgito aortico nel topo

Aortic regurgitation (AR) is a common valvular heart disease that exerts volume overload on the heart and represents a global public health problem. ...

Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Formazione immagine di ultrasuono dell'Aorta toracica ed addominale in topi per determinare le dimensioni di Aneurysm

Modello chirurgico murine dell'elastasi topica indotta decrescente all'aneurtica toracica

Miglioramento della denervazione renale ha attenuato l'ipertensione indotta dall'infusione di angiotensina II

Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D

Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale mediante cloruro di calcio periavventiziale e infiltrazione di elastasi

Sovraccarico di volume cardiaco indotto chirurgicamente mediante rigurgito aortico nel topo

Sovraccarico di volume cardiaco indotto chirurgicamente mediante rigurgito aortico nel topo