This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

1. In vitro: Individuare SERCaMP uscita da una linea cellulare SH-SY5Y stabile <ol><li> Piastra SH-SY5Y-GLUC-ASARTDL (SERCaMP) in coltura trattata piastre a 150.000 cellule per cm 2 di superficie. Per piastre da 96 pozzetti, per esempio, seme 50.000 cellule per pozzetto (Figura 1A). Crescere cellule SH-SY5Y in DMEM (alto glucosio, Glutamax, piruvato) + 10% della crescita bovina di siero + 1x penicillina / streptomicina. <ol><li> Cellule Passage fino a 15 volte (Figura 1B). Numero più elevato passaggio non è stato testato. </li><li> Ritorno a cellule incubatore umidificato a 37 ° C con 5,5% di CO 2 e incubare durante la notte. </li></ol></li><li> Prima del trattamento sperimentale (s), raccogliere un campione di riferimento per ciascun pozzetto con il trasferimento di 5 ml di cultura surnatante in un opaco murato 96 pozzetti. Prima di raccogliere, picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati e agitare per evitare effetti di sfumatura. Sigillare la piastra opaca con un adesivo sfoglio di Ealing e conservare a 4 ° C fino al momento del test enzimatico. Nota: Secreted GLUC-SERCaMP è molto stabile nel terreno di coltura. Abbiamo precedentemente riportato circa il 5-10% di attività Gluc è stato perso dopo una incubazione 72 ore a 37 ° C (incubato sulle cellule SH-SY5Y) 12. </li><li> Il trattamento di cellule, se lo desideri esaminare ER calcio esaurimento (ad esempio ambientale, farmacologico, manipolazioni genetiche). Evitare l&#39;esposizione a lungo condizioni ambientali (al di fuori dell&#39;incubatore controllata) come variazioni di pH sarà rapidamente verificarsi in CO 2 atmosferica. Aggiungere HEPES al mezzo di coltura a 20 mM, per stabilizzare il pH 14, se sono necessarie manipolazioni prolungate. Evitare l&#39;esposizione alla luce durante l&#39;utilizzo HEPES in terreno di coltura 15. <ol><li> Controllo positivo: Trattare cellule con 100 tapsigargina nM (Tg) o 50 mM acido ciclopiazonico (CPA) per 4-6 ore per esperimenti in cellule SH-SY5Y. Risposta massima in altre linee cellulari possono richiedere incubazione più lunghi o diverso concenstrazioni di composti. </li><li> Controllo negativo: terreno di coltura Raccogliere da cellule SH-SY5Y parentali. Nella nostra esperienza, la luminescenza di fondo per questo dosaggio è inferiore al 0,05% della secrezione basale di cellule stabili SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP. </li></ol></li><li> Raccogliere e campioni negozio 5 microlitri di media condizionata al timepoints desiderati, come indicato al punto 1.2. </li><li> Valutare l&#39;attività enzimatica nel medio come indicato nella Sezione 5. </li><li> Esaminare GLUC intracellulare da immunoblot o dosaggio luminescenza. <ol><li> Per immunoblot: cellule in tampone RIPA Lisare modificato contenente Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,25% sodio desossicolato, 1 mM EDTA, 1% NP40, e inibitori della proteasi. Separato su gel di SDS-poliacrilammide e trasferimento a membrana PVDF 0.20 micron. Incubare a membrana con GLUC anticorpi (1: 2.000 diluizione) notte a 4 ° C. Eseguire incubazione anticorpi e membrana lavaggi secondarie come da protocollo definito dall&#39;utente per reagente rilevamento di scelta. </li><li> Perluminescenza test (Figura 2): eseguire le seguenti operazioni sul ghiaccio: <ol><li> Rimuovere tutti i media da pozzetti della piastra di coltura tissutale e risciacquare con 200 ml di PBS freddo. </li><li> Aggiungere 75 ml di tampone di lisi contenente Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% NP40 e inibitori della proteasi in ciascun pozzetto. </li><li> Ruotare la piastra su un agitatore orbitale (120 rpm) a 4 ° C per 20 min. </li><li> Pipetta delicatamente il lisato su e giù con una pipetta multicanale, evitando bolle d&#39;aria. Trasferire 5 ml di lisato ad una piastra opaco e valutare luminescenza come indicato nella Sezione 5. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In vitro: trasfezione transiente di cellule immortalati con SERCaMP Nota: Abbiamo osservato che le procedure di trasfezione transiente può indurre stress cellulare e smorzare la conseguente risposta GLUC-SERCaMP. Il seguente metodo è stato sviluppato per minimizzare trasfezione eff<html> riflette nelle cellule SH-SY5Y. Ottimizzazione della procedura (compreso scelta di reagente di trasfezione) per linee cellulari alternati può essere richiesto. Quando possibile, si consiglia di utilizzare le linee cellulari stabili o metodi di trasduzione virale descritti rispettivamente nei punti 1 e 3. <ol><li> Piastra cellule SH-SY5Y in un piatto di 100 mm a 4 x 10 6 cellule. Questo piatto sarà sufficiente riseminare circa 300 pozzetti (96 pozzetti) formato seguendo la procedura di trasfezione. </li><li> Cellule trasfezione con il reagente xfect con 20 mg di DNA plasmidico (codifica GLUC-SERCaMP) e 6 ml di xfect reagente. Scala del DNA e xfect reagente conseguenza per recipienti di coltura più o meno grandi. </li><li> Cellule tornare a incubatore per 48 ore. </li><li> Trypsinize cellule e reseed a 96 pozzetti a 60.000 cellule per pozzetto. Seguire le successive fasi descritte nella Sezione 1. </li></ol> 3. In vitro: mediata vettore virale Espressione di GLUC-SERCaMP tenda &quot;&gt; Nota: virale adeno-associato (AAV) imballaggio vettore 16 e purificazione 12 e lentivirus produzione 13 sono stati segnalati in precedenza. <ol><li> Titolo GLUC-SERCaMP AAV utilizzando i seguenti primer e sonde: primer forward, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; primer reverse, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Sonda (5&#39;-6-FAM / 3&#39;-BHQ-1 etichettato), 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;per la PCR quantitativa. <ol><li> Preparare la curva standard linearizzazione un plasmide contenente GLUC e purificazione del DNA con uno spin-colonna (ad es Machery-Nagel NucleoSpin Gel e PCR pulizia). Quantificare il DNA separando su un gel di agarosio a fianco di una scala di massa. Preparare 1:10 diluizioni del DNA di 100 pg / ml a 10 fg / ml in PBS. Calcolare le copie / ml di DNA plasmidico Gluc in ciascuna delle concentrazioni in base al peso molecolare del plasmide. </li><li> Diluire le scorte AAV in PBS (opportuna diluizione dipenderàparametri di preparazione virale e determinati empiricamente). </li><li> Eseguire la reazione PCR in un sistema PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni: 95 ° C x 5 min, 94 ° C × 20 sec e 60 ° C × 1 min per 41 cicli. Calcola copie / ml usando la curva standard. </li></ol></li><li> Titolo lentivirus con una p24 Lenti-X kit rapida del titolo. Scongelare aliquote lentivirali sul ghiaccio e diluire la proteina p24 di controllo in SH-SY5Y medio. <ol><li> Diluire il lentivirus tale che cadrà sulla curva standard (ad esempio, 1: 20.000 o 1: 100.000). Il fattore di diluizione necessaria varia in base ai parametri di preparazione lentivirali e deve essere determinato empiricamente. Seguire le istruzioni del produttore per tutte le fasi successive. </li></ol></li><li> Cellule piastra a 96 pozzetti. Per le cellule SH-SY5Y, le procedure di placcatura descritte nella sezione 1 possono essere seguite. Per ratto neuroni corticali primarie, le cellule devono essere isolati e seminate su piastre opportunamente rivestite as descritto in precedenza 16. Mantenere ratto neuroni corticali primarie Neurobasal media integrato con 1x B27 e 500 mM L-glutammina. Effettuare scambi e mezzo di media ogni due giorni. </li><li> Trasdurre le cellule con il virus. L&#39;obiettivo di trasduzione virale è quello di raggiungere l&#39;espressione di basso livello, come Gaussia luciferasi fornisce segnale più forte. <ol><li> Cellule SH-SY5Y AAV trasduzione: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire AAV a 6.0 x 10 7 vg / ml in tampone di diluizione AAV (PBS + 0.5mm MgCl 2). Aggiungere 5 ml di AAV diluito (3.0 x 10 8 vg; MOI di circa 6.000) per pozzetto di 96 pozzetti (Figura 3A). Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale. </li><li> AAV trasduzione di neuroni corticali di ratto primarie: trasdurre 6-8 giorni dopo la placcatura. Diluire AAV a 4,0 x 10 6 vg / ml in tampone di diluizione AAV. Aggiungere 5 ml di AAV diluito (2.0 x 10 7 vg; MOI di circa 350) per pozzetto di96 pozzetti (Figura 3B). L&#39;ottimale MOI dovrebbe essere determinata empiricamente per altri tipi di cellule. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale. </li><li> Trasduzione lentivirali di cellule SH-SY5Y: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire lentivirus a 20 pg / ml p24 (concentrazione determinato utilizzando kit di titolazione) in soluzione salina bilanciata di Hank. Aggiungere 5μl del virus diluito per bene (100 pg di p24, pari a 1.250.000 particelle lentivirali, o ~ 1.250 IFUs) di una piastra ben 96 contenente 100 ml di volume. Scala di conseguenza per i formati più grandi. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti virale. </li></ol></li><li> Raccogliere un campione di pre-trattamento dei media e iniziare le cure sperimentali a 48 ore (SH-SY5Y) o 5-7 giorni (ratto neuroni corticali primarie) dopo trasduzione. </li></ol> 4. In Vivo SERCaMP Assay Nota: Prima di effettuare qualsiasi procedura sugli animali da essere sicuri di ottenere l&#39;approvazione corretta attraverso il vostro istituto. Tuttiambulatori di sopravvivenza sono da fare in condizioni sterili con anestesia adeguata. Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati e sono in conformità con le linee guida NIH ACUC. <ol><li> Strumenti chirurgici autoclave prima dell&#39;inizio della chirurgia (121 ° C, 30 min sterilizzazione, 20 min tempo di asciugatura). Pulire tutti gli strumenti in un ultrasonicatore immediatamente seguenti tutte le procedure e prima della sterilizzazione in autoclave. Mantenere condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico la sopravvivenza. Per interventi chirurgici che richiedono più animali, pulire strumenti chirurgici con il 70% di alcol, ultrasonicate e tallone sterilizzare tra ratti. Fare riferimento a Materiali Lista per strumenti necessari. </li><li> Preparare topo per la chirurgia. Qui usiamo maschio Sprague-Dawley (180-200 g). <ol><li> Anestetizzare ratti utilizzando isoflurano gas per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min) seguita da iniezioni intraperitoneali di xilazina (8 mg / kg) e ketamina (80 mg / kg). Applicare pomata oftalmica per proteggere cornee si secchi. Bchirurgia EGIN una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda o il piede pizzico. </li><li> Radere la regione dell&#39;addome leggermente sotto le costole (bassa regione toracica) alla regione addominale metà. Scrub l&#39;area chirurgica tre volte, alternando il 70% di alcol e Betadine macchia. Mettere ratto in posizione supina su area chirurgica sterile con teli chirurgici sterili. </li></ol></li><li> Diluire AAV-GLUC-SERCaMP a 7,6 x 10 9 VG / ml (concentrazione finale). Mescolare bene invertendo il tubo. Nota: Intervallo di concentrazione virale può variare (Figura 4). <ol><li> Dispensare 105 ml di AAV diluito in un piatto sterile. Usare un ago da 30 gauge per raccogliere il virus in una siringa. </li></ol></li><li> Eseguire un intervento chirurgico per esporre il fegato e iniettare AAV-GLUC-SERCaMP. <ol><li> Prima di effettuare un&#39;incisione nell&#39;addome, applicare bupivacaina 0,25% alla zona di incisione. Usando un bisturi, fare una incisione orizzontale sotto gabbia toracica (approximately 2-3 cm). Blunt sezionare a separare il tessuto connettivo da ipoderma. </li><li> Tagliare muscoli addominali, esponendo il lobo destro mediale del fegato. Nota: lobi aggiuntivi possono essere iniettati in base all&#39;applicazione finale. </li><li> Mettere animale sotto microscopio operatorio e regolare per ottenere il diritto del lobo mediale del fegato nel campo visivo. Iniettare virus nel parenchima del lobo mediale; 3 siti separati, di circa 33 ml per sito. Nota: Lasciare l&#39;ago nel tessuto per 5-10 secondi dopo l&#39;iniezione per garantire la consegna di tutto il volume di iniezione. </li><li> Suturare il muscolo addominale e la pelle separatamente e aggiungere Neosporin utilizzando cotone dell&#39;applicatore punta. Posizionare ratto in una camera di recupero fino coscienza è recuperato e ratto è in grado di mantenere la posizione eretta. Non lasciare ratto (s) incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa singolarmente fino a quando l&#39;incisione è guarita e le suture sono state rimosse (7-14 giorni). <br/&gt; Nota: Secondo le linee guida post-chirurgiche NIH, mantenere registrare chirurgico. Annota carta gabbia con procedura, la data, identificatore del test, il peso corporeo, e giorno dell&#39;intervento. Dolore / disagio, la produzione di feci, l&#39;attività, e il cibo e il consumo di acqua devono essere monitorati e registrati chirurgia 3 giorni post. Analgesia post-operatoria è fornito con l&#39;aggiunta di paracetamolo per l&#39;acqua potabile (450 mg / 100 cc), anche se non osserviamo tipicamente segni di dolore o disagio dopo l&#39;intervento. </li></ol></li><li> Inizia coda raccolta del sangue 4-7 giorni dopo l&#39;iniezione. Preparare le provette di raccolta del sangue, mediante l&#39;etichettatura e pre-pesatura. Aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml) per ogni provetta. </li><li> Luogo ratto in camera di isoflurano per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min). Rimuovere ratto dalla camera e posto nel naso cono (2-3% isoflurano consegnato a 500 cc / min). La raccolta del sangue può iniziare una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda piNCH. <ol><li> Utilizzando le forbici sterili punta taglio della coda (1-2 mm) e raccogliere il sangue goccia a goccia nel tubo eparina pre-riempita. Raccogliere il sangue fino volume raggiunge maggiore di 2: 1 rapporto sangue eparina (&gt; 100 ml sangue / 50 ml di eparina). I volumi di raccolta del sangue possono essere regolati in base a disegno sperimentale. Utilizzare un applicatore di cotone umido per applicare la polvere emostatico alla coda per fermare l&#39;emorragia. </li><li> Provette di sangue Conservare a 4 ° C se la raccolta di campioni successivi. Pulire forbici con fondello etanolo e tallone sterilizzare tra le collezioni. </li><li> Pesare provette per il prelievo e regolare con eparina per ottenere rapporto 2: 1 (sangue: eparina). Questo passaggio normalizzare la quantità di eparina in ciascun campione (Tabella 1). </li><li> Tubi centrifugare a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) in una nuova provetta e conservare a -80 ° C fino al momento della luciferasi test (sezione 5). Nota: Conservazione dei campioni a 4 ° C fino a 72 ore prima del saggio enzimatico ha minimal effetto sulla luminescenza (Figura 5A). Fino a 3 cicli di gelo-disgelo dei campioni di plasma non hanno alcun effetto sulla luminescenza (Figura 5B). </li></ol></li><li> Amministrazione tapsigargina (controllo positivo): <ol><li> Preparare thapsigargin diluendo in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Iniettare tapsigargina a 1 mg / kg ip nel basso addome. Nota: tapsigargina aumenta trombina piastrinica indotta coagulazione 17 e può fare la raccolta di sangue da coda più difficile. </li></ol></li><li> Gaussia luciferasi test: <ol><li> Scongelare i campioni di plasma sul ghiaccio. Nota: Per gli studi longitudinali, disgelo e di eseguire test di luminescenza per tutti i campioni tempo di valutazione nella stessa giornata (utilizzando solo la preparazione del sottofondo). </li><li> Trasferimento 10 ml di plasma per un piatto di murato opaco e misurare l&#39;attività enzimatica come descritto nel capitolo 5. Eseguire 3-4 repliche tecniche di ogni campione di plasma. </li></ol></li><li> Euthanasiun Nota: Il vantaggio della tecnologia SERCaMP è la capacità di monitorare longitudinalmente ER calcio. A seconda di parametri sperimentali e le analisi degli endpoint, gli animali devono essere eutanasia con misure adeguate per le analisi degli endpoint e secondo gli orientamenti ACUC istituzionali. </li></ol> 5. Luminescence Assay <ol><li> Preparare soluzioni coelenterazine (CTZ) stock diluendo il composto in metanolo acidificato (30 ml di HCl 10 N a 3 ml di metanolo) a 20 mM. Preparare aliquote monouso e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare il substrato lavorare il giorno di dosaggio. <ol><li> Per i saggi in vitro, diluire coelenterazine a 8 micron di PBS, ad esempio, aggiungere 10 ml di 20 mM magazzino CTZ a 25 ml di PBS (Figura 6A, B). </li><li> Per i saggi in vivo, diluire coelenterazine a 100 micron di PBS, 500 mm acido ascorbico, 5 mM NaCl. </li></ol></li><li> Incubare preparato CTZ per almeno 30 minutia temperatura ambiente prima di iniziare il test. Nota: Questo passo è spesso incluso in Gaussia saggi di luciferasi in quanto vi sono segnalazioni di rapido decadimento substrato durante la prima 30 minuti dopo la preparazione. Non abbiamo osservato questo effetto nel nostro sistema (Figura 6C); tuttavia, spesso includiamo la fase di incubazione che abbiamo trovato alcun impatto negativo sul dosaggio. </li><li> Utilizzare un lettore di piastre che è capace di monitorare bioluminescenza e dotato di un iniettore substrato. Prime le linee con substrato. Nota: Il substrato iniziale attraverso le linee possono essere soggette a degrado. Per evitare letture artificialmente bassi per i primi campioni, iniettare 20-30 pozzi vuoti (caricamento di un piatto vuoto sul lettore) prima di misurare campioni sperimentali. </li><li> Iniettare 100 ml di substrato in bene, agitare velocità media per 5 secondi, e misurare l&#39;emissione di luce. Per il lettore di piastre Biotek Synergy II, integrare l&#39;emissione di luce oltre 0,5 sec (campioni in vitro) e 5 sec (invivo campioni) per la fase di lettura. Ottimizzare i parametri del lettore piastra Per garantire prestazioni ottimali del test. Nota: mostre Gaussia luciferasi cinetica flash con rapido decadimento del segnale (rispetto a brillare cinetiche osservate con altri luciferasi). La cinetica d&#39;infiammabilità di GLUC è influenzata dal siero in terreno di coltura cellulare (Figura 7A), mettendo in evidenza l&#39;importanza di controllare per la composizione media tra i campioni. A causa del rapido decadimento della luminescenza dopo l&#39;aggiunta del substrato (cinetica Flash), il tempo tra iniezione e leggere passaggi deve essere uniforme per tutti i campioni. Il lettore di piastre deve essere impostato per iniettare substrato un pozzo, attendere un tempo fisso (ad esempio usiamo un frullato passo 5 sec), e leggiamo che bene. Aggiunta di substrato a un intero piatto prima lettura rappresenta una sfida significativa a meno substrato può essere aggiunto a tutti i pozzetti simultaneamente. Se un iniettore non è disponibile, il problema può essere parzialmente aggirato incubando la piastra per 10 minuti fra il supporto addizione e misurazione (evitando così la parte ripida della curva di decadimento) (Figura 7B). </li><li> Ripetere l&#39;iniezione, tempo di attesa, e leggere passaggi per ogni pozzetto della piastra. </li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin.">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers.">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li><li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats.">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li><li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+gene+therapy:+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo evidenzia in vitro e in vivo di utilità Gluc-SERCaMP monitorare deplezione di ER calcio. Anche se la modifica della proteina di generare SERCaMP sembra generalizzare ad altre proteine ​​reporter di 12, abbiamo scelto Gaussia luciferasi per la sua robustezza (200-1.000 volte maggiore) bioluminescenza rispetto agli altri luciferasi 18. Dimostriamo rilevabile tapsigargina indotta rilascio GLUC-SERCaMP attraverso un range di dosaggio 100 volte virus GLU...

Il reticolo endoplasmatico (ER) funzioni in molte capacità cellulari tra cui il ripiegamento delle proteine, la secrezione di proteine, lipidi omeostasi, e intracellulare di segnalazione 1. Centrale alla funzione ER normale è mantenere le concentrazioni di calcio luminali in ~ 5.000 volte quelli trovati nel citoplasma 2-4. Questo processo intensità energetica è regolata dalla ATPasi sarco / reticolo endoplasmatico calcio (SERCA), una pompa che si muove ioni calcio al pronto soccorso. Passaggio di calcio dalle ER è mediato principalmente dal rianodina (RyR) e trifosfato inositolo (IP3R) recettori. Poiché molti processi ER dipendono calcio, interrompendo il negozio può portare a ER stress e la morte delle cellule. ER disregolazione del calcio è stata osservata in malattie tra cui cardiomiopatia, diabete, morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e 5. A causa della natura progressiva di queste malattie, è stato impegnativo per delineare la causa-effetto rerappor- tra la patogenesi e alterazioni del negozio ER calcio. Un certo numero di tecnologie hanno permesso significativi progressi nella nostra comprensione delle dinamiche ER calcio, compresi i coloranti e gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS). Coloranti di calcio a bassa affinità, che aumentano di fluorescenza quando si lega a Ca 2+, possono essere caricati in cellule per esaminare compartimenti subcellulari con elevate concentrazioni di calcio 6. GeCIS, quali D1ER e catcher consentire un monitoraggio delle fluttuazioni di calcio con un controllo più preciso della localizzazione subcellulare 7-9. Recentemente, un&#39;altra classe di GECIS chiamati indicatori di proteine ​​organelli-intrappolato-calcio misura (Cepia) sono stati descritti 10. Un terzo approccio che combina la genetica e la piccola molecola chimica è mirata-esterasi dye carico (TED), che utilizza un carbossilesterasi geneticamente codificato (mirato al pronto soccorso), con un calcio di colorante a base di estere-11. Mentre il aforapprocci ementioned hanno punti di forza e debolezze intrinseche, possono fornire informazioni preziose dinamiche di calcio ER attraverso misure acuti di fluorescenza. Sono, tuttavia, non è ottimale per gli studi longitudinali spesso necessarie per determinare la progressione della malattia. Con l&#39;obiettivo di escogitare un metodo per monitorare dinamiche di calcio per periodi di tempo prolungati, abbiamo identificato e sviluppato una modifica proteina per creare le proteine ​​secrete calcio ER supervisione (SERCaMPs) 12. SERCaMP elude diversi limiti associati con altre metodologie, fornendo un approccio mini-invasivo per interrogare più volte il negozio ER calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il peptide ASARTDL carbossiterminale (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-aspartico-leucina) è sufficiente a favorire la ritenzione ER; Tuttavia, in condizioni che causano diminuzioni ER calcio, la sequenza di peptidi non è più in grado di trattenere ER localization e la proteina è secreta 13. La base della tecnologia SERCaMP è l&#39;appendice di ASARTDL al carbossi-terminale di una proteina secreta (es Gaussia luciferasi o Gluc) tale che la secrezione è innescato dalla deplezione ER calcio, creando così un robusto giornalista di ER calcio disregolazione 12. L&#39;espressione di GLUC-SERCaMP tramite metodi transgenici permette fluidi biologici tra cui coltura cellulare di medio e di plasma da analizzare per i cambiamenti nell&#39;attività GLUC come indicatore dell&#39;omeostasi ER calcio. Il metodo ha applicazioni per lo studio longitudinale alterazioni progressive nell&#39;archivio calcio ER sia in vitro che in vivo. Il protocollo che segue è scritto come un quadro generale per l&#39;uso di base-GLUC SERCaMP studiare ER calcio omeostasi, ma il protocollo può servire come guida per SERCaMPs giornalista alternative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td>for intracellular GLuc assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL luer-lok syringes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL filter tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>RT-L200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 surgical sutures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9598192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-821-13A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate sealing sheets</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>AB-0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-246-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Auto Flow System</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal recovery chamber</td>
			<td>Lyon Vet</td>
			<td>ICU-912-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine growth serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine, Native</td>
			<td>Regis Technologies</td>
			<td>1-361204-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting needles 3/8 circle sutures</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital ultrasconic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS60D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA mass ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10496-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase (recombinant protein)</td>
			<td>Nanolight</td>
			<td>321-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8023S</td>
			<td>1:2000 (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluc assay plates (96 well, opaque)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Allmedtech</td>
			<td>63323-276-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>995-2949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Stop Styptic powder</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>5867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>a452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
			<td>Bekman Colter</td>
			<td>368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neosporin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-898-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td>
			<td>Machery-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L-200XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 Lenti-X rapid titer kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR film seal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReFresh Charcoal Filter canister</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades, #10</td>
			<td>Fine Science tools Inc</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rats 150-200g</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Rats</td>
			<td>rats ordered at 150-200g.&#160; Surgery 5 days after arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal ear tags</td>
			<td>National Band and Tag co</td>
			<td>1005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drapes</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SP-MPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9033</td>
			<td>harmful to human health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virapower lentiviral packaging mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4975-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Valley Vet</td>
			<td>468RX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring endoplasmic reticulum calcium homeostasis using a gaussia luciferase sercamp

Il reticolo endoplasmatico (ER) contiene il più alto livello di calcio intracellulare, con concentrazioni di circa 5000 volte superiore a livelli citoplasmatici. Stretto controllo sulla ER calcio è un imperativo per ripiegamento proteico, la modifica e il traffico. Perturbazioni ER calcio può provocare l&#39;attivazione della risposta unfolded proteina, un meccanismo di risposta allo stress ER tre poli, e contribuire alla patogenesi di varie malattie. La capacità di monitorare alterazioni ER calcio durante l&#39;insorgenza e la progressione della malattia è importante in linea di principio, ma stimolante in pratica. Metodi attualmente disponibili per monitorare ER calcio, come coloranti e proteine ​​fluorescenti calcio-dipendente, hanno fornito visione dinamica ER calcio nelle cellule, tuttavia questi strumenti non sono adatti per gli studi in vivo. Il nostro laboratorio ha dimostrato che una modifica al carbossi-terminale della luciferasi Gaussia conferisce la secrezione del reporter in risposta aER deplezione di calcio. I metodi per l&#39;utilizzo di una base luciferasi, ER secreta proteina monitoraggio calcio (SERCaMP) in vitro e per applicazioni in vivo sono qui descritti. Questo video mette in evidenza le iniezioni epatiche, manipolazione farmacologica del GLUC-SERCaMP, la raccolta e il trattamento del sangue, e parametri del test per il monitoraggio longitudinale ER calcio.

Il metodo GLUC-SERCaMP permette per la valutazione di ER calcio omeostasi campionando fluidi extracellulari. Diversi controlli possono essere inclusi nel disegno sperimentale per migliorare l&#39;interpretazione dei risultati. In primo luogo, l&#39;uso di un reporter costitutivamente secreta (ad esempio GLUC senza il ASARTDL C-terminale o &quot;GLUC-No Tag&quot;) può essere impiegato per valutare gli effetti dei trattamenti sperimentali sulla via secretoria (secrezione cellulare globale) e l&#39;espressione de...

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Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

13.0K Views.  National Institutes of Health. Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Ricerca

Biologia

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...