SL è stato sostenuto da una borsa di studio dalla DFG (Scuola di Dottorato di Ricerca 845). Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della DFG (SFB 530/C1 &amp; PER 967) e da HOMFOR.

1. Preparazione delle soluzioni madre <ol><li> Preparare calcio senza Buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 mM glucosio in 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)). </li><li> Solubilizzare FURA-2 AM in DMSO per ottenere una soluzione 1 mM magazzino. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è giallo chiaro omogeneo. Proteggere tazza dalla luce. Diluire il FURA-2:00 soluzione madre in 1 ml di Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina ad una concentrazione finale di 4 mM per il carico di cellule HeLa. </li><li> Preparare una soluzione puromicina 12,5 mM magazzino in acqua distillata (pH 7,0). Aliquote conservare a -20 ° C. Diluire la soluzione puromicina 12,5 mM magazzino nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 500 mM puromicina. </li><li> Sciogliere thapsigargin in DMSO per ottenere un 1 Soluzione madre mM. </li><li> Solubilizzare 1 mg ophiobolin A in 20 microlitri cloroformio e, successivamente, mescolare con 25 microlitri di DMSO. La provetta rimane aperta fino al cloroformio è evaporato. Così il finale ophiobolin Una concentrazione è di 100 mm. Aliquote conservare a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, diluire soluzioni di riserva nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 100 micron. Quindi, concentrazione finale di DMSO per l&#39;imaging cellulare vivo non supera lo 0,1%. </li><li> Sciogliere trifluoperazina in DMSO ad una concentrazione di 10 mm e aliquote conservare a -20 ° C. Diluire le soluzioni stock in calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 10 mM prima dell&#39;uso. Così la concentrazione di DMSO finale per l&#39;imaging cellulare dal vivo, come per ophiobolin A, non supera lo 0,1%. </li><li> Sciogliere il siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA e siRNA di controllo) in acqua RNase libero di preparare una soluzione stock 20 mM. Mescolare con un vortice e osservare solubilizzazione ad occhio. Conservare aliquote di 50 microlitri a -20 ° C. </li></ol> 2. Silenziamento genico in cellule HeLa Per studiare il contributo di una certa proteina di ER Ca 2 + efflusso, il gene corrispondente deve essere efficacemente messo a tacere con due diversi siRNA (Fig. 1). Inoltre, l&#39;effetto di silenziamento deve essere superato con l&#39;espressione del gene corrispondente wild-type. Di solito si usa siRNA che sono diretti contro la codifica e non codificanti (UTR) regione, rispettivamente, del gene di interesse. Impiegando UTR-diretto siRNA fornisce un modo conveniente per complementazione. <ol><li> Semi di 5,2 x 10 5 cellule HeLa (ATCC no. CCL-2) in un piatto di cultura 6 cm con una scivolata 25 millimetri di copertura (pre-trattati con 200 ml di poli-L-lisina (1 mg / ml) per 1 h) in Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina e incubare a 37 ° C in ambiente umidificato con 5% di CO 2 (volume finale 3,9 ml). </li><li> Trasfezione delle cellule con siRNA SEC61A1, SEC61A1-UTR siRNA, o di un siRNA di controllo negativo utilizzando reagenti HiPerFect secondo le istruzioni del produttore (concentrazione finale di siRNA: 20 Nm). In breve, preparare siRNA fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasfezione reale: aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione HiPerFect a 4 l di ogni siRNA (20 mM) che si dissolve in 80 ml di OptiMEM. Questo mix è leggermente agitazione orizzontale e incubate a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di siRNA (104 microlitri) goccia a goccia per la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml). </li><li> Dopo 24 ore, il cambiamento del mezzo (3,9 ml) e trasfezione le cellule per la seconda volta con la stessa miscela siRNA (104 microlitri). </li><li> Valutare silenziamento mediante analisi Western blot. Dovrebbe essere superiore all&#39;80%. Lavare le cellule dal piatto di coltura cellulare in PBS (PBS) e raccoglierle in DMEM. Contare le cellule utilizzando Automated contatore di cellule contessa. Lisare le cellule in un tampone di lisi cellulare (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) integrato con un inibitore della proteasi cocktail (3 mg / ml pepstatina A, 3 g / leupeptina ml, 3 mg / ml antidolore, 3 g / Chymastatin ml) e mescolare con SDS-campione del buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% β-mercaptoetanolo, 0.01% blu di bromofenolo ) per ottenere una concentrazione finale di 10.000 cellule / ml. Campioni di calore a 56 ° C per 15 minuti e, successivamente, aggiungere alcune perle vetro e vortex per 20 minuti al DNA frammento. Separare 20 l di ciascun campione da un Laemmli tipo SDS-PAGE (tipicamente 15% polyacrylamid per il gel di separazione). Trasferimento delle proteine ​​separate su una membrana PVDF da elettroblotting (&quot;wet-blot&quot;) al costante 400 mA per 3 ore o durante la notte in buffer di trasferimento (100 mM Glicina, 12,5 mM Tris-HCl). Successivamente, blocco con il 5% (w / v) di latte magro secco in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi esporre la macchia per l&#39;anticorpo primario diretto contro il C-terminale della Sec61α da coniglio e un anti-β-actina- anticorpi di topo. Lavare la macchia in PBS-TritonX-100 (0,05%) e tWICE in PBS per 5 min, rispettivamente. Visualizza la anticorpi primari utilizzando ECL Plex di capra anti-IgG di coniglio-Cy5 o ECL Plex capra IgG anti-topo-Cy3-coniugato e il Typhoon-Trio sistema di imaging in combinazione con l&#39;Immagine Quant TL software 7.0. Nel caso del gene SEC61A1, l&#39;effetto di silenziamento massima è in genere visto 96 ore dopo la trasfezione prima. Un esperimento rappresentativo è mostrato in fig. 2. </li></ol> 3. Complementazione di cellule HeLa Al fine di salvare il fenotipo di SEC61A1 tacere, il cDNA SEC61A1 è stato inserito nel sito di clonazione multipla (MCS) di un pcDNA3-sito interno ingresso ribosomiale (IRES)-GFP-vettore che conteneva il citomegalovirus (CMV) promotore, la MCS, l&#39;IRES, più la proteina fluoresecent verde (GFP) sequenza codificante. <ol><li> 48 ore dopo la trasfezione di siRNA primo cambio del mezzo (3,9 ml) per la seconda volta e trasformare le cellule sia con vettore vuoto o SEC61A1 plasmide di espressione utilizzando Fugene HD secondo il protocollo del produttore (rapporto finale del vettore per Fugene HD è di 4 mg vettore a 16 microlitri Fugene HD). In breve, preparare plasmidi fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasformazione: Aggiungere 16 microlitri di reagente Fugene trasformazione HD a 4 mg di ogni plasmide, che viene sciolto in 80 ml di OptiMEM. Delicatamente vortice questo mix e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di plasmide (0,1 ml) goccia a goccia la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml). </li><li> Dopo 48 h di plasmide di espressione, piatti della cultura soggetti a microscopia a fluorescenza prima immagine del calcio e la raccolta. Se necessario sostituire DMEM da PBS per una migliore segnali di fluorescenza. Registrare immagini a fluorescenza su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L&#39;efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro e deve essere superiore a 80%. Un risultato tipico è mostrato in fig. 3. </li></ol> 4. Dal vivo delle cellule di imaging del calcio <ol><li> Prima della misura, trasferire la polizza di copertura rivestita con cellule HeLa transfettate in un apposito piatto 3,5 centimetri cultura. Caricare le cellule con 4 mM FURA-2 AM in 1 ml DMEM per 45 minuti a 25 ° C al buio 11,12. </li><li> Fissare a 25 vetrino mm nella camera di metallo iMic e lavare le cellule due volte e incubare in un calcio senza buffer (ogni volta 300 ul). </li><li> Iniziare a raccogliere dati su un microscopio iMic con policromi V alternativamente emozionante a 340 nm e 380 nm e la misurazione della fluorescenza emessa a 510 nm (Set di filtri: beamsplitter, 565 nm; emettitore, nm 605/70). Immagini campione contenente 20-50 cellule / fotogramma ogni 3 s. Record FURA-2 segnali come i rapporti F340/F380, dove F340 e F380 corrispondono allo sfondo-sottratto intensità di fluorescenza a 340 nm e 380, rispettivamente. </li><li> Dopo 1 min, il trattamento di cellule con puromicina (500 mM) di calcio senza buffer o con lo stesso buffer. In alternativa, il trattamento di cellule con un inibitore della molecola di piccole dimensioni (come 10 trifluoperazina mM o 100 mM ophibolin A) o con il calcio senza buffer. </li><li> Dopo le misurazioni raziometrico vengono effettuate per 2 o 10 minuti, aggiungere thapsigargin (1 mM) e continuare le misure. </li><li> Alla fine, cytoslic [Ca 2 +] è stimato in base a misure di rapporto con un metodo di taratura. 2 Analizzare i dati da Excel 2007 e Origin 6.1. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Finora abbiamo affrontato la questione se il silenziamento del gene SEC61A1 colpisce calcio (Ca 2 +) di dispersione dal pronto soccorso (Fig. 1). Il gene SEC61A1 è stato messo a tacere da due diversi siRNA in cellule HeLa per 96 ore. Mentre tacere la crescita delle cellule difficilmente colpiti e viabilità, trasporto delle proteine ​​nel ER di semi-permeabilizzate cellule è stata quasi completamente inibita. Inoltre, le cellule SEC61A1 tacere severamente colpite rispetto alla perdita di Ca 2 + dal pronto soccorso. L&#39;effetto di silenziamento genico è stato invertito da espressione del gene SEC61A1. Così, Sec61 complessi che sono presenti nella membrana ER di tutte le cellule nucleate forma Ca + 2 canali di perdita che ci si può aspettare di giocare un ruolo cruciale nella omeostasi Ca 2 +. Tuttavia, la presenza di grandi pori pieni d&#39;acqua con permeabilità agli ioni incontrollata, come formata da Sec61 complessi nella membrana ER, seriamente interferire con il rilascio regolato di Ca 2 + dal lume ER nel citosol, un meccanismo essenziale per intracellulare segnalazione. Abbiamo identificato un (CAM) calmodulina motivo vincolanti in citosolico N-terminale di Sec61α mammiferi che CaM legato ma non Ca 2 + senza apocalmodulin con affinità nanomolare e specificità di sequenza. A livello cellulare, due antagonisti CaM diverse stimolato Ca <sup&gt; 2 + uscita dal pronto soccorso in presenza, ma non in assenza di Sec61 canali (Fig. 4 e 5). Quest&#39;ultimo non è stata osservata quando Sec61 canali erano presenti quella contenuta mutazioni nel motivo QI di Sec61α. Così, Ca 2 +-CAM è coinvolta nel limitare la perdita di Ca 2 + dal pronto soccorso (fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagramma di flusso. Si veda il testo per i dettagli. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. L&#39;analisi dei dati per far tacere l&#39;efficienza. Silenziamento è stata valutata dalla Western-blot utilizzando anticorpi che erano diretti contro Sec61α e β-actina (controllo del carico). Gli anticorpi primari sono stati visualizzati mediante ECL anticorpi Plex secondaria e di imaging di fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. L&#39;analisi dei dati per l&#39;efficienza di trasfezione. Le immagini sono state registrate su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L&#39;efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Le schermate Figura 4. Dalle immagini in diretta di calcio di cellule HeLa in presenza di controllo o SEC61A1-siRNA e la presenza o l&#39;assenza del Cam-antagonista ophiobolin A. cellule HeLa sono state trattate con siRNA diretti contro SEC61A1 (B) o un siRNA di controllo negativo (A) per 96 h, come indicato. Queste cellule sono state caricate con l&#39;indicatore di calcio FURA-2 AM e incubate in un buffer di Ca 2 + libero contenente 0,5 mM EGTA, poi buffer o ophiobolin A (Ophio A) in tampone è stato aggiunto e l&#39;incubazione ripreso. Dopo 10 min, Ca 2 + rilascio è stato avviato applicando thapsigargin (TG) in assenza di esterni Ca 2 + e l&#39;incubazione è stato continuato. Schermate dalle immagini di calcio continuo sono state prese nei tempi indicati. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. L&#39;analisi dei dati per gli esperimenti dal vivo delle cellule di calcio di imaging. (A) Analisi cinetica e quantitativa di una serie di esperimenti come rappresentato nella fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] è stato stimato dalle misure rapporto con un metodo di taratura 2. L&#39;effetto di thapsigargin viene visualizzato come grafico a barre. (BD) Le cellule sono state trattate con siRNA di controllo o il indicate SEC61A1-siRNA per 48 ore e poi trasformato sia con controllo vettoriale (C), o SEC61A1 plasmide di espressione (C), o mutante SEC61A1 plasmide di espressione (D) come indicato. Dopo 48 ore, gli esperimenti di imaging del calcio sono stati effettuati come nelle figure 4 e 5A. L&#39;analisi statistica delle variazioni del Ca 2 + citosolico concentrazione dopo l&#39;aggiunta di thapsigargin in esperimenti come presentati in A sono mostrati. Valori di p &lt;0.001 sono stati definiti come significativi da spaiati t test e sono contrassegnati con tre asterischi (***), ns, non significativo. Il numero di cellule che sono state analizzate sono indicati. I valori medi sono dati, le barre di errore rappresentano gli errori standard dei mezzi (sem). Prendiamo atto che questi esempi sono stati adattati da rif. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Questi dati indicano che il rilascio di catene nascenti dal complesso Sec61 porta infatti a rilasciare calcio dal ER e la formazione di un nanodomain calcio intorno alla bocca citosolica del complesso Sec61. Questo calcio è vincolato da calmodulina e calcio-calmodulina chiude il Sec61 complesso &quot;.

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. 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L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi delle proteine ​​come pure nella segnalazione di calcio. Qui, abbiamo descritto un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo di un potenziale canale di Ca 2 + perdite e per la caratterizzazione dei meccanismi putativi normativo 13. Questo sistema sperimentale ci dà l&#39;opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine ​​di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine ​​e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti. Prendiamo atto che solo le cellule vitali dovrebbero essere analizzati e che la vitalità complessiva deve essere superiore a 80%. Pertanto, la vitalità cellulare è regolarmente valutato impiegando nucleare-ID blu / verde reagente vitalità cellulare secondo il protocollo del produttore. Inoltre, l&#39;analisi statistica delle variazioni di concentrazione citosolica Ca 2 + è obbligatoria. Pertanto, gli esperimenti devono essere effettuati per quattro diversi lotti di cellule e due coprioggetto con almeno 20 cellule devono essere analizzati per ogni condizione in un singolo esperimento. Prendiamo atto che i vari esperimenti devono essere effettuati allo stesso tempo dopo la semina sul coprioggetto.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nucleare-ID Blu / Verde reagente vitalità cellulare </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Un Ophiobolin </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazina </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Contessa ® contatore di cellule automatizzato </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio sistema di imaging </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscopio con telecamera DS-5Mc </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> microscopio iMic con policromi V </td><td> Fino Fotonica </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di calcio di segnalazione 1. Il eterotrimeriche Sec61 complesso nella membrana ER fornisce un percorso di soluzione acquosa di polipeptidi appena sintetizzati nel lume del ER. Recenti lavori di diversi laboratori hanno suggerito che questo complesso eterotrimerico può anche forma transitoria Ca 2 + perdite canali 2-8. L&#39;osservazione chiave di questo concetto era che il rilascio di polipeptidi nascenti dal ribosoma e Sec61 complessi puromicina porta a transitorio rilascio di Ca 2 + dal pronto soccorso. Inoltre, era stato osservato in vitro che al pronto soccorso del lume BiP proteina è coinvolta nella prevenzione della permeabilità agli ioni a livello del Sec61 complesso 9,10. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo del complesso Sec61 come potenziali canali Ca 2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione 11-13. Questo sistema combina mediato silenziamento genico di siRNA e cellule vive Ca 2 + di imaging 13. Le cellule sono trattate con siRNA che sono diretti contro la codifica e la regione non tradotta (UTR), rispettivamente, del gene SEC61A1 o un siRNA di controllo negativo. Nell&#39;analisi di complementazione, le cellule sono co-transfettate con un IRES-GFP vettore che consente l&#39;siRNA resistente espressione del tipo selvatico SEC61A1 gene. Quindi le cellule vengono caricati con il raziometrico Ca 2 +-indicatore FURA-2 di monitorare simultaneamente cambiamenti del Ca 2 + citosolico concentrazione in un numero di cellule tramite un microscopio a fluorescenza. La misurazione continua del citosolico Ca 2 + permette anche la valutazione dell&#39;impatto dei vari agenti, come puromicina, piccole molecole inibitrici, e thapsigargin su Ca 2 + perdite. Questo sistema sperimentale ci dà l&#39;opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine ​​di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine ​​e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti.

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Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

18.0K Views.  Saarland University. Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Video: Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

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Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.