Vorremmo ringraziare Atsushi Miyawaki per averci fornito il raziometrico-pericam-mt costruire espressione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM081685 dal National Institutes of Health (DB).

1. Pericam-mt Transfection e preparazione delle cellule. <ol><li> Piastra di cellule HeLa la notte prima di transfezione su vetrini sterili di vetro posta in una standard a 6 e piastra di coltura. </li><li> Preparare DNA / Lipofectamine 2000 complessi come suggerito dal produttore (Invitrogen). Noi usiamo 4 microgrammi di raziometrici-pericam-mt vettore di espressione e 10 L del 2000 Lipofectamine diluito in 0,5 ml di Opti-MEM per ogni bene. Le cellule devono essere confluenti ~ 70% prima della trasfezione. </li><li> Sostituire HeLa cultura dei media (Dulbecco modificato aquile medio, 10% FBS, penicillina / streptomicina) in ogni pozzetto con 1.5 mL degli stessi media senza antibiotici. </li><li> Aggiungere il DNA / Lipofectamine complessi in ciascun pozzetto di essere transfettate. Mescolare delicatamente con dondolo e incubare per 4 ore in una cella cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Sostituire antibiotico-media liberi, con terreni di coltura con gli antibiotici. Consentono alle cellule di esprimere pericam raziometriche per 1-2 giorni prima di imaging. </li></ol> 2. Microscopio installazione e acquisizione immagini <ol><li> Posizionare un vetrino con cellule HeLa in una camera per immagini con una soluzione di imaging: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 mm di glucosio, 0,1% di albumina di siero bovino, e HEPES 20 mM 7.2. Il nostro laboratorio utilizza la camera di cellule Attofluor da Invitrogen. Montare la camera di imaging in una fase microscopio invertito. </li><li> Trova una zona di interesse contenente una o più cellule che esprimono pericam raziometrico con un 40x (o superiore) obiettivo ad immersione olio. Abbiamo scoperto che pericam raziometrico è meno resistente di photobleaching a 380 nm, e quindi usiamo questa lunghezza d&#39;onda per identificare le cellule adatte. Per le immagini acquisite in Figura 1, un obiettivo Nikon Superfluor 40X con apertura 1,3 numerica è stata utilizzata. Obiettivi ingrandimento superiore Sarebbe anche opportuno (60-100x). I filtri utilizzati sono stati di eccitazione Chroma Tecnologia filtri D380/30x (380 + / - 30 nm) e D495/10 (495 + / - 5 nm), è stata beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ed emissioni filtro è stato HQ535/50m (535 + / - 25 nm). Il nostro microscopio utilizzato per acquisire le immagini in figura 1 è costituito da un microscopio invertito Nikon TE2000 dotato di un Roper Scientific Coolsnap HQ raffreddato CCD, Ludl MAC6000 rapido ruota portafiltri e cambio, e un MetaFluor acquisizione dati e software di analisi. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi standard a grande campo microscopio con i filtri appropriati e software in grado di catturare ed elaborare le immagini raziometrico. </li><li> Impostare il software per l&#39;eccitazione doppia utilizzando il 495 e 380 nm filtri. Calcio legame pericam raziometrici aumenta assorbanza a 495 nm, quindi il rapporto dovrebbe essere impostato per essere nm/380 495 nm. Raziometrico pericam ha un calcio senza picco di eccitazione a 415 nm 4. In questo protocollo si consiglia utilizzando un filtro da 380 nm solo perché è onnipresente nei laboratori più calcio di imaging. Se un filtro a 410 nm è disponibile, è preferibile il filtro 380 nm. </li><li> Acquisire immagini in sequenza alternativamente emozionante a 495 e 380 nm. Acquisire immagini al basale dei livelli di calcio per almeno 30 s prima di applicare agonista tramite un apparato di perfusione. Segnano il tempo più di ogni agonista. Tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione deve essere ottimizzata per evitare photobleaching pur consentendo sufficiente esempio temporale resolution.For, per semi-rapida dinamica di calcio monitorati in risposta alla stimolazione con agonisti, immagini sono state acquisite ogni due secondi in 1B Figure e C. Molto più veloce tasso di acquisizione Sono possibili anche 6. A lungo termine dopo la somministrazione di imaging staurosporina è stata acquisita con un intervallo più lungo (30 anni) tra le acquisizioni (Figure 1 D ed E). </li></ol> 3. Image Processing and Analysis <ol><li> Una volta che l&#39;esperimento è completo, le immagini ottenute possono essere analizzati in linea. Definire le aree di interesse (ROI) in cui si desidera monitorare i cambiamenti dei livelli di calcio. Utilizzare un ROI selezionate all&#39;interno di una zona vuota del campo per sottrarre sfondo, se necessario. Va notato che i mitocondri sono molto mobili e dinamiche, e gli eventi in un mitocondrio estrapolando solo per lunghi periodi non è sempre possibile. Così, considerando l&#39;elevata motilità di questo organello in alcuni tipi di cellule, la selezione di ROI deve essere attentamente monitorato. Inoltre, come evidenziato in Figura 1, i mitocondri eterogeneo risposta a vari stimoli. E &#39;quindi importante analizzare e monitorare i dati offline RO1 posizionamento su un fotogramma per fotogramma. Una descrizione dettagliata di misurare calcio mitocondriale altamente mobili mitocondri è stata descritta in altri 7. </li><li> Misure di rapporto ottenuto dal ROI possono essere importati in Excel o simili graphingsoftware. I dati possono essere presentati come una traccia che rappresenta i cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale in una singola cella o mitocondrio singola, o una media di flsegnali uorescence dal ROI diversi. Abbiamo anche usato questa tecnica per misurare i livelli medi di calcio mitocondriale in una popolazione di linfociti in fase di apoptosi indotta da Fas ligando 8. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) la localizzazione subcellulare di raziometrici-pericam-mt. Questa prima immagine mostra dal vivo di cellule HeLa che esprimono raziometrico-pericam-mt. La seconda immagine mostra colorazione fluorescente con mitocondrio selettivi CMXRos MitoTracker colorante rosso. La fluorescenza giallo nell&#39;immagine fusa dimostra co-localizzazione di raziometrici-pericam-mt e fluorescenza MitoTracker. (B) Una serie di pseudocolori rapporto (495:380 nm) immagini di 4 cellule HeLa che esprimono mt-raziometrico pericam trattati con 10 mM ATP . (C) Quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale nella regione di interesse (ROI) di cui (B) trattati con 10 mM ATP. (D) Serie di rapporto pseudocolori (495:380 nm) le immagini di una cellula HeLa che esprimono mt -raziometrico pericam trattati con 0,5 staurosporina micron. L&#39;eterogeneità nella risposta di calcio nei mitocondri individuale è evidente, così come notevole frammentazione dei mitocondri di 60 minuti. Alcuni hanno mitocondri aumenta oscillatorio di calcio (punta di freccia bianca), mentre altri non mostrano variazioni significative nel livello di calcio (testa freccia gialla). (E) Quantificazione di aumenti dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HeLa dopo l&#39;induzione di apoptosi con 0,5 mM staurosporina.

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui vi presentiamo un metodo molto semplice per misurare il calcio mitocondriale mitocondriali utilizzando mirate pericam raziometrico. Come mostrato nella Figura 1A, utilizzando le normali ottiche widefield senza deconvoluzione è possibile visualizzare facilmente i singoli mitocondri nelle cellule HeLa con accettabile rapporto segnale-rumore. Questo perché le cellule HeLa, come la maggior parte delle cellule in coltura, appiattirsi in modo significativo quando aderente ovviando alla necessità di microscopia confocale o altre apparecchiature specializzate. Abbiamo trovato risultati simili nelle cellule Jurkat aderito a vetrini rivestiti di poli-lisina 8. In contrasto con le metodologie con coloranti, è anche possibile monitorare in maniera non invasiva i livelli di calcio mitocondriale per ore sulla base di indicatori di calcio geneticamente codificato come raziometrico pericam (Figura 1E). Ciò è particolarmente importante quando si analizza il calcio mitocondriale durante la morte delle cellule. Inoltre, è anche possibile visualizzare fissione / frammentazione dei mitocondri durante il processo apoptotico. Come mostrato in Figure 1D ed E, il trattamento staurosporina provoca un lento aumento di calcio in sottopopolazioni selezionate di mitocondri con un picco di 20 minuti. I livelli di calcio scendere di nuovo in concomitanza con la frammentazione mitocondriale prima di andare di nuovo 2 ore dopo il trattamento. Ciò è coerente con le onde lente di calcio citosolico indotti dal trattamento staurosporina misurata utilizzando Fura-2 9. Quindi, importanti informazioni cinetiche possono essere ottenute, che non è possibile con i metodi impiegando misure statiche. Anche se abbiamo presentato i rapporti e le concentrazioni di calcio nella Figura 1, è possibile calibrare il sensore in situ per calcolare i livelli di calcio in assoluto 4, 10. Un avvertimento importante da considerare è che pericam raziometrico è sensibile al pH 4, 10. Poiché entrambi i livelli di pH citosolico e mitocondriale può cambiare radicalmente durante l&#39;apoptosi 11, questa è una considerazione importante. Titolazione di pH in mitocondri isolati pericam esprimendo dimostrare che l&#39;aumento [H +] aumenta le emissioni di pericam quando eccitato a 495 nm, con scarso effetto sulla emissione stimolata di eccitazione a 410 nm, una proprietà che è stata sfruttata per misurare simultaneamente sia di calcio mitocondriale e pH 12. Così, selettivamente monitoraggio delle emissioni con 410 nm di eccitazione fornisce un mezzo per non ratiometrically calcio monitorare mitocondriale con preoccupazione per la riduzione del pH. Infine, il protocollo presentato qui richiede solo l&#39;accesso ad un microscopio standard epifluorescente con filtri ampiamente disponibili, rendendo questa tecnica accessibile alla maggior parte dei laboratori.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

Cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio intracellulare in risposta a vari stimoli regola molti processi cellulari quali la proliferazione, la differenziazione e l&#39;apoptosi 1. Durante l&#39;apoptosi, l&#39;accumulo di calcio nei mitocondri promuove il rilascio di fattori pro-apoptotici dai mitocondri nel citosol 2. E &#39;quindi di interesse per misurare direttamente il calcio mitocondriale nelle cellule viventi in situ durante l&#39;apoptosi. Imaging ad alta risoluzione a fluorescenza di cellule caricate con coloranti di calcio a doppia eccitazione raziometrici e non raziometrico sintetico indicatore è stato dimostrato di essere uno strumento affidabile e versatile per studiare vari aspetti della segnalazione calcio intracellulare. Misurazione dei flussi di calcio citosolico utilizzando queste tecniche è relativamente semplice. Tuttavia, misurare i livelli di calcio nelle cellule intatte intramitocondriale utilizzando indicatori sintetici come il calcio Rhod-2 e Rhod-FF è più impegnativo. Indicatori sintetici mirati per i mitocondri sono spuntate le risposte ad un aumento ripetitive di calcio mitocondriale, e disturbare morfologia mitocondriale 3. Inoltre, gli indicatori sintetici tendono a fuoriuscire dei mitocondri per diverse ore il che li rende inadatti per esperimenti a lungo termine. Così, gli indicatori di calcio geneticamente codificato basato sulla proteina fluorescente verde (GFP) 4 o 5 aequorina mirati per i mitocondri hanno notevolmente facilitato la misurazione delle dinamiche di calcio mitocondriale. Qui, descriviamo un metodo semplice per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale in risposta a stimoli diversi. Il metodo si basa sulla microscopia a fluorescenza di &#39;raziometrici-pericam&#39;, che è più mirato ai mitocondri. Raziometrico pericam è un indicatore di calcio basato su una fusione di permutati circolarmente proteina fluorescente gialla e calmodulina 4. Legame del calcio a pericam raziometrici provoca uno spostamento del suo picco di eccitazione da 415 nm a 494 nm, mentre lo spettro di emissione, con un picco intorno a 515 nm, rimane invariato. Raziometrico pericam lega un singolo ione di calcio con una costante di dissociazione in vitro di ~ 1.7 microM 4. Queste proprietà di pericam raziometrici permettono la quantificazione di cambiamenti rapidi e di lungo periodo della concentrazione di calcio mitocondriale. Inoltre, si descrive l&#39;adattamento di questa metodologia ad un tenore di ampio campo ottico di immagini di calcio con set di filtri comunemente disponibili. Usando due agonisti distinti, il purinergici agonista ATP e che induce l&#39;apoptosi staurosporina droga, ci dimostrano che questo metodo è appropriato per monitorare i cambiamenti nella concentrazione di calcio mitocondriale con una risoluzione temporale di secondi a ore. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che pericam raziometrico è anche utile per misurare fissione mitocondriale / frammentazione durante l&#39;apoptosi. Così, pericam raziometrico è particolarmente adatto per continuo a lungo termine di misura delle dinamiche di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi.

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Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l&#39;indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.8K Views.  University of Texas Medical Branch. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

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Ricerca

Biologia

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Imaging di calcio di neuroni corticali usando Fura-02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Schermo genetico in avanti utilizzando Transgenic Calcium Reporter Aequorin per identificare nuovi obiettivi nella segnalazione di calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...