This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

NOTA: Questo protocollo enfatizza l&#39;uso di FRET citometria a flusso per rilevare attività di seeding da campioni biologici del mouse. E &#39;anche compatibile con fibrille ricombinanti e campioni biologici umani. Mouse l&#39;eutanasia e il cervello raccolta è stata effettuata in conformità con le procedure IACUC approvati. 1. Cervello Estrazione <ol><li> A seguito di profonda anestesia con isoflurano (2%), defluire in un mouse con ghiacciata PBS contenente 0,03% di eparina, ed estrarre il cervello seguendo le istruzioni dettagliate riportate nella Gage et al. 18 </li><li> Posizionare il tessuto estratto in crio-fiala, e far scattare freeze mettendo in azoto liquido. In alternativa, congelare il tessuto in ghiaccio secco. Una volta congelato, trasferire tessuto a -80 ° C e conservare per un periodo di tempo prolungato, se necessario. NOTA: Questo protocollo è compatibile con interi omogenati cerebrali o regioni cerebrali micro-sezionato. Vedere Hagihara et al., Per una dettagliata protocollo micro-dissezione 19. </li></ol&gt; 2. Preparazione delle sementi biologiche materiale <ol><li> Preparare tampone omogeneizzazione sciogliendo inibitori della proteasi (EDTA gratuito) in 1x TBS (1 compressa per 10 ml). Vortex con vigore, e memorizzare sul ghiaccio. Gli inibitori della proteasi devono essere EDTA liberi al fine di preservare la vitalità cellulare biosensore. </li><li> Pesare tessuto cerebrale congelato in una pesa barca usa e getta, e trasferire in una provetta da 5 ml. Aggiungere ghiacciata buffer di omogeneizzazione tale che questa soluzione finale è del 10% peso / volume. Temporaneamente memorizzare sul ghiaccio. Massa di tessuto e successiva omogeneizzazione polmone variano a seconda delle dimensioni del cervello e / o delle regioni utilizzato. Qui, un hemibrain topo adulto peso 0,2 g viene sospeso in 2 ml di 10% w / soluzione vol. </li><li> Campioni di trasferimento in una stanza fredda e regolare un sonicatore sonda per le impostazioni appropriate. Per sonda sonicazione con Omni Ruptor (qui illustrato), impostare la potenza al 20%, che corrisponde a circa 75 W. Utilizzare un modo a impulsi per garantire campioni non sono Over-riscaldata durante sonicazione. Impostare il pulser al 30%, corrispondente a circa 500 msec. </li><li> Pulire la punta della sonda sonicatore risciacquando con acqua, isopropanolo, e ancora acqua, rimuovendo la sonda tra ciascuna soluzione. Essere certi di lavare e pulire entrambi i lati e la parte inferiore della sonda con laboratorio-salviette. </li><li> Lavorare con un campione alla volta, immergere la punta della sonda nel buffer di omogeneizzazione, e avviare il sonicatore. Utilizzando le impostazioni di alimentazione e pulser sopra descritte, consegnare 25 impulsi totali. Assicurarsi che il tessuto è completamente in sospensione. Fare attenzione ad evitare la formazione di schiuma del campione durante questa fase. NOTA: I campioni sono suscettibili alla formazione di schiuma se a) il volume totale è basso o b) l&#39;omogenato riscalda. Con questo strumento specifico, non sonicare con volumi inferiori a 250 microlitri. Per garantire i campioni rimangono refrigerati, i tubi possono essere conservati in ghiaccio durante questa fase. </li><li> Pulire la sonda asciugandosi lisato residua, poi consegnare 10 impulsi in un bicchiere oacqua pulita f. Sciacquare le pareti e il fondo della sonda con acqua, isopropanolo, e l&#39;acqua di nuovo (come al punto 2.4), asciugandosi asciugare tra un passo. Per evitare la contaminazione, sciacquare la sonda in tra i campioni. NOTA: Con aggregati tau, non abbiamo trovato che i metodi di pulizia più severi sono necessari per prevenire la contaminazione da campione a campione. Altri amiloidi, tuttavia, possono necessitare di cure aggiuntive che è stato ampiamente descritto in letteratura 20,21. </li><li> Conservare omogenati in ghiaccio fino sono stati elaborati tutti i campioni. </li><li> Spin omogenati a 21.300 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta pulita, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet. Aliquota il surnatante, e conservare lisati a -80 ° C per un ulteriore uso. Evitare cicli di congelamento / scongelamento dei omogenati, tuttavia, come questo riduce l&#39;efficienza semina. </li></ol> 3. Cellule replating biosensore NOTA:Utilizzare quattro linee di cellule per questo dosaggio: HEK 293T (linea cellulare # 1), RD-P301S-CFP (linea cellulare 2 #), RD-P301S-YFP (linea cellulare 3 #), e RD-P301S-CFP / YFP ( linea cellulare # 4). Si prega di fare riferimento Tabella 1 per il contributo di ogni linea cellulare per il test. <ol><li> In un ambiente sterile, terreno di coltura aspirato. Lavare le cellule con PBS caldo, e aspirare. Trypsinize cellule (3 ml di tripsina-EDTA (0,05%)) per 3 minuti, spegnere con terreno di coltura caldo (9 ml di DMEM, 10% FBS, 1% penna / strep, 1% Glutamax), e trasferire immediatamente le cellule a una tubo conico. </li><li> Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il terreno, e pellet di cellule risospendere in mezzo di coltura caldo. </li><li> Utilizzando un emocitometro, determinare la densità delle cellule per ciascuna linea cellulare. Densità cellulare varia a seconda confluenza al momento della raccolta e del volume risospensione. Risospendere le cellule raccolte da un piatto 10 cm al 90% di confluenza in 10 ml media, per la densità cellulare di circa 1 milione di cellule / ml. </li><li> Compiereun master mix di cellule + supporti in modo tale che ciascun pozzetto di una piastra ben 96 conterrà 35.000 cellule in 130 microlitri mezzi (ad esempio, per fare un master mix per 100 pozzi, risospendere 3,5 milioni di cellule in 13 ml di media). Modificare il numero di cellulare per soddisfare i singoli progetti sperimentali e scadenze. Per il trattamento delle cellule ~ 18 ore dopo la placcatura, aggiungere 35.000 cellule per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, lentamente pipetta 130 ml di sospensione cellulare master mix in ogni pozzetto di un fondo piatto, tessuto cultura trattati 96 pozzetti. Mentre placcatura, posizionare la punta della pipetta nel centro del pozzo, senza toccare il fondo della piastra. NOTA: Sebbene formato placcatura può essere modificata, rendendo n = 4 pozzetti per ogni linee cellulari 1-3 per piastra è raccomandato. Il resto della piastra (n = 84) è riservato per linea cellulare # 4 (cellule biosensori). </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi lasciando la placca indisturbato per 10 minuti a temperatura ambiente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2, e &amp;# 8805; 80% di umidità relativa. </li></ol> 4. Cellule Trattamento NOTA: Il giorno seguente, quando le cellule biosensori tau sono 60-65% confluenti, preparare semi di complessi di trasduzione come segue: <ol><li> In un tubo, unire reagenti di trasfezione, come Lipofectamine, con media-siero ridotto, come Opti-MEM, per fare un master mix. Per bene, aggiungere 1,25 ml di reagente di trasfezione e 8,75 ml di media-siero ridotto. Tubo Flick delicatamente per miscelare brevemente spin down, e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> In un altro tubo, combinare materiale seme (aliquota di lisato dal punto 2.9) con media-siero ridotto. NOTA: Volume del materiale di seme varierà secondo l&#39;esperimento individuale. Al momento di scegliere il volume del seme, prendere in considerazione: l&#39;abbondanza di semi in un campione e potenziale tossicità. Omogenati greggio possono essere tossici per le cellule. In quanto tale, utilizzare il volume più basso possibile per monitorare l&#39;effetto desiderato. Volumi precedentemente testati di lisato / pozzetto gamma from 1-5 ml, corrispondenti a proteine ​​totali 5-20 mg. Assicurarsi che il volume totale per pozzetto (semi + media-siero ridotto) è di 10 ml. </li><li> Unire il contenuto dei due tubi descritti in 4.1 e 4.2, flick delicatamente per miscelare brevemente spin down (1.000 xg, 5 sec), e incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti e fino a 2 ore. </li><li> Pipettare delicatamente 20 ml di complesso trasduzione sul lato di singoli pozzetti biosensori. Utilizzare tre repliche tecnici, se possibile. Ritorna cellule trattate per l&#39;incubatore per 24-48. Incubare nelle stesse condizioni come descritto al punto 3.6. NOTA: La condizione di controllo negativo appropriato per questa configurazione è cellule biosensori trattate con liposomi vuoti (ad esempio, il reagente liposomi + media-siero ridotto), perché l&#39;applicazione di fosfolipidi introduce un leggero cambiamento nel profilo di fluorescenza rispetto al biosensori cellule non esposte al reattivo liposomi. </li></ol> 5. Celle di raccolta per FRET Citometria a flusso <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: prima della raccolta cellule generalmente a 24-48 post-trattamento è possibile ottenere una lettura preliminare di attività semina utilizzando il filtro GFP su un microscopio a fluorescenza invertito. Le cellule trattate senza materiale di semi (cioè liposomi vuote) mostreranno fluorescenza diffusa, mentre le cellule trattate con materiale seme mostrerà intenso puntata e inclusioni reticolari intracellulari (Figura 1A - B). <ol><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare tutte di medie cella (150 ml). Trypsinize (50 ml), le cellule per 5 minuti, e dissetare con 150 ml refrigerata terreno di coltura. Non includere un risciacquo PBS prima di tripsinizzazione in questa fase, in quanto può provocare il sollevamento delle cellule e la successiva perdita di cellule. Escludere eventuali cellule morte contaminanti e detriti durante citometria a flusso, tramite strategie di gating. </li><li> Subito dopo tempra, le cellule di trasferimento ad una piastra di fondo pozzo rotondo 96, e centrifugare a 1000 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare e scartare medio, avendo cura di evitare di disturbare il pellet. </li><li> Delicatamente, ma a fondo, risospendere il pellet cellulare in 50 ml 2% paraformaldeide, e incubare per 10 min. In alternativa, le cellule eseguire dal vivo, anche se la fissazione fornisce i risultati più puliti e più coerenti. </li><li> Cellule centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare paraformaldeide, avendo cura di evitare di disturbare il pellet. </li><li> Delicatamente, ma accuratamente, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di flusso refrigerata citometria tampone (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) ed eseguire la piastra appena possibile per evitare grumi cellule. </li></ol> 6. FRET Citometria a Flusso NOTA: Utilizzare un citofluorimetro come il MACSQuant VYB, che è dotato di FRET-compatibile linee laser e set di filtri (Tabella 2). Per ogni passo all&#39;interno di questa sezione, fare clic sul pozzo di interesse utilizzando il modello a 96 pozzetti del software, quindi fare clic su&quot;Play&quot; per iniziare l&#39;assorbimento e il flusso del campione. Fai trame o tabelle statistiche cliccando sull&#39;icona &#39;nuova finestra di analisi&#39;. Modificare i parametri degli assi su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato. Per spostare popolazioni cellulari o segnali di fluorescenza, aumentare o diminuire le tensioni associate con i filtri appropriati. Con questo strumento, eseguire &lt;1.000 eventi / sec per garantire un monitoraggio cella singola accurata. <ol><li> Fai un Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) plot bivariata, e con linea cellulare # 1 in funzione, regolare le tensioni di SSC e FSC fino a quando la popolazione cellulare è nel quadrante in basso a sinistra. Fare clic sullo strumento poligono, e definire la popolazione cellulare (Porta P1). Per tutti i parametri di gating vedi figura 2. </li><li> Fare un FSC-H (altezza) vs plot FSC A bivariate, e applicare Porta P1 a tale grafico, facendo clic su &quot;live&quot; al di sopra della trama, e selezionando P1. Con la linea di cellule # 1in esecuzione, fare clic sullo strumento poligono, e definire singole cellule (Porta P2). </li><li> Fai 3 istogramma, uno per ognuno dei filtri di interesse: CFP, YFP e FRET. Applicare Porta P2 a tutte queste trame cliccando su &quot;live&quot; sopra le trame, e selezionando P2. Con la linea di cellule # 1 in funzione, regolare le tensioni in modo che la popolazione di cellule mediana nella PCP, YFP, e ti agiti istogrammi sono tutti tra 0 e 1. Per misurare la PCP e FRET, eccitare le cellule con il laser 405 nm, e la cattura di fluorescenza con una 450/50 nm e 525/50 nm filtro, rispettivamente. Per misurare YFP, eccitare le cellule con un laser e cattura la fluorescenza 488 nm con un 525/50 nm filtro. Impostazioni laser e filtro sono ulteriormente descritti nella Tabella 2. </li><li> Eseguire il risarcimento dei CFP spillover nei canali FRET e YFP. NOTA: Il risarcimento è il processo di correzione di fluorescenza spillover. Fluorescenza spillover si verifica ogni volta che viene rilevata l&#39;emissione di fluorescenza di un fluorocromo all&#39;interno di un filtro designato per misurare il segnale da un altro fluorocromo. Con una corretta compensazione, le ripercussioni di fluorescenza PCP può essere rimosso dai canali FRET e YFP. NOTA: Compensazione richiede la presenza di entrambe le celle -positive e -negative fluorescenza. Pertanto, per compensare su cellule PCP-positive (linea cellulare 2 #), cellule negative (linea cellulare # 1) devono essere aggiunti al campione prima della corsa. <ol><li> Spike in 30 ml di linea cellulare # 1 sospensione da un singolo pozzo in 200 ml di linea cellulare # 2 sospensione immediatamente prima di compensazione. </li><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Impostazioni strumento&quot;, quindi la scheda &#39;indennizzo&#39;, e verificare &#39;matrice&#39; per aprire la tabella di compensazione. </li><li> Fare un FRET-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Con le linee di cellule 1 + 2 in esecuzione, fare clic sull&#39;icona &#39;quadrante&#39; e disegnare quadranti tale che le popolazioni di fluorescenza -negative e -positive sono separati da due quadranti inferiori (Gates LL3 unnd LR3, rispettivamente). </li><li> Creare una tabella delle statistiche che visualizza l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) di FRET per la LL3 e cancelli LR3. Regolare il parametro FRET nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale FRET è equivalente tra LL3 e LR3. Dopo questo passo, l&#39;MFI del segnale FRET è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l&#39;assenza di PCP spillover nel canale FRET. </li><li> Fare un YFP-A vs CFP-Una trama bivariate, e applicare porta P2, come descritto al punto 6.3. Disegna quadranti (LL4 e LR4) simile a quella fatta nel passaggio 6.4.3. </li><li> Creare una tabella delle statistiche che visualizza la MFI di YFP per LL4 e LR4. Regolare il parametro YFP nella matrice di compensazione fino alla MFI del segnale YFP è equivalente tra LL4 e LR4. Dopo questo passo, l&#39;MFI di un segnale YFP è uguale tra le cellule e le cellule non colorate CFP-positive, suggerendo l&#39;assenza di PCP spillover nel canale YFP. </li></ol></li><li> Folla causa di configurazione porta e la compensazione, evidenziare pozzi di interesse ed eseguire il resto del piatto. </li><li> Dopo che tutti i campioni sono stati eseguiti, i file di dati di esportazione facendo clic su &#39;file&#39;, quindi &#39;copia&#39;. Selezionare la scheda &#39;file di dati &quot;, evidenziare la cartella esperimento, e fare clic su&#39; copia &#39;. </li></ol> Analisi 7. I dati NOTA: i parametri degli assi cambiamento su singoli appezzamenti bivariati facendo clic sul titolo sulla X o Y e selezionare il filtro appropriato. <ol><li> Aprire i file FCS nella citometria a flusso programma di analisi. </li><li> In base alle proprietà di dispersione, utilizzare una porta poligonale per definire la popolazione cellulare (SSC vs FSC) e la popolazione singoletto (FSC-H vs FSC-A) da cellule trattate con liposomi vuoti, simile a quella descritta nella sezione 6. </li><li> Se la compensazione PCP è stato eseguito durante l&#39;installazione, non regolare ulteriormente PCP. </li><li> Creare una FRET vs YFP bivariata trama. Utilizzando linea cellulare # 3, Definire un cancello FRET falso disegnando un cancello poligonale che corre lungo il pendio della popolazione di cellule FRET-positivo. Questa porta esclude YFP singole cellule positive che emettono un segnale all&#39;interno del filtro FRET, ed è attratto simile a quello precedentemente indicato, vietando et al. 22 </li><li> Definire un cancello FRET tracciando cellule CFP / YFP liposomi trattati vuote su una FRET vs. PCP bivariata trama. Introdurre un cancello poligonale lungo il pendio della popolazione che si estende verso l&#39;alto e verso sinistra dalla popolazione. Questa porta deve escludere maggior parte delle cellule (~ 99%), in modo tale che sfondo FRET è ≥1% delle cellule. Tutti gli eventi che spostano in questa porta sono considerate FRET-positivo. NOTA: Ogni individuo porta sopra descritto si applica a tutti i campioni prima di costruire porte successive. A seguito di analisi, quattro porte individuali sono definiti (popolazione cellulare; singoletto, falso FRET, FRET). </li><li> Parametri di analisi record di interesse, tra cui: cento FRET positività e MFIdi cellule FRET-positive. Calcolare manualmente la densità FRET integrata misurando il prodotto della percentuale di positività e di MFI. NOTA: Se la densità FRET integrato viene utilizzato come misura di esito, impostare sfondo FRET (come definito al punto 7.5) e MFI maggiore o uguale a 1 per evitare il calcolo di un prodotto che è inferiore rispetto ai suoi due fattori individuali. </li></ol>

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A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

This assay has been licensed to Janssen Pharmaceuticals.

Il sistema FRET citometria a flusso qui descritto è un potente strumento per valutare in modo rapido e quantitativamente l&#39;attività tau seeding. Si richiede solo moderato esperienza coltura cellulare e una conoscenza di FRET e citometria a flusso. Altri saggi semina, come Thioflavin T - che espone migliorata fluorescenza quando si lega alla struttura foglietto beta - sono laboriosi e richiedono un puro, substrato proteina ricombinante. Inoltre, i test in vitro per la semina in tau sono solo semi-...

L&#39;accumulo di tau intracellulare amiloidi definisce tauopatie come il morbo di Alzheimer. Nelle fasi iniziali della malattia, la patologia è generalmente localizzata alle regioni discrete del cervello, ma con la progressione della malattia, la patologia si diffonde sempre lungo le reti neurali distinte 1-5. Accumulare evidenza suggerisce transcellulare propagazione di aggregati proteici tossici alla base di questa patologia (rivisto in 6-10). In questo modello, i semi proteopathic (ad esempio, tau) vengono rilasciati dalle cellule del donatore e entrano nelle cellule vicine, trasformando proteina tau nativo nella forma misfolded via su modelli cambiamento conformazionale 11-15. Il test qui descritto è stato sviluppato per rilevare sensibilmente tale attività semina. E &#39;compatibile con proteina ricombinante e campioni biologici e consente una quantificazione dei livelli di attività di seeding proteopathic 16 minuti. Cellule HEK 293T che esprimono stabilmente tau ripetizione dOMain (RD) contenente il P301S mutazione associata a malattia fuso a uno CFP o YFP (di seguito indicato come cellule tau-RD-CFP / YFP) servire come biosensore stabile di attività di seeding. In assenza di semi proteopathic, le cellule mantenere tau come monomero solubile, e non hanno sfondo apprezzabile FRET. Assorbimento spontanea o liposomi mediata trasduzione di semi tau nelle cellule, però, si traduce in RD-CFP e aggregazione RD-YFP, che produce un segnale FRET che si misura all&#39;interno delle cellule singole tramite citometria a flusso. Numerosi componenti di questo test sono stati progettati per migliorare la sensibilità e ridurre la variabilità. Una linea di cellule monoclonale con un rapporto di 1: espressione RD-CFP / YFP 1 è stato scelto, in quanto fornisce il segnale ottimale: il rumore. Per aumentare la sensibilità, fosfolipidi vengono utilizzati per introdurre semi direttamente in cellule (anche per studiare i meccanismi biologici di assorbimento, questo può essere omesso). Infine, citometria a flusso monitor FRET a livello di popolazione e una singola cella<html> livello, a differenza di altre metodiche di aggregazione delle proteine. La misura di esito finale, densità FRET integrata, è altamente quantitativa e spiegherebbe sia il numero di cellule con aggregazione, e il grado in cui si è verificato l&#39;aggregazione all&#39;interno di ogni cella. Tutti questi parametri ottimizzati migliorare la sensibilità e garantire la riproducibilità. Questo sistema è stato recentemente impiegato in uno studio completo in transgenici P301S topi taupatia 17 che ha valutato l&#39;insorgenza e la progressione temporale di attività di seeding tau rispetto ad altri marker patologici tau comunemente usati (per esempio, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Attività di seeding è di gran lunga il marcatore prima e più robusto di tau patologia valutato, precedente rilevazione istologica di almeno 6 settimane. Attività di seeding appare a 1,5 mesi e aumenta progressivamente con l&#39;età, suggerendo un ruolo causale di semi proteopathic nell&#39;insorgenza e / o la progressione della neurodegenerazione 16. e_content &quot;&gt; quantificazione precisa dei livelli di materiale di seme da campioni biologici minuti può facilitare gli studi che monitorano la progressione della malattia precoce. Accorciando la durata di prova e consentendo l&#39;uso di animali più giovani, ciò potrebbe aumentare l&#39;efficienza e l&#39;accuratezza delle prove sugli animali preclinici. Ad esempio, in il mouse P301S precedentemente descritto, composti di piombo potrebbero essere consegnati già nel 4-6 settimane (immediatamente prima, o inizio dell&#39;attività seeding), e monitorati per l&#39;efficacia 2-4 settimane più tardi. Il dosaggio deve quantificare con precisione eventuali riduzioni di semina attività. FRET citometria a flusso è possibile testare rapidamente in vitro applicazioni di screening così. Ad esempio, reagenti anti-tau (ad esempio, anticorpi, molecole di piccole dimensioni, etc.) per la loro capacità di bloccare la semina di induzione direttamente in coltura, utilizzando tau ricombinante aggregati o lisati cervello-derivato come una fonte di semi (Figura 5). Con questa impostazione, una volta che il materiale seme è preparato, un exsperi- dura solo tre giorni per completare, compresa l&#39;analisi dei dati. La rapida quantificazione dell&#39;attività seeding proteopathic può quindi facilitare molti studi di neurodegenerazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

FRET citometria a flusso consente sensibile, quantitativa, e la rapida individuazione di attività semina da campioni ricombinanti o biologici. Messa a punto del test è facile: le linee cellulari stabili monoclonali-derivati ​​che esprimono tau-RD-CFP / YFP sono trasdotte con materiale di seme, incubate per 24-48 ore, e sottoposti ad analisi di citometria di flusso (Figura 1A). In assenza di semi, cellule biosensori mantengono tau in un solubile, forma monomerica (Figura 1B). In pr...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Video: Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Ricerca

Bioingegneria

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Volare Insetto rilevamento e classificazione con sensori Economico

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.