Un profilo SEC è un modo potente per analizzare la qualità di una proteina. L'obiettivo è quello di raccogliere un profilo SEC per una proteina di membrana utilizzando la fluorescenza, che può informare sulla qualità del campione. FSEC utilizza piccole quantità di campione e può essere effettuato per la purificazione, è relativamente semplice e può essere effettuato su apparecchiature disponibili in molti laboratori.
A dimostrare la procedura sarà Jack Wright, uno scienziato senior delle proteine di Peak Proteins. Iniziare preparando le tavolozze delle celle scongelando la tavolozza delle celle conservata a meno 80 gradi Celsius a temperatura ambiente per 15 minuti o fino a quando il campione non è più congelato. Spostare immediatamente il campione sul ghiaccio.
Per risospendere e solubilizzare il campione, aggiungere due millilitri del tampone di solubilizzazione alla tavolozza delle celle. Incubare con inversione end-over-end a quattro gradi Celsius per 15-30 minuti. Quindi aggiungere il brodo di detergente premiscelato per ottenere una concentrazione finale dell'1% di dodecilmaltoside, o DDM, e dello 0,1% di colesterolo emisuccinato o CHS.
Solubilizzare per 30 minuti con inversione end-over-end a quattro gradi Celsius. Per eseguire una fase di centrifugazione a bassa velocità, centrifugare il campione in una centrifuga da banco utilizzando un secchio estraibile e centrifugare a 2000 g per 15 minuti. Quindi eseguire la centrifugazione ad alta velocità trasferendo il surnatante dalla centrifugazione a bassa velocità ai tubi di ultra-centrifugazione utilizzando un ago smussato collegato a una siringa da cinque millilitri.
Assicurati di non disturbare la tavolozza. Dopo aver bilanciato le coppie di tubi, metterli in un rotore di ultracentrifugazione ad angolo fisso e centrifugare a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 250.000 g. Preparare la cromatografia liquida proteica veloce, o sistema FPLC riempiendo il sistema con cromatografia ad esclusione dimensionale, o tampone SEC, e spurgo le pompe d'aria.
Collegare la colonna SEC all'FPLC, assicurandosi che l'aria non entri nella colonna. Pre-equilibrare la colonna SEC lavandola in 1,5 volte i volumi della colonna di acqua distillata e filtrata di laboratorio, seguita da 1,5 volte i volumi della colonna di tampone SEC alla portata e alla pressione raccomandate per la colonna. Per eseguire l'esperimento SEC, trasferire il surnatante dalla fase di centrifugazione ad alta velocità a una siringa da un millilitro utilizzando un ago smussato collegato alla siringa.
Impostare il ciclo di esempio su load. Riempire eccessivamente un circuito di campionamento da 500 microlitri iniettando da 600 a 700 microlitri del campione dalla siringa nella porta di carico. Quindi, iniettare il campione dal circuito nella colonna svuotandolo con quattro millilitri di tampone SEC alla portata e alla pressione raccomandate.
Far scorrere la colonna alla stessa portata fino al passaggio di 1,5 volte il volume tampone e iniziare a raccogliere 90 frazioni di 0,2 millilitri dopo aver superato di 0,25 volte il volume della colonna. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 90 microlitri di acqua distillata di laboratorio da un serbatoio a ciascun pozzetto di una piastra opaca, a fondo piatto, a 96 pozzetti. Quindi trasferire i 10 microlitri dei campioni da una piastra a 96 pozzetti alla piastra opaca, a fondo piatto, a 96 pozzetti e posizionare la piastra del pozzetto in un lettore di piastre.
Per la GFP marcata con fluorescenza, et l'eccitazione il più vicino possibile a 488 nanometri e rilevare l'emissione fluorescente il più vicino possibile a 507 nanometri prima di misurare il segnale. L'indagine sulla gamma dinamica e sui limiti inferiori della proteina fluorescente verde potenziata, o rilevamento EGFP per il lettore di piastre, ha indicato che il lettore di piastre aveva un limite di rilevamento inferiore di 30 nanogrammi e un intervallo dinamico fino a 500 nanogrammi di proteina marcata con EGFP per pozzo prima della saturazione del segnale. La conversione dei volumi di eluizione in Kav e il tracciarlo rispetto ai pesi molecolari logaritmici ha permesso di stimare il peso molecolare dei recettori accoppiati a proteine G mediante interpolazione della curva standard.
Le condizioni ottimali di estrazione della membrana sono state esplorate testando il DDM e il lauril maltosio neopentil glicole contro l'estrazione senza detergente con copolimero di acido stirene maleico. L'effetto dell'aggiunta di ligando sul profilo cromatografico di esclusione dimensionale della fluorescenza è stato studiato aggiungendo sfingosina-1-fosfato, o S1P, al campione durante la solubilizzazione. Il campione solubilizzato in presenza di S1P ha mostrato una traccia superiore con aggregazione ridotta.
Lo studio della stabilità a lungo termine del recettore della serotonina 5HT2AR in diverse condizioni ha indicato che la proteina nelle particelle lipidiche dell'acido stirene maleico è rimasta stabile più a lungo, anche a temperature sfavorevoli. Il tempo che intercorre tra il punto di solubilizzazione e il passaggio del campione lungo la colonna SEC è critico in termini di tempo. Non ci devono essere pause e il campione deve essere tenuto freddo.
Dopo FSEC, verrà acquisita una comprensione del miglior costrutto, detergente o tampone. Ciò consente di ottimizzare la purificazione delle proteine e supporta la caratterizzazione biofisica e strutturale a valle.
