This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

1. Istituzione di gastrico organoide Cultura Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per l&#39;isolamento delle ghiandole gastriche da mouse o tessuti umani. Si consiglia di usare il tessuto di circa 1 cm². Tessuto umano può essere ottenuto da resezioni gastriche o biopsie. <ol><li> Preparazione del materiale Nota: La matrice seminterrato utilizzato è Matrigel. Mantenere la matrice seminterrato su ghiaccio in ogni momento. Conservare la matrice seminterrato a -20 ° C e scongelare su ghiaccio prima dell&#39;uso. Terreno di base si riferisce ad Avanzato DMEM / F12 integrato con HEPES; una fonte di glutammina appropriato come Glutamax e antibiotici appropriati, come 1x Primocin. L&#39;incubatore utilizzato è un incubatore di coltura cellulare standard (37 ° C, atmosfera umidificata, 5% CO 2) <ol><li> Sterilizzare gli utensili di preparazione in autoclave o con il 100% di alcol isopropilico: pinze taglienti, forbici, bisturi e uno scivolo microscopio vetro. </li><li> Il giorno prima di isolamento, posizionare un 24 well cella piastra di coltura nell&#39;incubatrice. </li><li> Preparare la matrice seminterrato secondo le raccomandazioni dei costruttori. Preparare aliquote di 1 ml di evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. </li><li> Preparare 500 ml chelanti tampone e raffreddare su ghiaccio. Preparare 1x tampone da acqua distillata sterile con 5,6 mm Na 2 HPO 4, 8,0 mm KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, saccarosio 43,4 mM, 54.9 mm D-sorbitolo, 0,5 mM DL-ditiotreitolo (ATTENZIONE), pH 7. Se la pianificazione diversi isolamenti, preparare una soluzione concentrata 5x senza il DL-ditiotreitolo. Filtro sterile buffer. Prima di isolamento, diluire il tampone 5x con acqua sterile a 1x e aggiungere DL-ditiotreitolo poco prima di isolamento. </li><li> Preparare e portare tutti i fattori di crescita secondo le raccomandazioni del fabbricante. Utilizzare piccole dimensioni aliquote ed evitare cicli di gelo-disgelo. Fattori di crescita funzionali sono di fondamentale importanza per i risultati. </li><li> Raffreddare terreno di base su ghiaccio e raffreddare la centrifuga a 46; C. </li><li> Riscaldare un&#39;altra aliquota di terreno di base a 37 ° C. </li></ol></li><li> Isolamento di ghiandole <ol><li> Raccogliere circa 1 cm² di tessuto in ghiaccio freddo terreno di base. Tenere in ghiaccio fino preparazione. Mentre è preferibile trattare il tessuto appena possibile, conservare tessuto in media su ghiaccio se necessario. </li><li> Posizionare il tessuto in una capsula di Petri 10 cm e coprire con tampone chelazione 1x freddo. Lavare muovendo delicatamente avanti e indietro. </li><li> Collocare il tessuto in una secca 10 centimetri piastra di Petri. Utilizzando pinze, rimuovere con attenzione il muco e lo strato muscolare allo stereomicroscopio. Lavare il tessuto in tampone chelante 1x freddo muovendo delicatamente avanti e indietro. </li><li> Mettere 1 cm 2 di tessuto su una nuova asciutta 10 centimetri piatto, Petri. Utilizzando le forbici tagliano in 20-50 piccoli pezzi di circa 2-5 dimensioni mm². </li><li> Utilizzando pinze, inserire tutti i pezzi in un tubo da 50 ml. </li><li> Prendete una sterile 10 ml di plastica pipetta. Bagnare la pipetta in tampone chelante 1x. Tenereusando la stessa pipetta durante tutta la procedura. </li><li> Aggiungere 10 ml freddo 1x tampone chelante al tubo da 50 ml. Lavate i pezzi vigorosamente pipettando su e giù per 10 volte. Lasciate che i pezzi stabilirsi. Rimuovere il surnatante. </li><li> Ripetere il lavaggio (passo 1.2.7) fino a quando il surnatante è chiaro. Questa operazione richiede circa 50-100 ml di tampone chelante 1x per 1 cm² di tessuto umano. </li><li> Incubare i pezzi di tessuto in 20 ml di 1x tampone chelante integrati con EDTA 10 mM a temperatura ambiente per 10 minuti con dolce invertendo ogni 2 min. Nota: Il tempo e temperatura di questa incubazione può essere ottimizzato sia per la velocità e / o la conservazione dell&#39;architettura ghiandolare. Essi possono variare da diverse ore di incubazione a 4 ° C su una piattaforma di rotolamento per 5 min a 37 ° C in un agitatore di 200 rpm. Buoni punti di partenza per il mouse stomaco sono 30 minuti a 4 ° C su una piattaforma di rotolamento e per stomaco umano, 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipetta una volta delicatamente su e giù con la pipetta 10 ml. Lasciare che il pi grecoECE di stabilirsi. Scartare il surnatante. </li><li> Utilizzando la pipetta, trasferire i pezzi per un ambiente pulito 10 centimetri piastra Petri. Rimuovere il liquido. </li><li> Collocare un vetrino microscopico vetro sulla parte superiore dei pezzi di tessuto. Osservare il tessuto intatto sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X. </li><li> Applicare una pressione al vetrino e piastra di Petri. Tenere sia in mano (con guanti sterili) e premendo il vetro con il pollice. Il bordo del tessuto avrà un aspetto torbido indicando che ghiandole vengono rilasciati dal tessuto. </li><li> Osservare le ghiandole rilasciati sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X. </li><li> Raccogliere ghiandole e tessuti in 30 ml di freddo medio basale. Lasciate che frammenti di tessuto di grandi dimensioni si depositano. </li><li> Raccogliere il surnatante contenente ghiandole in due provette da 15 ml. </li><li> Centrifugare 5 min a 200 xg e 4 ° C. Surnatante scarto. Il pellet contiene ghiandole isolati. Tenerli in ghiaccio. </li></ol></li><li> Semina di ghiandole <ol&gt; <li> Per la semina, tenere matrice cantina gelida in ogni momento, in modo che rimarrà liquido. </li><li> Alternativa 1: Seme 6 pozzetti di una fila di diluizione. <ol><li> Sospendere il pellet in 60 ml di matrice seminterrato. </li><li> Preparare 5 sterili provette da 1,5 ml su ghiaccio con ciascuna contenente 50 ml di matrice seminterrato. Trasferire 10 ml di sospensione matrice ghiandole / interrato nel primo tubo 1,5 ml. Sospendere le ghiandole e trasferire 10 ml di questa soluzione alla prossima provetta da 1,5 ml. Ripetere l&#39;operazione per i prossimi tubi. </li></ol></li><li> Alternativa 2: il seeding di una quantità calcolata di ghiandole per pozzetto. Inizia con 100 ghiandole per matrice seminterrato di 50 ml in un pozzetto di una piastra ben 24. <ol><li> Sospendere accuratamente le ghiandole pellet in 10 ml di mezzo basale. Mettere 50 ml su una superficie pulita da 10 ml capsula di Petri. Contare il numero di ghiandole sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X. </li><li> Calcolare la concentrazione di ghiandole nella soluzione. Trasferire il volume che contains 400 ghiandole ad un nuovo tubo 15 ml. </li><li> Centrifugare 5 min a 200 xg e 4 ° C. Gettare il surnatante e tenere la provetta in ghiaccio. Aggiungere 200 ml di matrice seminterrato e con attenzione risospendere. Continuate a ghiaccio. </li></ol></li><li> Prendere la C caldo 24 pozzetti 37 ° (vedi punto 1.1.2) dal termostato. Mettere una goccia di 50 microlitri in ghiandole matrice interrato nel centro del pozzo. La goccia formerà una cupola. </li><li> Trasferire accuratamente la piastra posteriore per l&#39;incubatore di coltura cellulare. Lasciate che la matrice seminterrato solidificare 10 min. </li><li> Preparare medio caldo con tutti i fattori di crescita. <ol><li> Per ghiandole umane: Supplemento medio basale con i seguenti fattori di crescita per organoidi gastriche umane: 50 ng / ml FEG, il 10% a medio-zucca condizionata, il 10% medio di R-spondin1 condizionata, il 50% medio Wnt condizionata, 200 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 10, 1 nM gastrina, e 2 micron inibitore TGFbeta e 10 micron di Rho-associata coiled coil formando proteina serina / treonina chinasi<html> inibitore (RHOKi). </li><li> Per ghiandole murini: Supplemento medio basale con i seguenti fattori di crescita per il mouse organoidi gastrici: 50 ng / ml FEG, il 10% a medio-zucca condizionata, il 10% medio di R-spondin1 condizionata, il 50% medio Wnt condizionata, 100 ng / ml FGF10, 10 gastrina nM, 0.5 inibitore TGFbeta mm e 10 micron RHOKi. </li></ol></li><li> Prendere la piastra dall&#39;incubatore. Aggiungere con cautela 500 ml di media con tutti i fattori di crescita (1.3.6) a ogni pozzetto senza disturbare la matrice seminterrato. Mettere di nuovo al incubatrice. </li><li> Aggiornare i media 3 volte a settimana (ogni 2-3 giorni). Per rinfrescare media, rimuovere la vecchia media con lasciando la goccia di matrice seminterrato intatto. Aggiungere con cautela fresco, medio caldo con tutti i fattori di crescita. Non aggiungere RHOKi. Aggiungere RHOKi solo direttamente dopo la semina di ghiandole o dopo la divisione dei organoidi (step 2). </li></ol></li></ol> 2. Il passaggio di gastrico organoide Cultura Prima microiniezione. ove_content &quot;&gt; Nota: ogni tipo di cultura organoide ha il suo tempo di raddoppio del mouse intestinale e culture gastrici sono generalmente divisi 1:. 5 ogni 5-7 giorni culture intestinali umani sono divisi 1:.. 5 ogni 10-12 giorni umana culture gastriche sono divisi 1: 5 ogni 14 giorni Se avviato da singole cellule, organoidi gastriche umane possono inoltre 20 giorni per formare correttamente Si tratta di un buon segno se strutture germoglianti circondano il lume centrale In questo protocollo, organoidi sono suddivise in... 4 pozzetti per microiniezione. Manutenzione del organoidi segue lo stesso protocollo, ma è possibile utilizzare qualsiasi altra piastra di coltura cellulare, come ad esempio le piastre di coltura cellulare e 24 standard. <ol><li> Preparazione del materiale <ol><li> Pipette Pasteur Autoclave. </li><li> Il giorno prima del passaggio, posizionare una piastra di coltura cellulare 4 bene in incubatore a 37 ° C. I 4 piastre e hanno bordi bassi e consentono micromanipolazione. </li><li> Preparare la matrice seminterrato secondo le raccomandazioni dei costruttori. Il giorno della passaging, scongelare matrice seminterrato sul ghiaccio. </li><li> Preparare e portare tutti i fattori di crescita secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Raffreddare terreno di base su ghiaccio e raffreddare la centrifuga a 4 ° C. </li></ol></li><li> Passaggio delle Culture organoide <ol><li> Prendere la piastra con le organoidi dal termostato. Rimuovere media da un pozzo. </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno basale fredda alla matrice interrato nel pozzo. Usando una micropipetta 1 ml, con vigore pipetta su e giù fino la matrice seminterrato è suddiviso. Trasferire in un tubo da 15 ml. Mettere in ghiaccio. </li><li> Prendete un bicchiere pipetta Pasteur e una sorgente di fuoco, come un becco Bunsen. <ol><li> Tenere la punta della pipetta nel fuoco fino all&#39;apertura della punta è ridotto da 1,5 mm a circa 0,5 mm (Figura 1). Lasciare la pipetta raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Bagnare la pipetta in terreno di base. Una pipetta ottimale ristretto assumerà il medium visibilmente più lento di una pipetta un-ridotto, ma sarà ancora tuttoow pipettaggio bene. </li></ol></li><li> Raccogliere organoidi nella pipetta e vigorosamente pipetta 10x su e giù. La rottura dei organoidi può essere osservata ad occhio. </li><li> Aggiungere 9 ml di freddo terreno di base e centrifugare per 5 min a 200 xg e 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente tutto il surnatante. Sospendere il precipitato in 250 ml di matrice seminterrato. Continuate a ghiaccio. </li><li> Prendere la calda piastra di coltura 4 ben 37 ° C e una goccia di matrice 50 organoidi microlitri / cantina in ogni pozzetto. </li><li> Trasferire la piastra con attenzione di nuovo al incubatrice. Sia la matrice seminterrato solidificare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Preparare mezzo appropriato sia per il mouse o umani organoidi come indicato al punto 1.3.6. </li><li> Prendere la piastra dall&#39;incubatore e sovrapporre ogni goccia matrice seminterrato con 500 microlitri di media. </li><li> Trasferire la lastra per l&#39;incubatore. </li><li> Aggiorna il mezzo di 3 volte alla settimana ogni 2-3 giorni (vedi 1.3.8.). </li><li> Per il congelamento di organoidi, Mechancamente interrompere organoidi come descritto per la divisione in questo protocollo (Piazza di 2.2.1-2.2.5.). Sospendere i frammenti organoide in 500 ml di congelamento medio e congelare a -80 ° C con cryotubes e un contenitore di congelamento. Per la conservazione a lungo termine, trasferire i tubi di azoto liquido. </li><li> Per lo scongelamento di organoidi, preparare piatto la cultura, matrice di cantina, fattori di crescita, mezzo freddo e caldo come indicato dal passo 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Scaldare il flacone congelato con un bagno d&#39;acqua, e le cellule di trasferimento subito dopo lo scongelamento di un tubo da 15 ml con 10 ml di freddo medio basale. Centrifuga e piastra le cellule come descritto nel 2.2.5 a 2.2.12. Nota: microiniezione di organoidi è faticoso, ma permette la possibilità unica di studiare l&#39;interazione in 3D. </li><li> Se non sono necessari studi 3D, sementi organoidi in due dimensioni. Per questo, interrompere le organoidi come stabilito nei passaggi da 2.2.1 a 2.2.6. Aggiungere mezzo 2.250 ml fredda con tutti i fattori di crescita a 250 ml di seminterrato matrix con frammenti organoide. <ol><li> Seed in 5 pozzetti di una piastra ben 24 con 500 microlitri per bene. Cambiare medio 3 volte alla settimana, con cura sostituire solo la parte superiore 400 microlitri, per mantenere la matrice interrato sul fondo della piastra indisturbata. Nota: organoidi attribuirà alla piastra di coltura cellulare ed espandersi in 2D. Il microscopio elettronico ha mostrato che il lato apicale delle cellule affronta il mezzo nel pozzo (dati non mostrati). </li><li> Prima dell&#39;infezione, scambiare tutte di medie comprese matrice cantina, per permettere ai batteri di attaccare alle cellule. Un protocollo simile è stato descritto anche per l&#39;infezione da H. pylori 14. Strati cellulari 2D possono non contenere tutti i tipi di cellule che sono presenti in organoidi 3D. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Microiniezione di organoide Cultura. Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per microinject batteri in organoidi. Può essere utile per iniziare l&#39;iniezione con organoidiche sono più permissive a microiniezione. Ad esempio, il mouse organoidi gastrici possono crescere in grandi organoidi cistica che sono facili da colpire. <ol><li> Preparazione del materiale <ol><li> Tirare un capillare di vetro in due aghi da iniezione utilizzando un estrattore micropipetta, secondo le raccomandazioni dei costruttori. L&#39;estrattore micropipetta riscalderà il capillare di vetro nel mezzo e tirerà il capillare in due parti, generando due aghi di vetro. E &#39;pratico per tirare diversi aghi e memorizzarli in una capsula di Petri pulita. </li><li> Per consentire infezione batterica, rimuovere gli antibiotici dal supporto e per almeno 3 cambiamenti medi (= una settimana). Questo diluire gli antibiotici da matrice seminterrato. Se si utilizza un ceppo batterico che è resistente a un antibiotico specifico, aggiungere questo antibiotico specifico per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione. </li><li> Preparare il banco di lavoro per microiniezioni. Per il lavoro a diversi livelli di sicurezza biologica può essere necessario posizionare uno stereomicroscopio all&#39;interno di un banco sterile. In questo protocollo, iniettare H. pylori sotto livello di biosicurezza 2 condizioni allo stereomicroscopio all&#39;interno di una panchina sterile. </li><li> Cultura batteri secondo protocolli standard 13,23. </li><li> Per stimare la molteplicità di infezione (MOI), stimare due parametri: il numero di batteri e il numero di cellule per organoide come indicato di seguito. Il MOI può correlare con risultati, per esempio con gli host IL-8 espressione mRNA 13. <ol><li> Per calcolare la densità batterica nella soluzione infezione, prima stabilire la curva standard di unità di densità ottica e formanti colonie (CFU) secondo protocolli standard 24. Una densità ottica di 0,1 a 550 nm dovrebbe produrre circa 10 7 UFC / ml. </li><li> Per stimare il numero di celle per organoide, contare il numero di organoidi in 1 bene. Disrupt organoidi come indicato dal passo 2.2.1-2.2.4. Dopo centrifugazione 5 min a 200 xg e 4 ° C,aggiungere 1 ml di soluzione di dissociazione enzimatica e risospendere. <ol><li> Incubare a 37 ° C con agitando ripetutamente per 5-10 min. Determinare se le cellule sono dissociate in singole cellule sotto il microscopio (microscopio invertito, come Leica DMIL a 10X di ingrandimento). Se necessario prolungare l&#39;incubazione. </li><li> Contare cellule per organoide utilizzando un emocitometro e calcolare il numero di cellule per organoide. Organoidi gastriche umane con un diametro di circa 200 micron sono circa 4.000 cellule. L&#39;iniezione di 0,2 ml di una soluzione batterica di 1 x 10 9 batteri per ml consente un MOI approssimativa di 50. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Iniezione di organoidi. Nota: Per microiniezione, l&#39;ago di vetro è stabilizzata in un supporto, che può essere manovrato in 3 dimensioni da un micromanipolatore. Organoidi rimangono all&#39;interno della matrice interrato nel pozzo. A causa della dimensione e posizionamento nel pozzo, non tutti sono ugualmente un organoidimENABLE a iniezione. Di solito, i 30 principali organoidi in un pozzetto possono essere mirati in 5 min. <ol><li> Batteri raccolto e lavarli in terreno di base secondo protocolli standard 24. </li><li> Calcolare il numero di batteri per ml a seconda della densità ottica (vedi punto 3.1.5.1). Diluire i batteri di 1 x 10 9 batteri per ml in media basale. </li><li> Prendete un ago di vetro. Uso pinze rompere la punta in modo che l&#39;apertura sarà di circa 10 micron di larghezza. </li><li> Inserire l&#39;ago nel porta di iniezione e fissarlo al micromanipolatore. </li><li> Raccogliere circa 10 ml soluzione batterica nell&#39;ago. </li><li> Collocare un piatto ben 4 con i bordi bassi contenenti culture organoide con lo stereomicroscopio. </li><li> Navigazione con il micromanipolatore, indirizzare un singolo organoidi con l&#39;ago. Posizionare l&#39;ago vicino al organoide e quindi inserire l&#39;ago nel organoide con un movimento rapido. Iniettare approximately 0,2 ml soluzione batterica in ogni organoide utilizzando il microinjector. </li></ol></li><li> Harvest organoidi per qualsiasi analisi. <ol><li> A titolo di esempio, fissare organoidi dopo 4 ore. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml 2% di formaldeide e incubare 20 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Organoidi possono essere trattati per immunoistochimica secondo le procedure standard 25. </li></ol></li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids.">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Human+Gastric+Epithelial+Stem+Cells+and+Their+Responses+to+Bacterial+Infection.">In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), (2014).</li><li>Schlaermann, P., Toelle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. , (2014).</li><li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+Plays+a+Functional+Role+in+Helicobacter+pylori-induced+Epithelial+Cell+Proliferation.">CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation.</a> PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt+villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon,+Adenoma,+Adenocarcinoma,+and+Barrett's+Epithelium.">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+ve+Stem+Cells+Drive+Self-Renewal+in+the+Stomach+and+Build+Long-Lived+Gastric+Units+In+Vitro.">Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Genome-Stable+Bipotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Liver.">Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Models+of+Human+and+Mouse+Ductal+Pancreatic+Cancer.">Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+single-cell+imaging+of+NF-kappaB+oscillations+using+monoclonal+cell+lines.">High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines.</a> BMC cell. 11, 21 (2010).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Helicobacter+Species.">Laboratory Maintenance of Helicobacter Species.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2006).</li><li>Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+lacking+the+Math1+tumour+suppressor+are+refractory+to+Notch+inhibitors.">Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors.</a> Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Video+Protocol+of+Retroviral+Infection+in+Primary+Intestinal+Organoid+Culture.">A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Stange, D. E., Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

Lo studio di patogeni si basa su adeguati sistemi modello per imitare l&#39;infezione in vivo. Per alcuni agenti infettivi, adeguati sistemi modello sono carenti, mentre alcuni dei sistemi utilizzati sono ben lungi dall&#39;essere ottimale. Un esempio è il batterio gastrico Helicobacter pylori (H. pylori), che è causalmente legata alla sviluppo del cancro gastrico. Tuttavia, in assenza di un sistema di coltura cellulare più adatto, molti studi che mirano ad analizzare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del cancro linee cellulari tumorali uso, che rappresentano il punto finale della cascata cancerose. , Cellule non trasformate primarie sarebbe un modello migliore per questi studi. Tuttavia, le cellule primarie sono disponibili solo da un piccolo numero di donatori e non possono essere coltivate su periodi di tempo più lunghi. Negli ultimi anni, la ricerca sulle cellule staminali ha compiuto progressi significativi per fornire nuove fonti per colture cellulari primarie per lo studio della biologia infezione. Culture disono state utilizzate tre fonti di cellule staminali: le cellule staminali embrionali (ESC), le cellule indotte pluripotenti staminali (IPSC) o le cellule staminali adulte. Essi sono stati utilizzati per modellare infezioni da virus, come il citomegalovirus 1,2 o virus dell&#39;epatite C 3 - 7, parassiti, come Plasmodium falciparum 8 o 9 Toxoplasma gondii, e batteri, quali Bacterioides thetaiotaomicron 10 o Salmonella enterica 11. Più di recente, diversi approcci sono stati pubblicati per modellare l&#39;infezione da H. pylori con organoidi derivati ​​da ESC o iPS cellule 12, le cellule staminali adulte del mouse 21,22 o umani cellule staminali adulte di 13 - 15. Lo sviluppo delle colture organoide da cellule staminali adulte origine da uno studio, in cui le cellule staminali singole isolate da murino epitelio intestinale sono state seminate in una matrice 3-dimensionale eincorporato in mezzo che imitava l&#39;ambiente delle cellule staminali intestinali che contengono FEG mitogeno, R-spondina per migliorare la segnalazione Wnt e Noggin di inibire la proteina morfogenetica dell&#39;osso (BMP) di segnalazione 16. In particolare queste colture non richiedono co-coltura con cellule mesenchimali. In queste condizioni, le cellule staminali proliferano e formano piccole strutture con domini ospitare cellule delle cripte intestinali, e domini che contengono le cellule del villi intestinali. I organoidi quindi auto-organizzano per simulare la situazione in vivo. Oggi, le cellule staminali adulte da molte murino e tessuti umani possono essere coltivate in vitro e auto-organizzarsi in organoidi che ricordano la loro controparte in vivo, come l&#39;intestino tenue e colon 17, stomaco 13,18, fegato 19,20, pancreas e 21 22 della prostata. Qui forniamo un protocollo video al topo cultura o organoidi gastriche umane da cel staminali adultels e li microinject con H. pylori. Questo protocollo si basa sulle precedenti relazioni 13,18. Questo metodo può essere adattato per la coltura e infettare altre culture organoide come organoidi intestinali.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL, final concentration 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;i A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final concentration 2 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;M, final concentration 1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHOKi Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &#181;g/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10</td>
			<td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic dissociation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell&#174; Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td>biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Neolabs</td>
			<td>2-1033</td>
			<td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Well Multidishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workbench</td>
			<td>Clean Air</td>
			<td></td>
			<td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100T-10</td>
			<td>1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Cag A antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-25766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Questo protocollo permette isolamento delle ghiandole gastriche (Figura 2). Ghiandole vengono seminate in matrice seminterrato, che solidifica come goccia all&#39;interno di un pozzo, fornendo una struttura tridimensionale 3 ricco di laminina e collagene per consentire le ghiandole crescono in organoidi (Figura 3). Organoidi tipicamente iniziano come piccole cisti e entro 12-16 giorni, si espandono in sfere con un diametro di 50-300 micron (Figura 4). Alcuni organoidi r...

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Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.1K Views.  University Medical Centre Utrecht. Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Video: Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Ad alta risoluzione microscopia elettronica del<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

Il Madagascar sibilo scarafaggio come modello alternativo Non mammiferi animali per studiare la virulenza, patogenesi e l'efficacia dei farmaci

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificazione dei Mouse e dei repertori di anticorpo umano mediante sequenziamento di nuova generazione

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolamento di singole comunità batteriche intracellulari generati da un modello murino di infezione delle vie urinarie per analisi unicellulare a valle

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell'uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell'Helicobacter Pylori

Riepilogo

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