Questi studi mirano a fornire sistemi modello robusti e riproducibili per eseguire studi specifici di orientamento dell'epitelio intestinale. Gli organoidi apicici possono essere generati in numero elevato e promettono uno screening ad alta produttività. I monostrati sono più facili da manipolare e offrono l'accesso a segni sia apicali che basali.
Assicurarsi che la dimensione degli organoidi sia di 150-250 micrometri di diametro prima di iniziare il protocollo di inversione. Rimuovere e scartare con cura il mezzo da ogni organoidi ben contenente senza interrompere la cupola ECM. Aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione ghiacciata ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.
Rimuovere con cura le cupole tubazionando lentamente con una punta rivestita, facendo attenzione a non interrompere e frammentare gli organoidi. Trasferire la sospensione organoide su una piastra trattata con soluzione anti aderenza e posizionare la piastra su uno shaker a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti rimuovere la piastra e pipettare delicatamente la soluzione su e giù utilizzando una punta di pipetta millilitro rivestita con soluzione anti aderenza.
Posizionare il piatto sullo shaker a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti. Rimuovere la piastra e lasciare che gli organoidi si sistemino per gravità per uno o due minuti a temperatura ambiente. Dopo che gli organoidi si depositano, rimuovere la maggior parte possibile della soluzione di dissociazione e lavarli aggiungendo 1,5 millilitri di DMEM F-12.
Lasciare sedimentare gli organoidi e rimuovere il supernatante. Quindi ripetere il lavaggio. Rimuovere il più possibile il DMEM F-12 e aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di espansione organoide intestinale.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente eseguire un cambio medio parziale inclinando la piastra con un angolo da 25 a 30 gradi e rimuovendo il mezzo lungo la parete del pozzo facendo attenzione a non rimuovere gli organoidi sospesi. Aggiungere 0,4 millilitri di mezzo di espansione organoide intestinale e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre giorni.
Se si sono formati aggregati utilizzare una punta di pipetta millilitro rivestita con soluzione antiaderente per tagliare gli aggregati tubazione su e giù 20 volte mentre si preme l'estremità della punta sul fondo della piastra. Aggiungere un millilitro di 0,05%Tripside-EDTA prerifampito agli organoidi di sospensione. E mescolare accuratamente per garantire una sospensione uniforme.
Aggiungere fino a un millilitro aggiuntivo di Tripside-EDTA per un gran numero di cellule o se rimane una quantità significativa di ECM. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti, quindi mescolare accuratamente con una pipetta millilitro per interrompere gli organoidi in modo che siano completamente dissociati in singole cellule o piccoli frammenti. Per dissociare completamente frammenti o interi organoidi continuare l'incubazione con Tripina-EDTA a 37 gradi Celsius per altri tre o cinque minuti.
Una volta che gli organoidi sono sufficientemente dissociati aggiungere un volume uguale di DMEM F-12 e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Disattivare trypsin-EDTA aggiungendo il 10%FBS alle celle. Centrifugare frammenti a 200 volte G per cinque minuti a due o otto gradi Celsius.
Se gli organoidi dissociati non sono riusciti a mescolare accuratamente le cellule tubazioni su e giù e centrifugandole di nuovo. Rimuovere con cura il più possibile il supernatante. lasciando solo il pellet cellulare.
Rimorsiva le cellule in 100 microlitri di mezzo di differenziazione organoide intestinale per ogni pozzo da seminare. Regolazione del volume in modo appropriato per pozzi di dimensioni maggiori o più piccole. Rimuovere le piastre rivestite dall'incubatore e rimuovere la soluzione a matrice di membrana basale in eccesso da ogni pozzo.
Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare al pozzo superiore di ogni inserto di coltura cellulare e 500 microlitri di differenziazione organoide intestinale medio al pozzo inferiore. Quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo sia nei pozzi superiore che inferiore ogni due o tre giorni.
Per stabilire una coltura ALI rimuovere il mezzo dai pozzali superiore e inferiore e aggiungere un mezzo di differenziazione organoide intestinale fresco al pozzo inferiore lasciando il pozzo superiore vuoto. Gli organoidi intestinali coltivati con mezzo di espansione organoide intestinale presentavano una morfologia cistica. Quando l'ECM viene rimosso, alcuni organoidi tendono ad aggregarsi durante i primi tre giorni e devono essere aerato per aumentare il numero organoide.
Gli organoidi intestinali coltivati nell'ECM hanno continuato ad espandersi e ad esporre la formazione spontanea di strutture in erba secondarie. Gli organoidi mantenuti per cinque giorni in assenza di matrice extracellulare presentavano forme allungate, cistiche e irregolari. L'espressione di marcatori atipici, come la villina e lo ZO-1, è stata rilevata il lato esterno dell'epitelio che è stato esposto al mezzo.
Organoidi incorporati ECM macchiati per nuclei, villina e ZO-1 che dimostrano una polarità basale apicale in cui il lato apicale era rivolto verso il lume dell'organoide. Una volta stabilito il monostrato, le celle formavano giunzioni strette e uno strato confluente. Lo strato confluente orienta anche il bordo della spazzola contenente villina verso il lato apicale dell'epitelio, formando complessi multi proteina ZO-1 tra le cellule.
La transizione verso una coltura ALI ha indotto un'ulteriore differenziazione con cellule di calice più prominenti che è stata visualizzata mediante colorazione per la proteina mucina secreta MUC2 Per indurre l'inversione di polarità è fondamentale rimuovere tutta l'ECM senza interrompere o frammentare gli organoidi. I cambiamenti dei supporti devono anche essere eseguiti con cura in modo da evitare di rimuovere nessuno degli organoidi sospesi. Garantire che vi siano cellule singole sufficienti per la creazione della coltura monostrato è un fattore determinante della sua qualità.
Funzioni specifiche apicali come l'assorbimento dei nutrienti o le interazioni patogene ospiti possono ora essere studiate in sistemi pertinenti che si adattano alle esigenze dei ricercatori.
