This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Nota: Questo protocollo contiene le istruzioni su come utilizzare una colonna di PSF in un sistema HPLC accoppiato con più rilevatori per il rilevamento multiplex. Il protocollo è stato scritto assumendo che il lettore abbia una conoscenza di base ed esperienza in cromatografia e diversi metodi di rilevamento HPLC. Attenzione: Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell&#39;uso (ad esempio, scheda di sicurezza per metanolo). Garantire l&#39;uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si maneggiano i solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) eluente. Garantire un uso appropriato di misure tecniche di HPLC, analitico equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse). 1. Configurazione dello strumento HPLC <ol><li> Preparare lo strumento HPLC con acqua ultrapura (ad esempio, 100% acqua Milli-Q) per line A e 100% di metanolo per la linea B come fase mobile e spurgare le pompe secondo il requisito produttore. Se uno dei rivelatori usati è MS, come qui, aggiungere 0,1% di acido formico per entrambe le fasi mobili A e B. </li><li> Impostare la HPLC componenti e rivelatori strumentali come illustrato in figura 2. Ciò richiede comoda posizione dei rivelatori relativi alla colonna in modo da ridurre al minimo il volume morto tra il rivelatore e colonna. La flessibilità nella configurazione del sistema HPLC è desiderabile. </li></ol> 2. Configurazione di UV-Vis e rivelatori MS <ol><li> Impostare il rivelatore UV-Vis per la lunghezza d&#39;onda desiderata in base al campione di interesse (ad esempio, 280 nm). </li><li> Impostare il rivelatore MS in modalità positiva per il conte Total Ion (TIC) analisi con il metodo di rilevazione Scansione completa. Anche regolare i seguenti parametri: MS conseguenza vaporizzatore temperatura 500 ° C, temperatura di 350 ° C capillare, gas guaina fissato a un tasso di 60 unità, il flusso di gas ausiliario40 e spazzare flusso di gas a 5 unità, e la tensione a spruzzo 3.5 kV. Queste impostazioni possono essere regolate in seguito per esigenze specifiche degli utenti dipendenti del campione analizzato. </li></ol> 3. Preparazione del 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl Radicale (DPPH •) reagente Configurazione di DPPH • sistema di rilevazione <ol><li> Pesare 25 mg di DPPH • e sciogliere in 250 ml di metanolo in un pallone tarato. </li><li> Aggiungere 250 ml di acido formico per il DPPH • reagente. Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Sonicare il pallone contenente il DPPH • reagente per 10 min. </li><li> Spurgare il DPPH • pompa con il preparato DPPH • reagente secondo il requisito del produttore. </li><li> Impostare il sistema DPPH • secondo la figura 2 collegando la linea di pompa all&#39;ingresso di un T-pezzo. </li><li> Allegare una bobina reazione microlitri 100 a the uscita del raccordo a T e collegare l&#39;altra estremità della bobina reazione al rivelatore. </li><li> Encase la bobina di reazione in un riscaldatore colonna e impostare la temperatura del riscaldatore colonna 60 ° C. </li><li> Impostare il DPPH • rivelatore UV-Vis a 520 nm. </li></ol> 4. Configurazione di FPF Colonna <ol><li> Collegare l&#39;ingresso della colonna PSF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare la porta centrale per il rivelatore MS, utilizzando una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare una porta periferica al rivelatore UV-Vis con una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare un&#39;altra porta periferica alla T-pezzo del sistema di rilevamento DPPH • usando una lunghezza di 15 cm di 0,13 mm id tubo. </li><li> Bloccare la porta periferica non utilizzata con un tappo di colonna. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea B - 100% metanolo (0,1% di acido formico). </li><li> Equilibrare la colonna con il 100% di metanolo cellulare phase per 20 minuti per un 4,6 millimetri id x 250 mm di lunghezza della colonna. Questo tempo è scalato in base alle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol> 5. Mettere a punto il Colonna FPF per la rilevazione Multiplexed <ol><li> Misurare la massa di almeno due recipienti di raccolta vuoti (uno per la porta collegata al rivelatore UV-Vis e uno per il DPPH • detector) usando una bilancia analitica. </li><li> Raccogliere fase mobile dalla UV-Vis e le porte DPPH • in due, recipienti separati di raccolta pre-pesati (5.1). Registrare il periodo di tempo per la raccolta. Raccogliere almeno 500 mg di solvente in ciascun recipiente. </li><li> Pesare i vasi di raccolta e determinare la massa di fase mobile. Data la densità del metanolo è 0,791 g ml -1, determinare il volume di fase mobile raccolti da ciascuna porta. </li><li> Per differenza, cioè, pompa portata nominale impostato meno la portata attraverso il DPPH • e UV-Vis Detectoluci di flusso r, determinano la portata al rivelatore MS. Esprimere ogni proporzione flusso come percentuale del flusso totale. Nota: Idealmente, le percentuali di flusso: la MS è 18% della portata totale, al UV-Vis 22%, al DPPH • rilevatore 60%. </li><li> Altrimenti, regolare le percentuali di flusso cambiando la contropressione sul rivelatore UV-Vis. Ad esempio, se il flusso di UV-Vis è troppo elevata, ridurre la proporzione aggiungendo aggiungere una sezione 15 cm di 0,13 mm id tubo all&#39;uscita del rivelatore UV-Vis. Quindi ripetere i passaggi da 5.1 a 5.5. </li></ol> 6. finali condizioni di impostazione <ol><li> Impostare la portata della pompa • DPPH reagente la stessa portata in uscita dal foro d&#39;uscita collegato al DPPH • rilevatore. Nota: La colonna PSF multiplex con UV-Vis, DPPH • e MS è ora pronto per l&#39;analisi. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo studio riguarda la caratterizzazione e la profilazione di caffè con HPLC con rilevamento multiplex impiegando una colonna parallela del flusso segmentato (FPF). Multiplexed HPLC utilizzando colonne PSF consente la caratterizzazione e identificazione di entità chimiche fondamentali riducendo la complessità dei dati del campione mentre ottenere un maggior grado di informazione specifica molecola in una frazione del tempo necessario utilizzando processi multi-rilevamento convenzionali. La colonna PSF permette non...

Colonne di tecnologia di flusso attivo Tecnologia di flusso attivo (AFT) colonne di cromatografia sono stati recentemente sviluppati per superare inefficienza in separazioni associati al flusso di eterogeneità 1-6 e anche per consentire il rilevamento multiplex. In questa particolare comunicazione abbiamo dettaglio il processo operativo del parallelo segmentato di flusso (PSF) colonna con rilevazione multiplex. I vantaggi funzionali chiave della colonna PSF sono: (1) il flusso dalla regione centrale radiale del letto della colonna è isolata dalla regione periferica o parete di flusso, (2) il volume di fase mobile che deve essere elaborata da una rilevazione fonte è ridotta, e le fonti (3) di rilevazione può essere canalizzato per espandere le informazioni campione senza instillare ritardi di rilevazione attraverso ogni processo di rilevamento, o successivamente che richiede la suddivisione di un flusso di corrente post-colonna 7,8. La caratteristica fondamentale nella progettazione della colonna PSF che consente undvantage di rilevamento multiplato è romanzo presa assieme raccordi e fritta. la figura 1 è una fotografia della colonna AFT rispetto ad una colonna convenzionale. È importante comprendere che il processo di scissione ottenuta utilizzando colonne flusso segmentato parallele non è la stessa corrente di flusso post-colonna splitting. In un flusso di flusso della colonna montante dividere l&#39;intera banda campione dal bordo anteriore alle estremità della coda viene campionato ugualmente (cioè, assialmente), in tal modo, ogni flusso flusso è uguale rispetto all&#39;efficienza e sensibilità; l&#39;entità della sensibilità quindi diviso per le spaccature numerici. In PSF, tuttavia, i campioni processo di scissione banda radialmente, non assialmente. Come tale, i campioni delle porte centrali all&#39;apice del picco - la regione più concentrata del picco. Così, la sensibilità ecco alto come il picco non è diluito dalla regione diffusa tailing. Il campione eluendo dalle porte periferiche non è così efficace come nel centrazona l, ma, dal momento che la banda viene campionato radialmente, piuttosto che assialmente, la larghezza del picco è più stretto sarebbe il caso di un processo di campionamento che divide il picco in direzione assiale, cioè, una scissione post-colonna. Quindi la sensibilità con un rivelatore dipendente dalla concentrazione non viene ridotta. Nella colonna PSF, il raccordo di uscita comprende più porte di uscita ed all&#39;interno di questo raccordo terminale è alloggiato un setto anulare. La parte interna di questo fritta canali anulari fuoriuscire colonna mediante la luce radiale scarico centrale, mentre la porzione radiale esterna dei canali di uscita di fritta fluire dalla colonna tramite le porte di uscita dell&#39;aria periferiche o regione di parete. Le porzioni interna ed esterna della fritta di uscita sono separati da una barriera impermeabile che impedisce il flusso di mezzo tra queste regioni di flusso 2. Come conseguenza di questo disegno flusso centrale flusso radiale attraverso il letto colonna viene separato dal flusso ins regione pareteide colonna. La porzione relativa di flusso da queste due regioni può essere variata a quasi qualsiasi rapporto desiderato attraverso la gestione della pressione al fine di ottimizzare vari aspetti funzionali della tecnologia delle colonne, come l&#39;efficienza di separazione o la sensibilità di rilevazione. In sostanza, questo disegno stabilisce in modo efficace all&#39;interno del formato più grande colonna di una colonna &#39;virtuale&#39;, con un diametro interno più stretto, e quindi alle funzioni per le colonne come una colonna muro-meno vero, superando colonna letto eterogeneità e gli effetti a parete 9,10. I principali vantaggi di colonne PSF sono miglioramenti dell&#39;efficienza colonna, la minimizzazione del trattamento solvente per la sorgente di rilevamento (s) e consentendo il rilevamento multiplexati. Tuttavia, un ulteriore vantaggio è che, poiché il tailing e regioni fronteggia di qualsiasi banda vengono rimossi dalla eluizione complessiva profilo soluto a eluizione o rilevamento è presente in concentrazione superiore rispetto verrebbero altrimenti osservati per gli stessi solute iniezione e concentrazione di carico su una colonna convenzionale, a seconda del rapporto di segmentazione impiegato. Di conseguenza vi è spesso osservato un aumento di intensità del segnale per le separazioni condotti su colonne PSF 2. Infatti, se il rapporto segmentazione è regolato in modo che il 25% delle uscite portate da ciascuna delle quattro porte di uscita, l&#39;intensità del segnale che si osserva con ultravioletti (UV) di rilevamento mostra praticamente la stessa intensità di segnale come risulta utilizzando un convenzionale colonna in cui tutto (100%) della fase mobile viene analizzata 7. Inoltre, la messa a punto del rapporto di uscita tra le regioni centrali e del flusso a parete permette l&#39;efficienza della colonna da ottimizzare. I guadagni di efficienza colonna osservati utilizzando colonne AFT non può essere indicato un singolo valore, poiché questi guadagni di efficienza sono una funzione di tre fattori: (1) la portata, (2) il rapporto di segmentazione, e (3) il fattore di ritenzione del soluto . Tuttavia, guadagni di efficienza rispetto a convcolonne entional sono quasi sempre osservati, e talvolta questi guadagni sono più di 100% del numero di piatti teorici 1,2. La possibilità di regolare il rapporto di segmentazione permette l&#39;analista di adattare efficacemente il diametro della colonna &#39;virtuale&#39;, e questo è un fattore importante in relazione al processo di rilevamento. Ad esempio, un diametro (id) colonna virtuale 2.1 mm interno è stabilito da un 4.6 mm di colonna id fisica quando il rapporto segmentazione è il 21% della fase mobile eluizione dalla luce radiale uscita centrale. In queste condizioni, il 2.1 mm colonna id virtuale esegue con un&#39;efficienza che può essere superiore al 70% maggiore della 2.1 mm di colonna id convenzionale, a seconda della portata, e soluti coefficiente di conservazione 10. La colonna disegno PSF corrente che viene utilizzato per il rilevamento multiplato incorpora una porta raccordo di uscita 4, ma la colonna può essere dotato di un 2-port end-montaggio anche, tuttavia, questo limita rilevamento to solo due rivelatori. Il funzionamento di base di queste colonne è, tuttavia, lo stesso, eccetto che quattro rivelatori possono essere accoppiati simultaneamente alla presa PSF colonna 4-port ampliando le possibilità di rilevamento multiplexati. Oltre a colonna tubo connettivo pre e post, gli unici requisiti supplementari per operare una colonna PSF è tubo che possono essere collegati alle porte di uscita periferici, e un mezzo con cui la quantità di fase mobile passa attraverso ciascun tubo può essere misurata, generalmente è una misura di massa o di una misurazione volumetrica. Per facilità di sintonizzazione, il diametro interno del tubo di flusso in uscita tutti dovrebbe essere lo stesso. Il rapporto di flusso tra le aperture di uscita centrali e periferiche radiali viene quindi variato attraverso l&#39;utilizzo di gestione della pressione, semplicemente cambiando la lunghezza del tubo si trova alla uscita periferica raccordo, o la lunghezza del rilevatore tubo posto sulla porta radiale uscita centrale. Multiplex Detection Uso di colonne PSF </strong&gt; Un importante vantaggio di colonne FPF è che ciascuna delle aperture di uscita di uscita può essere collegato direttamente a una sorgente di rilevamento, consentendo così la rilevazione multiplexati. In un sistema di rilevamento ben progettato una singola analisi con rilevamento multiplato può fornire informazioni sostanziali per quanto riguarda la natura dei componenti all&#39;interno del campione. È importante sottolineare che prove distruttive e non distruttive possono essere condotti esattamente nello stesso momento, senza ritardo di rilevamento. Questo consente l&#39;assegnazione di assoluto, ad esempio, antiossidanti utilizzando DPPH • reagente, con componenti osservate per eluire con la spettrometria di massa (MS) risposte di rilevamento 7,11 UV e / o. Pertanto, quattro rivelatori indipendenti possono essere azionati simultaneamente con porzioni appropriate di flusso diretto di ciascun rivelatore attraverso uno dei quattro fori di uscita. Poiché il flusso attraverso queste porte può essere facilmente regolata la quantità di soluto raggiungere qualsiasi dei rilevatori può essere regolata per adattarsila sensibilità del rilevatore data sorgente. Va notato, tuttavia, che la migrazione soluto più efficiente è osservata attraverso la porta di uscita centrale radiale. Ciascuna delle porte periferiche offrono efficienza di separazione equivalente, che se impostato al 25% attraverso ogni porta, è solo leggermente meno efficiente di una colonna convenzionale. Come tale, è importante che il rivelatore quantitativa essere impostato per analizzare campione dalla luce radiale uscita centrale. Quando si imposta una colonna PSF ai fini della rilevazione multiplexing ci sono una serie di considerazioni che devono essere fatte per ottenere risultati efficaci e di alta qualità; cioè dimensioni del tubo per ciascuna porta, scelta di quale porta per un tipo di rivelatore e regolazione del flusso. Dimensioni del tubo per ogni porta Nella cromatografia la lunghezza della tubazione della colonna montante svolge un ruolo cruciale nella efficienza e il rendimento della separazione. Grande Dead-volume come risultato di tubazione lunga o larga id dalla colonna di uscita al rilevatore si tradurrà in una perdita di efficienza, risoluzione e sensibilità. Così, adeguate dimensioni tubi devono essere utilizzati quando si imposta la colonna di PSF di raggiungere il massimo potenziale nella fornitura di separazione efficiente mentre fornendo i benefici di multiplexing. Porta a Detector La figura 2 è una illustrazione di un esempio di configurazione di rilevazione multiplex (Ultra Violet-visibile (U-Vis), spettrometro di massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH •) di rilevamento). L&#39;illustrazione mostra il porto centrale è collegata al rivelatore MS, mentre il DPPH • e rivelatori UV-Vis sono attaccati alle porte periferiche. Poiché la MS è il rivelatore più sensibile dei tre, flusso di questo rivelatore è stato diretto dalla luce di uscita centrale. Come DPPH • Rilevamento è selettivo alla Presence di antiossidanti, e la meno sensibile e più tollerante a banda allargamento, affluiscono a questo rivelatore è stato diretto da una porta periferica. L&#39;UV-Vis è un rivelatore secondaria &#39;generico&#39;, quindi fluire verso questo rivelatore è diretto da una seconda porta periferica. Regolazione del flusso Una volta che il tubo appropriata è stata collegata da una porta per rilevatore, la portata in uscita da ciascuno dei rivelatori può essere regolata al valore desiderato. Un modo semplice per misurare la quantità di portata in uscita ogni rivelatore è di valutare la quantità di fase mobile che eluisce attraverso ogni porta in un dato periodo di tempo. Il flusso percentuale può così essere determinato, ed i rapporti di flusso può essere regolato sia accorciare o allungare il tubo attaccato alla linea di uscita sui rivelatori di conseguenza per soddisfare le esigenze dei rivelatori di scelta. Diversi rivelatori hanno differenti esigenze di portata, per esempio, la cella di flusso diun rivelatore a fluorescenza (FLD) non viene portata limitata, ma la cura deve essere presa per evitare un eccesso di pressurizzazione della cella di flusso. Quindi il controllo del flusso attraverso il FLD è spesso ottenuta regolando la caduta di pressione attraverso gli altri rivelatori e il resto del flusso quindi attraversa il FLD. Un rivelatore sensibile alla quantità di flusso che viene consegnato è il MS. In generale, le attuali spettrometri di massa di fascia alta possono facilmente elaborare circa 1 a 1,5 ml / min di moderata acquosa fase mobile. Sopra tale portata, allagamento della sorgente può rendere i MS inutilizzabile. Tuttavia, la sensibilità di rilevazione nella maggior parte dei spettrometri di massa è beneficiato utilizzando portate inferiori; quindi le capacità di suddivisione dei flussi FPF sono estremamente utili per applicazioni che prevedono il rilevamento MS. Colonna alta flussi volumetrici possono essere utilizzati, ma con carichi bassi volumi trasportati al rivelatore MS. Regolazione del flusso al rivelatore MS, tuttavia, deve essere effettuato regolando la caduta di pressione primaMS rilevatore, piuttosto che pubblicare MS. Qui, l&#39;uso di un tubo del diametro ristretto (0,1 mm id) è molto utile, come la pressione può essere facilmente regolata senza aggiungere volume morto appropriato. A seconda del tipo di sensore della regolazione del rapporto di segmentazione può essere fatto rivelatore sia pre o post. Se un rilevatore non distruttivo, come viene usato UV-Vis, la percentuale di flusso sarebbe misurata e sintonizzato rilevatore postale. Se un singolo rivelatore distruttivo è utilizzato nel multiplex impostare la percentuale di flusso è determinato calcolando indietro rispetto ad altre percentuali di flusso porta. Se un rivelatore basato reagente viene utilizzato come DPPH • la percentuale portata viene misurata rilevatore post senza l&#39;aggiunta di reagente; e se si utilizzano due o più rivelatori distruttive, allora il rapporto portata viene misurata pre-detector. Detection sistemi che possono richiedere strumentazione aggiuntiva, come DPPH •, avrà pressione di sistema supplementari che possono alterare il flussopercentuale volta collegato al sistema di rivelazione. Pertanto, un attento esame deve essere rivolta alla pressione del sistema di un rivelatore distruttivo, quando si regola la percentuale di flusso pre-detector. Indipendentemente dal rapporto portata impostata attraverso una delle porte, informazioni quantitative dovrebbe essere ottenuto tramite la normalizzazione appropriata. Una volta che i rapporti di flusso sono impostati, tuttavia, sono robusti, e non cambiano anche in condizioni di eluizione a gradiente 7, Il protocollo video dettagliato che accompagna questo manoscritto ha lo scopo di mostrare come utilizzare e ottimizzare un funzionamento colonna di PSF in una modalità multiplex di rilevamento.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td>Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, pump.</td></tr><tr><td>Parallel Segmented Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.</td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td>Any brand</td><td></td><td>For blocking unused peripheral ports.</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr></tbody></table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Una analisi HPLC multiplexed è stata effettuata utilizzando una colonna AFT in modalità PSF (Figura 1) e configurato come illustrato nella figura 2. Questo tipo di configurazione ha permesso un campione di caffè da analizzare simultaneamente utilizzando UV-Vis, DPPH • e MS in totale Count Ion modalità (TIC). I composti del campione caffè che ha risposto a DPPH • potrebbero quindi essere facilmente abbinati agli UV-Vis e MS - risposte TIC b...

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K Views.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Chimica

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Tenda Colonna flusso: ottimizzazione dell&#39;efficienza e della sensibilità

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Citometria del flusso microfluidico di imaging mediante rilevazione asimmetrica Microscopia ottica di stretching (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Ingegneria

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

Un modulare tecnologia microfluidica per studi sistematici di nanocristalli semiconduttori colloidali

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Riepilogo

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