Gli autori desiderano ringraziare Joe Owen nello strumento Biomediche e Centro di lavorazione per il suo instancabile impegno nella lavorazione e l&#39;assemblaggio delle parti flusso da camera e Matt Maudsley da Leica Microsystems per aiutare nelle tecniche di celle di immagine attraverso camere di flusso. Siamo in debito con Kevin Collins da Servizi perfusione Duke e il dottor Steve Wallace presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica per i suggerimenti utili su progettazione del flusso di circuito. Vorremmo anche ringraziare la National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program per il supporto Alexandra Jantzen e il NIH per il loro sostegno attraverso Grant &quot;rivestimento EPC autologhe per migliorare la biocompatibilità dei dispositivi di assistenza circolatoria&quot; RC1HL099863-01.

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Il nostro circuito di flusso e camera di flusso permettono di soggetto cellule aderenti, EPC per esempio, alle sollecitazioni di taglio fluido definito. Dal momento che la parte superiore della camera e in basso sono trasparenti, l&#39;adesione cellulare e la morfologia possono essere valutati sia in tempo reale, attraverso la camera stessa, o dopo un esperimento di flusso e lo smontaggio della camera di flusso. A quel punto, le cellule possono essere raccolte in condizioni sterili e sia ri-placcato, o utilizzati per raccogliere il loro DNA o RNA, ecc, per ulteriori analisi. Per ottenere flusso laminare, il design della camera deve essere tale che diverse condizioni siano soddisfatte. In primo luogo, il flusso deve essere laminare, che può essere verificata calcolando il numero di Reynolds (Re), che è il rapporto di forze inerziali a forze viscose. (Se le forze viscose predominano, Re è piccolo e il flusso è laminare o &#39;completamente sviluppato&#39; - di solito per Re &lt;2300.Se le forze inerziali predominano, il flusso diventa sempre più casuale fino a quando non è turbolento, come nel caso di Re&gt; 4000.) Possiamo calcolare Re secondo l&#39;equazione 3 8, <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Dove ρ è la densità del fluido, Q è la portata, μ è la viscosità, w e h sono la larghezza e l&#39;altezza della camera, rispettivamente, e D h è il diametro idraulico, definito secondo l&#39;equazione 4 8, <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Il numero di Reynolds delle nostre camere flusso tre, con altezze che vanno dal 166-267 micron, range 13,9-34,6 ai tassi di flusso calculated per ottenere un sforzo di taglio di 15 dyne / cm 2. A portate calcolate per un sforzo di taglio di 100 dyne / cm 2, il numero di Reynolds delle camere variava dal 90,4-234. Tutti questi numeri di Reynolds sono molto inferiori a 2300 e soddisfare il criterio di flusso laminare. In secondo luogo, per il campo di velocità e di sforzo di taglio deve essere indipendente dalla distanza lungo il canale di flusso (cioè completamente sviluppate), la distanza dalla presa di scorrere fluido deve essere più lungo rispetto alla lunghezza d&#39;ingresso, e L. Questo può essere soddisfatta calcolando la lunghezza d&#39;ingresso, secondo l&#39;equazione 5 9. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Per i valori di cui sopra, la lunghezza d&#39;ingresso varia 0,01-0,25 cm. In terzo luogo, al fine di assicurare che la velocità e lo stress di taglio in direzione laterale non varianosignificativamente dal valore di unidimensionale del flusso del canale (Ph Δ / 2L), il rapporto h / w deve essere molto minore di 1. Per il carico medio di taglio a parete sotto bidimensionale condizioni di flusso per il 95% della sollecitazione di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,10, e per lo sforzo di taglio muro sotto bidimensionale condizioni di flusso da 97,5% dello sforzo di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,05. Con le dimensioni della nostra camera di flusso progettato 1,7 centimetri in larghezza e 166-267 micron di altezza, questi criteri sono soddisfatti. La pressione varia solo nella direzione del flusso se non ci sono gradienti di pressione laterale all&#39;ingresso. Questo può essere valutato utilizzando coloranti o particelle nel percorso del flusso. Inoltre, per esperimenti di flusso costante, un attenuatore delle pulsazioni è inserita nel circuito del flusso. L&#39;attenuatore delle pulsazioni tira fuori la maggior parte della pulsatility causato dalla pompa rullo nel circuito, e ci permette di approssimare l&#39;ipotesi di flusso costante. Da notare che il attenuatore delle pulsazioni utilizzati devono essere compatibili con la pompa e il tubo utilizzato nel circuito, in modo che possa effettivamente eliminare pulsazioni nel flusso di output per le frequenze specifiche della pompa rullo. Nella nostra dimostrazione L / S Masterflex ammortizzatore di pulsazioni raggiunge flusso laminare quando utilizzato sulla linea di scarico con qualsiasi M / L pompa serie Masterflex (0-600 RPM) e I / P 26 tubi. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d&#39;onda diverse. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d&#39;onda diverse. Inoltre, il circuito è progettato in modo tale che i campioni di perfusato possono facilmente essere raccolti in tempi diversi senza rischio di contaminazione delle cellule o media portata. Nel nostro esempio, la concentrazione di NO 2 - è stata misurata mediante chemiluminescenza conuno Ionics / Sievers Analizzatore di ossido di azoto (NOA 280, Strumenti Sievers, Boulder, CO), come descritto in precedenza 10. Il riducente utilizzato per l&#39;analisi è stata nitrito di ioduro di potassio in acido acetico (14,5 M di acido acetico e 0,05 M KI), che ha il potenziale di riduzione di convertire nitrito di NO, ma non è sufficiente a ridurre eventuali ossidi di azoto superiore come il nitrato ed è quindi relativamente specifici per nitriti. Il nitrito importo totale prodotta è stato calcolato come il prodotto della concentrazione prodotta e il volume totale del circuito durante la regolazione del volume perso, mentre il prelievo di campioni 6. I seguenti passaggi sono fondamentali per la riuscita di esperimenti di flusso: <ol class="lroman"><li> È auspicabile per evitare la formazione di bolle durante il flusso di set-up, dal momento che le bolle hanno il potenziale per strappare le cellule dalla loro superficie. Questo può essere evitato facendo attenzione a quando si posiziona la parte superiore della camera di flusso sulla parte inferiore, che è megliocompiuta tenendo entrambe parallele l&#39;una all&#39;altra e abbassando la parte superiore sul fondo in un unico movimento senza modifiche. In tal modo, piccole bolle d&#39;aria che possono essere presenti e / o galleggiante nel canale di flusso, sarà deviato nelle trappole bolla alle due estremità del contenitore in alluminio. </li><li> E &#39;importante assicurarsi che il tubo deflusso nel bacino raggiunge fino al fondo del serbatoio è. In caso contrario, l&#39;aria può essere risucchiato nel tubo che porta dal serbatoio alla camera se il livello scende leggermente al di sotto perfusato fine tubo. </li><li> Il ricercatore deve avere familiarità con la direzione del flusso della pompa in modo che la pompa non accidentalmente correre nella direzione opposta con l&#39;inizio del flusso, il che si tradurrebbe in aria risucchiata nel circuito e da camera. </li><li> Per evitare la formazione di schiuma (a causa di proteine ​​denaturate contenute nel siero), si consiglia di abbassare il tubo che porta dalla camera al serbatoio a circa un centimetro al di sopra del perfusate livello all&#39;interno del serbatoio. Tuttavia, mantenendolo al di sopra del livello medio di flusso consente di verificare il flusso nel serbatoio durante l&#39;esperimento. </li><li> Al momento di collegare le parti della camera insieme, è importante afferrare saldamente la custodia con una mano durante l&#39;utilizzo del cacciavite elettrico con l&#39;altra mano. Si noti che il movimento del cacciavite elettrico si tradurranno in una coppia che ha il potenziale di &#39;scagliare la camera intorno&#39; una volta che la vite è serrata. </li><li> Per evitare la formazione di onde di pressione nel circuito e il sollevamento delle cellule i loro superficie, in modo che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare il flusso. </li><li> Soprattutto per gli studi di flusso a più lungo termine (&gt; 48 ore) si consiglia di utilizzare il tubo più duro e più resistente di essere inserito nella testa della pompa per evitare rottura dei tubi. </li><li> E &#39;possibile che i tubi&#39; migra &#39;all&#39;interno della testa della pompa a causa di denti pompa mal regolata testa. Pertanto si consiglia attenzione a come la vascaING è fissato nella testa della pompa e la marcatura ogni estremità del tubo con un pennarello in modo tale che si può facilmente notare se il tubo è &#39;tirato in&#39; o staccato durante l&#39;esperimento. </li><li> Sempre verificare attentamente ogni singolo connettore del circuito e da camera prima di iniziare la perfusione al fine di evitare perdite di perfusato durante un esperimento a causa di un collegamento difettoso. Ciò è particolarmente importante per i connettori di afflusso e deflusso di smorzatori di impulsi! </li><li> Ricordatevi di limitare l&#39;esposizione alla luce se si utilizzano etichette fluorescenti. </li></ol> Una limitazione possibile della nostra camera di flusso è che l&#39;altezza è fissata per l&#39;altezza del canale lavorati in alluminio. Tuttavia, questo ha il vantaggio di non dover verificare e regolare l&#39;altezza del canale prima di ogni esperimento e semplifica quindi i calcoli sforzo di taglio, semplicemente regolando la portata della pompa al valore desiderato. A seconda degli obiettivi della ricerca, può essere auspicabileaumentare la tensione di taglio senza aumentare la velocità della pompa. In questo caso si consiglia di aumentare la viscosità del perfusato è, ad esempio l&#39;aggiunta di destrano al medium 11. Una possibile limitazione del circuito flusso è il grande volume di mezzo utilizzato, che può essere problematico quando si tenta di quantificare le concentrazioni molto piccole di metaboliti cellulari. Anche se non qui, è possibile ridurre considerevolmente il livello del circuito utilizzando un serbatoio più piccolo e attenuatore delle pulsazioni e diminuire lunghezza del tubo e il diametro. Inoltre, ci sono parecchi altri sistemi disponibili in commercio che possono essere utilizzati per applicare liquidi shear stress alle cellule in coltura. Microfluidica sistemi basati, ad esempio il sistema BioFlux da flussione, consentono analisi simultanea di cellule in diversi canali di flusso microfluidica caricato con soluzione in pozzetti in qualità di ingresso e di uscita serbatoi per questi canali 12,13,14. Tuttavia, queste e altre microsistemi fluidici non sono compatibili con vetrini da microscopio standard e non consentono il recupero di un numero sufficientemente ampio di celle per ulteriori esperimenti, come la RT-PCR o Western Blot. Inoltre, sono meno user-friendly, un costo minimo di $ 40.000 e possono raggiungere un totale di più di 100.000 dollari, a seconda del materiale accessorio. Due sistemi macrofluidic disponibili dall&#39;Aeroporto Internazionale di Flexcell Corporation, lo Streamer Flexcell ei sistemi FlexFlow, sono stati utilizzati con successo per studiare le cellule endoteliali 15,16,17, cellule umane anello 18 e 19 fibroblasti in condizioni di flusso del fluido. Un terzo sistema, disponibile attraverso GlycoTech, è stato utilizzato per studiare l&#39;adesione delle cellule tumorali 20 e l&#39;adesione dei leucociti da 21 a monostrati endoteliale. Il sistema Streamer consente diverse diapositive per essere eseguito nelle stesse condizioni di stress di taglio in una sola volta, ma manca di un valore e - a differenza dei nostridesign - non consente visualizzazione in tempo reale delle cellule in condizioni di flusso. Il sistema FlexFlow ha una finestra di visualizzazione, ma richiede un microscopio verticale, che potrebbe non essere il microscopio standard utilizzato nella maggior parte dei laboratori. Inoltre, il sistema FlexFlow richiede una cella rivestita vetrino per essere invertita, quando sono immessi nella camera di flusso. Questo impedisce la visualizzazione di cellule fluorescenti su una superficie opaca, come il titanio rivestita di vetro, che dimostriamo nel nostro studio. Infine, il copri-specialistici devono essere acquistati appositamente per il sistema FlexFlow, che si trova nella multi-mille dollari fascia di prezzo, simile al sistema Streamer Flexcell. GlycoTech offre circolari e rettangolari a piatti paralleli camere di flusso, che sono significativamente meno costoso, ma realizzati in acrilico, colato, che non possono essere comodamente staminali in autoclave come la nostra camera. Da segnalare, camere flusso altre che sono state descritte da autoclavabiliapparire impraticabile perché richiedono particolari lenti microscopiche 22,23. Il sistema utilizza GlycoTech guarnizioni in gomma di silicone interposto tra le piastre superiore e inferiore, che cambierà di spessore con l&#39;uso ripetuto e quindi modificare l&#39;altezza della camera nel corso del tempo (il produttore consiglia l&#39;acquisto di nuovi dopo ogni dieci usa). La nostra camera di alluminio con built-in o-ring permette di opposizione completa di piastre superiore e inferiore e garantisce un&#39;altezza costante camera tra esperimenti. Infine, pompe a vuoto sono necessari per ottenere una tenuta guarnizione in molti disegni camera di flusso, tra cui le camere GlycoTech, che non sono necessarie nel nostro design. Considerando che non qui, la camera di flusso può essere tenuta sotto un microscopio durante l&#39;esperimento intero flusso di imaging in tempo reale di adesione cellulare e / o comportamenti. Se questo è desiderato, si consiglia di utilizzare lampade a calore o un tappetino riscaldato sotto la camera per mantenere la temperatura perfusato a 37 ° C. Pelliccialì, la pompa rullo può essere sostituita con una pompa a siringa, se no &#39;riciclo&#39; di due cellule o metaboliti o farmaci sperimentali o agenti si desidera 24. E &#39;anche possibile flusso di cellule diversamente etichettato più di cellule aderenti, ad esempio le piastrine fluorescenti su uno strato di EPC confluenti (usando il test delle piastrine descritto da Achneck et al. 6,25) per valutare cellula-cellula interazione in condizioni di stress di taglio fluido. La nostra camera di flusso combina caratteristiche di valore delle altre camere di flusso disponibili, ad esempio una porta di campionamento perfusato e una finestra di visualizzazione e ha l&#39;importante vantaggio di compatibilità sia con un microscopio invertito o verticale. E &#39;completamente autoclavabile e permette di esperimenti ripetuti in altezza della camera costante e senza la necessità di pompe per vuoto ad ottenere una tenuta stagna.

<table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti / reagenti </td><td> Azienda </td><td> Prodotto # </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Siringa </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Rubinetti </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> In lega di alluminio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cell-Cultura Piatti (4-bene, rettangolare) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Cellula Tracker Arancio </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Ricerca Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Femmina Adattatore Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Bottiglia di vetro (250 ml) con Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubi duro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> HISTOPAQUE </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Soluzione Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adattatore Maschio Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Media </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Raccordi in polipropilene spinato </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dampener </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pompa-Drive (Masterflex L / S azionamento a velocità variabile economia) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pompa-Head (Masterflex Facile testa della pompa di carico) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Scivolo </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubo morbido </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Siringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Tripsina soluzione neutralizzante </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una tecnica per soggetto cellule aderenti alle condizioni di flusso laminare e valutare la loro risposta al taglio fluido ben quantificabili sottolinea 1. Il nostro design camera di flusso e flusso del circuito (Fig. 1) contiene una regione trasparente visualizzazione che consente la sperimentazione di adesione cellulare e l&#39;imaging di morfologia cellulare immediatamente prima del flusso (Fig. 11A, B), in vari momenti durante il flusso (Fig. 11C) , e dopo che il flusso (Fig. 11D). Questi esperimenti sono illustrate con cordone ombelicale umano derivati ​​dal sangue le cellule progenitrici endoteliali (EPC) e suina EPC 2,3. Questo metodo è applicabile anche ad altri tipi di cellule aderenti, ad esempio, cellule muscolari lisce (SMC) o fibroblasti. La camera e tutte le parti del circuito sono facilmente sterilizzati in autoclave a vapore. A differenza di altriCamere, ad esempio camere di microfluidica, un gran numero di cellule (&gt; 1 milione a seconda delle dimensioni della cella) può essere recuperato dopo l&#39;esperimento di flusso in condizioni sterili per colture cellulari o di altri esperimenti, come ad esempio l&#39;estrazione del DNA o RNA, o immunoistochimica (Fig. 11E), o microscopia elettronica a scansione 5. La tensione di taglio può essere regolata variando la portata del perfusato, la viscosità del fluido, o l&#39;altezza e la larghezza del canale. Quest&#39;ultima può ridurre il volume di liquidi o ha bisogno di cellule assicurando nel contempo che unidimensionale del flusso viene mantenuta. Non è necessario misurare l&#39;altezza della camera tra esperimenti, dal momento che l&#39;altezza della camera non dipende l&#39;uso di guarnizioni, che aumenta notevolmente la facilità di esperimenti multipli. Inoltre, il design del circuito consente facilmente la raccolta di campioni perfusato per l&#39;analisi e / o la quantificazione di metaboliti secreti dalle cellule del liquido sotto esposizione shear stress, ad esempio, l&#39;ossido nitrico (fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L&#39;adesione delle cellule &#39;, morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l&#39;analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l&#39;esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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43.2K Views.  Duke University Medical Center. Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L'adesione delle cellule ', morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l'analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l'esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

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A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

La stampa Sommerso di celle su una superficie modificata utilizzando un flusso di Microspotter continua

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow Camera

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Frazionamento asimmetrico del flusso campo-flusso per il dimensionamento delle nanoparticelle d'oro in sospensione

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imaging del flusso sanguigno con Doppler ultraveloce

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...