Name: post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Attenzione: Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell&#39;uso (ad esempio, scheda di sicurezza per il metanolo). Garantire l&#39;uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante la manipolazione di solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida eluente (HPLC). Garantire un uso appropriato di controlli tecnici di HPLC, analitica equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse). Nota: Questo protocollo descrive 3 modi di flusso di reazione derivatizzazione post-colonna (RF-PCD) tecniche, ciascuna con un reagente diverso specifico per la natura di un composto chimico di interesse. Per l&#39;analisi del ROS vai alla sezione &quot;1. Rilevamento di ROS utilizzando DPPH •&quot;, per l&#39;analisi delle ammine primarie vedere la sezione &quot;2. Individuazione di ammine primarie con fluorescamina&quot;, e per l&#39;analisi dei composti fenolici andare alla sezione &quot;3 . rilevamento di fenoliusando 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio &quot;. Utilizzare acqua ultra-pura (ad esempio, acqua Milli-Q) in tutto. Nota: Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC. 1. Rilevamento di ROS Utilizzando DPPH • <ol><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparazione dello strumento HPLC con 100% di acqua sulla linea A e 100% metanolo sulla linea B come fase mobile. Eliminare le pompe secondo i requisiti del produttore. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A. </li><li> Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d&#39;onda di 520 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto dicolonna RF <ol><li> Collegare l&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porto periferico di uscita al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubi id. </li><li> Collegare il DPPH • linea di pompa ad una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Bloccare la porta periferica inutilizzata sull&#39;uscita della colonna RF con un tappo di colonna. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea B - 100% metanolo. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile metanolo 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo deve essere scalata in base alle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del DPPH • reagente <ol><li> Preparare una soluzione / ml 0,1 mg di DPPH • in metanolo. </li&gt; <li> Sonicare il pallone contenente il DPPH • reagente per 10 min. </li><li> Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Spurgare la pompa DPPH • con il preparato DPPH • reagente secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Mettere a punto il uscita della colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Pesare nuovamente la nave porto centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue: Peso di Port centrale (g) = peso finale di Port Central Vessel (g) - peso iniziale di Port Central Vessel (g) </li><li> Ripetere i punti 1.4.2 e 1.4.3 per l&#39;effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per la nave porta periferica comesegue: Peso di porta periferica (g) = peso finale della porta periferica Vessel (g) - peso iniziale della porta periferica Vessel (g) </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue: % Port Centrale = Peso di Port centrale (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100 % Porta periferica = Peso della porta periferica (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100 </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 30:70 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore a 30%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all&#39;uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è inferiore al 30% diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio da 1.4.1 a 1.4.6 fino a un rapporto di segmentazione di 30:70 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata del DPPH • Pompa reagente per 0,5 ml min -1. Nota: La colonna RF impostato con DPPH • reagente è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, fermare il flusso pompa derivatizzazione reagente. </li><li> Rimuovere il DPPH • linea di pompa del reagente dalla porta periferiche e si chiude il porto. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC. </li><li> Sostituire il DPPH • reagente con metanolo e spurgare la pompa aggiuntiva. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol> 2. Rilevamento di ammine primarie Uso flammina <ol><li> Preparazione della fase mobile <ol><li> Preparare 1 L di una soluzione di acetato di ammonio 10 mM, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume. </li><li> Aggiungere 52,6 ml di acetonitrile (ACN) al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95:05 (buffer: ACN). </li></ol></li><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa secondo i requisiti del produttore. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A. </li><li> Fissare una bobina attenuatore di pulsazioni alla pompa derivatizzazione. </li><li> Set-up rivelatore di fluorescenza (FLD) con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 390 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 475 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Collegare °e all&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porta periferica all&#39;uscita della colonna RF al rivelatore FLD usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare la linea pompa derivatizzazione ad una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Bloccare la porta periferica inutilizzata sull&#39;uscita della colonna RF con un tappo di colonna. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea A - 10 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% ACN. </li><li> Equilibrare la colonna con la linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente fluorescamina <ol><li> Rendere 100 ml di 0,1 mg ml -1 fluorescamina reagente. </li> &lt;li&gt; ultrasuoni per 1 min. </li><li> Coprire con un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Spurgare la pompa del reagente con il reagente fluorescamina preparato secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Mettere a punto il uscita della colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3. </li><li> Ripetere i punti 2.5.2 a 2.5.3 per l&#39;effluente uscire dal FLD che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4. </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5. </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e perifericaflusso è 43:57 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è sopra 43%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all&#39;uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è sotto 43%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio 2.5.1 a 2.5.6 fino a un rapporto di segmentazione di 43:57 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata della pompa fase mobile a 0,7 ml min -1. </li><li> Impostare la pompa derivatizzazione a scorrere a 0,1 ml min -1. Nota: La colonna RF impostato con il reagente fluorescamina è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, arrestare la pompa derivatizzazione. </li><li> Rimuovere la riga pompa derivatizzazione dalla porta periferiche e tappo. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile inquale deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile. </li><li> Sostituire il reagente fluorescamina con acetonitrile e spurgare la pompa derivatizzazione. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol> 3. Rilevamento di fenoli con 4-Aminoantipyrene e Potassio ferricianuro <ol><li> Preparazione della fase mobile <ol><li> Preparare 1 L di una soluzione di 100 mM di acetato di ammonio, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume. </li><li> Aggiungere 52,6 ml di metanolo al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95: 5 (buffer: metanolo). </li></ol></li><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa come da produttore &#39;; S requisiti. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e le due pompe reagenti supplementari come illustrato in Figura 4B. </li><li> Attaccare una bobina attenuatore di pulsazioni a ciascuna delle pompe reagenti. </li><li> Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d&#39;onda di 500 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Collegare l&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porta periferica all&#39;uscita della colonna RF al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare ciascun reagente (cioè, 4-aminoantipyrene e ferricianuro di potassio) linea di pompe a una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea A - 100 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% di metanolo. </li><li> Equilibrare la colonna wesima linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente 4 aminoantipyrene <ol><li> Preparare un tampone di acetato di ammonio con un pH di 9, seguendo passo 3.1.1. </li><li> Pesare 150 mg 4 aminoantipyrene e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio preparati (pH 9). </li><li> Con ultrasuoni per 1 min. </li><li> Coprire con un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Eliminare la prima pompa reagente con il preparato Reattivo 4 aminoantipyrene secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Preparazione di potassio reagente ferricianuro <ol><li> Pesare 150 mg di ferricianuro di potassio e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio (pH 9) preparati secondo passo 3.1.1. </li><li> Con ultrasuoni per 1 min. </li><li> Copertura in foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Purge la seconda pompa reagente con il preparato reagente ferricianuro di potassio secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3. </li><li> Ripetere i punti da 3.6.2 a 3.6.3 per l&#39;effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4. </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5. </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 50:50 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore al 50%, diminuire laquantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id al porto centrale di uscita. Se il flusso centrale è inferiore al 50%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio 3.6.1 a 3.6.6 fino a un rapporto di segmentazione di 50:50 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata della pompa 4 aminoantipyrene a 0,5 ml min -1. </li><li> Impostare la portata della pompa ferricianuro di potassio 0,25 ml min -1. Nota: La colonna RF istituito con i reagenti bicomponenti è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati corsa è terminata, indicando che la corsa è terminata, fermare entrambe le pompe reagenti. </li><li> Rimuovere le linee della pompa del reagente dalle porte periferiche e sostituirli con un 15 centimetri pezzo di tubo 0,13 millimetri. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile in WHIch esso deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC. </li><li> Sostituire entrambi i reagenti sul reagente pompe con metanolo ed eliminare le pompe supplementari secondo il requisito del produttore. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD consente la miscelazione efficiente del reagente derivatizzazione con l&#39;effluente post-colonna HPLC senza l&#39;uso di bobine di reazione, minimizzando gli effetti di banda allargamento e migliorando le prestazioni di separazione. Metodi RF-PCD hanno anche mostrato miglioramenti nella risposta del segnale rispetto al metodo di rilevazione. Camenzuli et al. 28 è stato il primo a segnalare l&#39;uso di colonne di flusso di reazione con DPPH • per la rilevazione di ROS in un cam...

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con la colonna montante derivatizzazione (PCD) è un potente strumento che è utile a risolvere una serie di questioni nel laboratorio di analisi. Può essere usato per rilevare composti che sono altrimenti non rilevabili con la serie di rivelatori disponibili 1,2, aumentare il segnale dell&#39;analita bersaglio, che permette limiti inferiori di rivelazione e quantificazione 3-5 o selettivamente derivatize un analita bersaglio per evitare effetti di matrice 6. Reazioni PCD comunemente usati includono la reazione di ammine, come aminoacidi, con orto-phthaladehyde 7-9, ninidrina 9,10 o fluorescamina 11,12, la derivatizzazione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) con il 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicali (DPPH •) 13,14 o 2,2&#39;-Azino-bis (acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico (ABTS) 15,16, e l&#39;uso del reagente ioduro-azide per derivatize zolfo ccomposti ontaining 17,18. Vi sono, tuttavia, numerosi inconvenienti all&#39;utilizzo di reazioni PCD con sistemi HPLC 6. Principalmente fra questi è l&#39;uso di bobine di reazione tra il punto di aggiunta del reagente di derivatizzazione (s) e il rilevatore, che consentono il tempo per la miscelazione e la reazione avvenga 8. Questi reazione loop spesso hanno volumi di 500 ml o più, che è significativo rispetto al volume del resto del sistema HPLC 19. L&#39;uso di questi reazione alto volume passanti comporta un&#39;accresciuta allargamento di picco rispetto a quello che sarebbe osservata senza la presenza del ciclo di reazione. Ciò si traduce in brevi picchi più ampi che hanno limiti superiori di quantificazione e rilevazione e negativamente effetti risoluzione cromatografica. Figure 1 e 2 evidenziare il deterioramento della forma del picco che risultano dalla somma dei vari postale colonna volumi ciclo di reazione. Questa analisiè stata eseguita con un cellulare composizione di fase di 94% metanolo e 6% di acqua Milli-Q. La portata della fase mobile era 1 ml / min, il volume di iniezione era di 20 microlitri e la lunghezza d&#39;onda di analisi era 265 nm. Bobine di varia volumi morti da 20 ml a 1000 ml sono stati inseriti fra la colonna ed il rivelatore per simulare gli effetti di ciclo reazione volume morto nei metodi PCD. Questi cicli sono stati preparati da tubi di acciaio inossidabile di diametro interno 0,5 mm. L&#39;esperimento è stato eseguito su un sistema HPLC costituito da un controllore (SCL-10AVP), una bassa pressione gradiente valvola (FCL-10ALVP), una pompa (LC-20AD), un iniettore (SIL-10ADVP), ed un rivelatore PDA ( SPD-M10ADVP). La fase mobile è stata pompata attraverso un sistema di degasaggio prima dell&#39;introduzione nel sistema HPLC. La separazione è stata effettuata utilizzando un x 4.6 mm di diametro 5 micron colonna di 250 mm. Le condizioni sperimentali sono stati scelti per essere tipico delle reazioni PCD che sono stati recentemente pubblicati in letteratura. Ilsemplice, più comune alberino configurazione reattore a colonna è definito un reattore tubolare non segmentato che è effettivamente un tubo lungo e sottile attraverso il quale il liquido può fluire e la reazione può avvenire. In questo picco sistema allargamento dipende non solo il volume morto aggiunto al sistema, ma anche il diametro interno del tubo, come evidenziato da Iijima et al. 8. Inoltre, la geometria della bobina gioca un ruolo nella ampliamento marchio osservato. Stewart 20 affermato che l&#39;avvolgimento del reattore cambia i profili di flusso secondario, con conseguente migliore miscelazione, il che significa che il volume morto può essere minimizzato. E &#39;stato affermato che il picco allargamento non è significativo se si utilizza un tubolare aperto maglia della bobina 21. Quando l&#39;allargamento picco è troppo grande, altri tipi di reattore possono essere considerati 20,22. Questi possono includere reattori a letto o reattori flusso segmentati. Questi reattori sono particolarmente utili per le reazioni lente che altrimenti require grande reazione loop. Come non segmentati reattori tubolari sono i tipi più comuni di reattori utilizzati in applicazioni PCD, il resto di questa voce con questo tipo di configurazione del reattore. Il disegno della colonna flusso di reazione (RF) comprende un raccordo terminale multi-porta che permette fase mobile per uscire (o entrare) della colonna attraverso un singolo porto situato nella zona centrale radiale della colonna o tre porte situata al esterno regione di parete della colonna (vedi Figura 3). Questi due flussi sono separati usando un raccordo terminale contenente una fritta porosa centrale che è circondato da un anello impermeabile che è a sua volta circondato da un setto poroso esterna che si estende verso la parete della colonna. A causa del flusso anello trasversale impermeabile centrale non è possibile tra le due zone porose. Durante reazione cromatografia flusso, il reagente di derivatizzazione (s) vengono pompati contro la direzione del flusso della fase mobile in uno o two delle porte esterne della colonna flusso di reazione. L&#39;eluente colonna viene miscelato con il reagente di derivatizzazione (s) in fritta esterno e passa al rivelatore tramite una porta esterna libera. flusso di reazione può essere utilizzato sia per una derivatizzazione reattivo unico (1 porta per il reagente derivatizzazione, 1 porta per passare l&#39;eluente della colonna al rivelatore e 1 porta bloccata) oppure un sistema di reagente doppio (2 porte per i reagenti di derivatizzazione e 1 porta ad passare l&#39;eluente della colonna al rivelatore). Il flusso dal flusso centrale può essere utilizzato sia per rilevare eluente colonna underivatized, efficace rilevamento multiplexing 23, o passato sprecato. Un importante tecnica sintonizzazione che è disponibile quando si esegue RF-PCD cromatografia è il rapporto tra i flussi centrali e periferici. Il rapporto ottimale per ogni derivatizzazione dipende da una serie di fattori come se il flusso centrale sarà rilevato o passato a perdere. Pertanto una volta che il rapporto ottimale è stato determinato, Occorre garantire che il rapporto corretto flusso è ottenuta prima di essere eseguita ogni corsa. Si è trovato che l&#39;uso di una fritta di mescolare il flusso della colonna eluente ed il reagente derivatizzazione in RF-PCD risultati in miscelazione più efficiente rispetto alle tecniche di miscelazione tradizionali che impiegano tipicamente un raccordo a T di zero volume morto o volume morto partire W- pezzo per mescolare i due flussi. Ciò ha permesso l&#39;uso di relativamente piccoli cicli di reazione, o addirittura l&#39;eliminazione del ciclo di reazione del tutto. La riduzione dei risultati di reazione formato loop in picchi più rispetto ai metodi tradizionali di derivatizzazione post-colonna. Ciò significa che, nonostante il fatto che non tutti dell&#39;eluente colonna viene derivatizzato, maggiore rapporto segnale rumore sono osservati e limiti quindi minori di rivelazione e quantificazione può essere raggiunto. cromatografia flusso di reazione è stata sviluppata per superare le difficoltà con l&#39;adattamento reazione PCDs alle moderne colonne HPLC e sistemi, in particolare la perdita di efficienza causata da banda ampliando causa di grande colonna montante volumi morti dovuti alla necessità di impiegare grandi volumi di reazione loop. I processi di miscelazione più efficienti in RF-PCD rispetto al PCD convenzionale significa che i volumi del ciclo di reazione più piccoli possono essere impiegati portando ad un aumento di efficienza di separazione osservata. Inoltre RF-PCD cromatografia mostra sia il segnale aumentata e diminuita rumore rispetto alle tecniche convenzionali PCD con conseguente limiti inferiori di rilevazione e quantificazione rispetto ai metodi convenzionali PCD. Un ulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare il flusso underivatized che eluisce dalla porta centrale della colonna RF nonché il flusso derivatizzato che eluisce dalla regione periferica della colonna. RF-PCD è una relativamente nuova, ma promettente tecnica che consente di visualizzare molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali PCD. <p class="jove_content"&gt; Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Il primo metodo PCD che è stato adattato per l&#39;utilizzo da RF-PCD era la derivatizzazione di antiossidanti utilizzando la 2,2-difenil-1-picrylhydrazil radicale (DPPH •) 24. Questa reazione è stato introdotto da Koleva et al. 25 ed è stato ampiamente utilizzato fin. Il rilevamento si basa sulla decolorazione del DPPH • radicalico in presenza di specie reattive dell&#39;ossigeno, quindi, la presenza di antiossidanti risultati in una goccia assorbanza osservat...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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Chemistry

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Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K Views.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Ricerca

Chimica

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Tenda Colonna flusso: ottimizzazione dell&#39;efficienza e della sensibilità

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. Here we introduce a robust, reproducible and inexpensive protocol for preparation of a nano-flow reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) columns for on-line separation of analytical peptides before introduction into and detection by a mass-spectrometer in traditional bottom-up proteomics workflows. Depending on the goal of the experiment and the chemical properties of the analytes being separated, optimal column parameters may differ in their internal or outer diameters, length, particle size, pore size, chemistry of stationary phase particles, and the presence or absence of an integrated electrospray emitter at the tip. An in-house column packing system not only enables the rapid fabrication of columns with the desired properties but also dramatically reduces the cost of the process. The optimized protocol for packing a C18 AQ (aqueous) fused silica column discussed here is compatible with a wide range of liquid chromatographic instruments for achieving effective separation of analytes.

Here, we present and evaluate a protocol for making low cost reversed phase nano-flow liquid chromatography columns for peptide characterization using LC-MS/MS proteomic workflows.

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. ...

Biochimica

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Semplice produzione interna di colonne capillari ad altissime prestazioni con l'approccio FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

Didattica

JoVE Science Education

Chimica analitica

Column Chromatography

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

Cromatografia su colonna

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This ...

Chimica organica

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

Principi della cromatografia su colonna

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

Cell Biology

Analyzing Cells and Proteins

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Types Of Column Chromatography

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating parameters such as pH, temperature, or solvent affect the packing of the column material, thereby determining the purification efficiency. The choice of column material also plays an essential role in deciding the operating parameters and can be modified based on the proteins that need to be purified.
Gel Filtration Chromatography 
When the protein&#39;s chemical nature is unknown, gel filtration chromatography is used for purification based on size. Matrices such as agarose, polyacrylamide, dextran derivatives, or silica beads are used for low-pressure systems, whereas polymeric resins are used for higher flow rates. The varying degree of cross-linking of these polymeric materials determines the pore size of the matrix, which decides the size range of proteins that can be separated.
Ion Exchange Chromatography
Ion-exchange chromatography can purify proteins based on their net charge at a particular pH determined by their isoelectric point or pI. The net charge on matrix resin is used to purify oppositely charged proteins by replacing the cations or anions from the matrix resin with the charged proteins. The resins are categorized based on the type of ion that is exchanged &#8212; positively charged proteins replace cations from cation-exchange resins, and vice versa. Strong ion exchangers with stability over a wide range of buffer pH include quaternary ammonium, sulfonate, and sulfopropyl resins. In contrast, weak ion exchangers that are effective only in a narrow pH range include diethyl aminoethyl (DEAE) or carboxymethyl (CM) resins.
Affinity Chromatography
Affinity chromatography involves immobilizing protein-specific antibodies or enzyme-specific substrates to the column material, usually agarose beads. For example, a column with the immobilized antibody of choice is prepared to separate specific antigens. When the mixed antigen sample is passed through the&#160; column, the target antigens bind to the immobilized antibodies and separate from the mixture. To separate recombinant proteins tagged with enzymes such as beta-galactosidase, the corresponding substrate Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is immobilized on the column to purify the enzyme.
High-pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) are the most commonly used column chromatography techniques. In HPLC, the solvent flows at high pressure through a tightly packed column that improves efficiency. Gas chromatography analyzes volatile compounds by converting them to their gaseous forms upon heating. The volatilized sample is pushed through the column by inert gasses such as nitrogen and helium.

Tipi di cromatografia su colonna

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating ...

High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

Cromatografia liquida ad alte prestazioni: Introduzione

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