Name: assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
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The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le normative UK Home Office e sono approvati dalla Ethical Review Panel Cambridge. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Impostare accoppiamenti cronometrate con 8-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 topi con maschi adulti (fino a 2 femmine per ogni maschio) nel pomeriggio. Verificare la presenza di tappi vaginali come segno di copulazione prime ore del mattino nei giorni seguenti. La presenza di un plug nella mattina marchi gd0.5. </li><li> Su gd9.5, eutanasia dell&#39;animale da dislocazione cervicale e aprire la cavità addominale. Si noti che l&#39;eutanasia da CO 2 può causare vasodilatazione. </li><li> Utilizzare il filo interdentale per legare delicatamente le arterie uterine (Figura 1, frecce tratteggiate). Legare il filo intorno alle arterie sulla punta di ogni corno uterino, prossimale alle ovaie, così come intorno alla cervice. Nota: Non rompere i vasi in quanto ciò potrebbe causare arterie crollate. </li> &lt;li&gt; sezionare il utero rapidamente utilizzando forbici dissezione, ablazione del tutto utero distale ai tre punti legatura sulla punta delle corna uterine e la cervice. </li><li> Posizionare l&#39;utero su un pezzo di polistirene preparato in modo che entrambe le corna sono allineati lungo il medesimo asse lungo in direzioni opposte dalla cervice. Allungare delicatamente e pin in posizione 25 con 2-3 aghi G. </li><li> Immergere il polistirolo in un tubo da 50 ml preparati. Top fino a 50 ml con formalina al 10%. Fix per 5-6 ore a temperatura ambiente. </li><li> Scartare la soluzione di formalina e sostituire con 50 ml 1x tampone fosfato salino (PBS) per 5 min. </li><li> Accise le due corna uterine prossimale al punto legatura a ciascuna estremità prossimale e al collo dell&#39;utero, nel centro, tagliare l&#39;eventuale eccesso di grasso intorno ai siti di impianto e lavare due volte in PBS per 5 minuti per rimuovere le tracce di formalina. </li><li> Conservare i campioni in etanolo al 70% a 4 ° C (per due settimane) fino all&#39;elaborazione. ATTENZIONE: EthAnol è altamente infiammabile. </li><li> Utilizzare un sistema di trattamento automatizzato utilizzando i parametri indicati in tabella 1. Incorporare le corna singolarmente in paraffina modo che possano essere tagliati lungo il piano perpendicolare all&#39;asse lungo dell&#39;utero. Questo assicura che l&#39;area massima di ogni sito implantologico verrà esposta per analisi nel mezzo del blocco (Figura 2A). OPTIONAL: Questo è un punto di tempo comodo per randomizzazione dei blocchi se lo si desidera. </li><li> Utilizzando un microtomo, tagliare sezioni seriali di 7 micron di spessore dai blocchi. Macchia una sezione ad ogni intervallo di 49 micron con ematossilina e eosina (H &amp; E, vedere paragrafo 2.1). Conservare le restanti sezioni a temperatura ambiente per SMA colorazione e altre applicazioni a valle. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Soluzione </td><td style="width:43px;"> Orario<html></td><td style="width:97px;"> Temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Impostazioni per la lavorazione dei tessuti automatizzata Panoramica di regolazione usate per la lavorazione di tessuto uterino 2. SterValutazione eological <ol><li> H &amp; E colorazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack scorrevole in un bagno di xilene 100% per 10 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: xilene è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Questo lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante, utilizzando i dispositivi di protezione individuale (DPI). </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in 50% Gill Nessuna soluzione ematossilina 3, diluita con acqua purificata, per 5 min. ATTENZIONE: ematossilina è nociva per ingestione e contatto per gli occhi. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Lavare i vetrini in una vaschetta di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> Immergere i vetrini in 1% soluzione di acido / alcol (1% di acido cloridrico al 10 M in etanolo 70%) per 10 sece lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente. </li><li> Immergere i vetrini in soluzione eosina per 30 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, sequenzialmente immergere i vetrini in bagni contenenti 70% di etanolo, 95% di etanolo e 100% etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio. </li></ol></li><li> Valutazione stereologica della nave Dimensioni e Rimodellamento Stato <ol><li> Per ogni sito di impianto, determinare in quali sezioni sono vicini al punto di midsagittal. L&#39;attaccamento corioallantoidea tra il feto e la placenta in via di sviluppo costituisce un buon indicatore del punto midsagittal. </li><li> Selezionare 3 sezioni a 49 micron intervalli vicine al punto midsagittal per l&#39;analisi. Scansione diapositive selezionate. Per evitare incvene Luding, che hanno dimostrato di essere più perifericamente situato nei siti di impianto 16, limitare l&#39;analisi sul centrale 2/4 di ogni sito d&#39;impianto (Figura 2A). </li><li> Per valutare dimensione del lume, disegnare intorno all&#39;interno dei vasi e registrare l&#39;area di questa forma. Per la dimensione totale del vaso, disegnare attorno alla parete esterna del recipiente, comprese le cellule endoteliali, e leucociti periciti intramurali. Nota: Il rapporto tra dimensione totale nave a lume è un proxy per lo stato ristrutturazione di una nave. Come i vasi bobina attraverso il piano che la sezione è stato tagliato lungo, vi possono essere più sezioni della stessa arteria una diapositiva. Evitare di misurare la stessa arteria più volte. </li><li> Registrare le misure delle 5 navi in ​​ciascun sito di impianto con le più grandi e più rotondi lumen. Misurare ogni sito di impianto in triplicato (tre sezioni distanziati 49 micron l&#39;uno dall&#39;altro). La media di questi 15 misurazioni represeNTS il diametro medio dei vasi più grandi. </li><li> Per evitare overrepresentation dei vasi grandi in alcuni campioni, misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. </li></ol></li></ol> 3. qualitativa valutazione utilizzando immunoistochimica <ol><li> Deparaffinizzazione e reidratazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack heatproof scivolare in un bagno di xilene 100% per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% etanolo e 70% e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol><li> Preparare un 10 mM tampone citrato di sodio in acqua depurata e regolare a pH 6 con 10 M di acido cloridrico. </li><li> Riempire un contenitore resistente al calore che può contenere 600 ml con 400 ml di sodio citrato e luogo di buffer in una pentola a pressione interna contenente wat sufficienteer a sommergere la metà del contenitore. Liberamente fissare il coperchio della pentola a pressione e calore fino a ebollizione. </li><li> Porre il vetrino cremagliera nel buffer citrato di sodio e fissare saldamente il coperchio della pentola a pressione. Una volta pressurizzato, far bollire per 3 minuti. </li><li> Depressurizzare la pentola a pressione e rimuovere il contenitore interno. Lasciare raffreddare i vetrini nel tampone citrato di sodio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in un bagno contenente acqua purificata per 5 min. </li><li> Circondare la sezioni usando una penna barriera idrofobica. </li><li> Lavare i vetrini immergendo in PBS per 5 min. </li></ol></li><li> Blocco endogena perossidasi e legame non specifico <ol><li> Incubare sezioni con 3% di perossido di idrogeno diluito in acqua purificata in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il perossido di idrogeno è altamente irritante per gli occhi, la pelle e per ingestione. Indossare appropriati DPI. </li><li> Toccare off soluzione di perossido d&#39;idrogeno in eccesso e lavare slides due volte immergendo in soluzione fisiologica tamponata Tris (TBS) per 2 minuti ciascuna. </li><li> Incubare sezioni con il mouse immunoglobulina bloccando reagente dal mouse sul corredo del mouse preparato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per 2 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Immunolocalizzazione di actina del muscolo liscio <ol><li> Preparare la soluzione diluente anticorpale (fornito nel kit) e incubare con sezioni per 5 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Diluire 1: actina muscolo liscio 100 topo anti-umano (DAKO m0851) in soluzione diluente. Diluire il mouse IgG2a controllo isotipico in soluzione diluente, assicurando che la concentrazione finale immunoglobulina è equivalente in entrambe le soluzioni. </li><li> Toccare off soluzione diluente e coprire le sezioni in eccesso sia con soluzioni di controllo degli anticorpi o isotipo diluiti. Incubare in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per2 min ciascuno. </li><li> Diluire anticorpo secondario anti-topo biotinilato e incubare sezioni per 10 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini una volta con TBS e PBS per 2 min, rispettivamente. </li><li> Preparare la soluzione 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) in base alle istruzioni del produttore. Coprire sezioni con soluzione DAB e incubare fino a 4 min, assicurando a monitorare le sezioni al fine di evitare lo sviluppo del colore in eccesso. ATTENZIONE: DAB è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Immergere i vetrini in acqua depurata una volta raggiunta l&#39;intensità desiderata di colorazione. </li><li> Controcolorare con il 50% di Gill n ° 3 ematossilina per 20 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente fino a quando l&#39;acqua è pulita. </li></ol></li><li> Disidratazione e montaggio <ol><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, in sequenza immergere i vetrini in bagni contenenti il ​​70% ethAnol, etanolo al 95% e il 100% di etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui presentata è progettato per fornire un metodo riproducibile che per valutare le modifiche vascolari che sono necessarie per gravidanza. Critico per il successo di questa valutazione è la qualità delle sezioni di tessuto. Sia determinare con precisione l&#39;età gestazionale dei siti di impianto, così come affidabile legando le arterie uterine sono passi cruciali. Le variazioni di parametri quali il tempo di fissazione, protocollo tessuto-processing, ecc possono influire sul risultato. Per una valutazione stereologica imparziale, è importante misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. Si raccomanda di misurare 5 navi per sito di impianto e ogni sito di impianto in triplice copia. La media di queste misurazioni 15 rappresenta la dimensione media delle 5 più grandi vasi. A seguito dei dati da Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - mice mostrate qui, abbiamo trovato questo protOcol utile per una serie di modelli di inadeguata funzione immunitaria materna, tra cui una delle cellule NK inibiti 14. Difetti di rimodellamento arterioso hanno anche dimostrato in modelli di alterata trofoblasto dell&#39;invasione 18 e le tecniche qui descritte possono essere utili per valutare la vascolarizzazione in questi casi. Abbiamo ottimizzato e validato questo protocollo per la ricerca di deciduali rimodellamento vascolare a metà della gestazione nel topo, ma è anche ipotizzabile, ad adeguare il protocollo di lavorare in altri sistemi modello (ad esempio ratti) o anche in altri organi. Mentre troviamo che il rimodellamento NK-dipendente può essere robustamente valutata a gd9.5, esso può essere modificato per altri momenti, come gd12.5, quando il sistema vascolare materno è completamente ristrutturato. A questo punto di tempo, trofoblasto endovascolare invasione è profondo 16 e questo punto di tempo potrebbe essere più adatto per le indagini del ruolo di trofoblasto per cambiamenti vascolari. Se si desiderano ulteriori letture quantitativi,gli investigatori possono anche aumentare il numero di sezioni colorate per la SMA e valutare la percentuale di navi parzialmente ristrutturato all&#39;interno di ogni sito dell&#39;impianto. Un limite di questo protocollo è la natura descrittiva degli esami istologici. Saggi funzionali, tuttavia, sono solo lentamente diventando disponibili (come ecocolordoppler 19). Queste tecniche richiedono competenze tecniche e costi molto più elevati per l&#39;acquisizione e la manutenzione delle apparecchiature, ma hanno il vantaggio di fornire una lettura longitudinale in vivo per l&#39;effetto delle variazioni osservabili istologicamente. Un possibile svantaggio di tutti gli esami stereologici è la soggettività degli investigatori. A tal fine, con due esaminatori indipendenti che analizzano tutti i campioni in modo indipendente può contribuire ad evitare questo problema. Mentre il protocollo descritto qui fornisce una visione in quanto sangue può raggiungere l&#39;interfaccia feto-materna, può essere vantaggioso combinare con il complapproccio ementary di valutare la quantità totale di sangue in un dato momento nel sistema vascolare attraverso la plastica getta 16. La forza di questo protocollo è che combina due approcci indipendenti. Cambiamento vascolare viene prima quantitativamente valutata stereologia e il risultato viene poi convalidato qualitativa, utilizzando l&#39;immunoistochimica. L&#39;affidabilità dei risultati può essere ulteriormente rafforzata dalla randomizzazione dei campioni. I campioni preparati per questo protocollo può essere facilmente utilizzato per studiare anche altri parametri di gravidanza, come decidualisation, lo sviluppo dell&#39;aggregato linfoide mesometrial di gravidanza (MLAP) o immunolocalizzazione di cellule di interesse, di valutare con rigore un fenotipo gravidanza a midgestation. Rimodellamento arteriosa è un passaggio fondamentale per le gravidanze senza complicazioni nelle donne e il fallimento di questi cambiamenti è alla base delle grandi sindromi ostetriche (GOS), vale a dire pre-eclampsia, restrizione della crescita fetale enati morti. Vi presentiamo qui le tecniche per valutare attentamente un fenotipo gravidanza in modelli murini che imitano alcune caratteristiche della fisiopatologia del GOS.

Lo scambio di sostanze nutritive, gas e prodotti di scarto durante la gestazione eutherian è mediato dalla placenta. Nel tratto riproduttivo femminile, le arterie uterine sono i principali condotti di sangue verso l&#39;utero. Dopo l&#39;impianto, questi ramo in vasi specializzati chiamati arterie spirali che avvolgono attraverso le basale decidua verso l&#39;unità fetoplacentare. Diametro e l&#39;elasticità di queste arterie spirali, che sono circondate da leucociti, in particolare uterina natural killer (Unk), le cellule, dettare il volume e la velocità di sangue a disposizione alla placenta 1,2. Modificazioni emodinamiche corretti come risultato di rimodellamento delle arterie spirali sono fondamentali per il successo della gravidanza. Mentre i meccanismi sottostanti differiscono in dettaglio tra umano e murino gravidanza, il risultato finale del processo di rimodellamento in entrambe le specie è dilatato, alta conduttanza vascolare che perde il suo strato di muscolatura liscia. Nei topi, l&#39;interferone Zio derivato dalle cellule (IFN-) γ è necessario per indurre questi cambiamenti a intorno a metà della gestazione 3-5. I topi che mancano sia le cellule NK o componenti della via di segnalazione di IFN-γ non riescono a subire questi cambiamenti e questo è associato ad una ridotta crescita fetale 6,7, sottolineando l&#39;importanza di un adeguato apporto di sangue per l&#39;unità fetoplacentare. Durante la prima gravidanza umana, l&#39;invasione interstiziale ed endovascolare di trofoblasto extravilloso e la loro interazione con le cellule unk sono importanti per indurre alterazioni vascolari e di promuovere la crescita del feto 8-10. Lo Zio cellule possono orchestrare invasione trofoblasto umano attraverso chemochine e citochine 11, come granulociti e macrofagi - fattore stimolante le colonie (GM-CSF) 12. Shallow invasione trofoblasto è associato con ridotte rimodellamento arteriosa e complicazioni durante la gravidanza come la pre-eclampsia 9. Questo protocollo si basa sul lavoro pionieristico di Anne Croy che ha descritto l&#39;importanteruolo del sistema immunitario e in particolare NK-IFN-γ derivato per il successo rimodellamento vascolare attraverso immunoistochimica e di trasferimento eleganti esperimenti 5,13. Qui si descrive un modo veloce ed economico per valutare lo stato di rimodellamento delle arterie a spirale. Anche se il nostro laboratorio valuta regolarmente presente a metà della gestazione (giorno di gestazione (GD) 9.5) 14, il processo di rimodellamento avviene tra gd8.5 e 12,5 15. L&#39;avvento di scanner per diapositive automatizzati ha notevolmente facilitato la valutazione delle aree nave e lume dalle sezioni e abbiamo trovato che questo è un approccio più riproducibile di misurare i diametri dei vasi. L&#39;aggiunta di rilevazione immunoistochimica di SMA consente una semplice validazione dei risultati ottenuti dalla valutazione stereologica. Come per tutte le tecniche di stereologici, si raccomanda di eseguire la valutazione come un esperimento in cieco da almeno due esaminatori. A tal fine, un passo randomizzazione può essere introdotto quando serialmente tagliareting i campioni in modo che gli investigatori valutare le diapositive non sanno da quale gruppo sperimentale i campioni provengono. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire uno strumento affidabile per valutare attentamente la ristrutturazione delle arterie spirali nei topi con genotipi materni e paterni definiti, nel contesto di modelli murini per le complicazioni legate alla gravidanza. I risultati sottolineano la dipendenza da cellule Zio di questo processo, che è essenziale per la normale crescita fetale.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental floss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td></td><td></td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>Straight dissection scissors</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene-based mounting media</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td></tr><tr><td>Pressure cooker</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on mouse kit</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Significantly reduces background</td></tr><tr><td>Mouse anti-human smooth muscle actin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Cross-reacts with mouse</td></tr><tr><td>IgG2a isotype control</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine solution</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - mice mancano tutti i linfociti maturi, comprese le cellule NK 17, e le loro arterie uterine non riescono a subire i cambiamenti vascolari osservati in di tipo selvatico congenic C57BL / 6 (WT) topo intorno a metà della gestazione 5,14. Come risultato di questo ridotto rimodellamento Rag2 - / - IL2RG - / - topi mostrano aree significativamente più piccole luminali di superficie, indicativi dei vasi globale più piccoli che possono essere visualizzati su sezioni H &amp; E-colorati e quantificate stereologically (Figura 2). Inoltre, lo spessore della parete relativa (vaso rapporto lumen) è maggiore nelle arterie spirali in questi topi, suggerendo ridotto apporto di sangue e di velocità del sangue superiori. Questa valutazione quantitativa è stata confermata con la rilevazione immunoistochimica della SMA. E &#39;caratteristico per topi WT a perdere la maggior parte della SMA nei media vascolaredelle arterie a spirale entro la metà di gestazione. Se questo processo cellule NK-driven non avviene, SMA rimane in media dei vasi e può essere facilmente rilevato immunoistochimiche come anelli intorno ai vasi sanguigni (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: utero mouse a gd9.5, riassunto schematico disegno che mostra le posizioni relative della corna uterine, cervice uterina (blu) e principali arterie uterine (rosso).. Indicati sono l&#39;asse delle corna uterine (frecce) ed i punti di legatura (frecce tratteggiate). Le sezioni per immunoistochimica sono tagliate lungo il piano di vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Valutazione stereologica di rimodellamento arterioso a metà della gestazione (A) Esempio assessment di luminale e superfici totali delle navi su sezioni H &amp; E macchiato dalle femmine WT nella centralissima 2/4 delle basalis decidua (delimitata dalla nera verticale linee tratteggiate) a gd9.5. Nelle navi in ​​alto ingrandimento, la linea rossa tratteggiata delimita un&#39;area totale nave, linea gialla tratteggiata delimita un&#39;area lumen. Bar = 500 micron (a sinistra), 50 micron (a destra). L&#39;asse lungo dell&#39;utero è una linea orizzontale in questo orientamento. (B) Quantificazione delle aree luminali (pannello di sinistra) e rapporto di area luminale all&#39;area nave totale (pannello di destra) da WT (C57BL / 6) e Rag2 - / - IL2RG - / - topi (su C57BL / 6 background). Ogni punto di dati rappresenta la media di 15 misurazioni (5 misure per sezione, 3 sezioni per ogni sito dell&#39;impianto). Barre rappresentano in media, n = 11-13 siti di impianto da 4 gravidanze per gruppo; p-value da una a due code, spaiato test di Mann-Whitney. WT: tipo selvatico. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Rilevazione immunoistochimica di actina muscolo liscio nelle basale decidua Rappresentante SMA colorazione su WT (in alto) e Rag2 - / - IL2RG - / - mice (su C57BL / 6 sfondo, fondo) a gd9.5. Bar = 100 micron. WT: tipo selvatico.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K Views.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modello murino Spinotrapezius per valutare l&#39;impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Ricerca

Medicina

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Un uso novello di tridimensionale ad alta frequenza l'ecografia per la caratterizzazione di gravidanza precoce nel topo

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Biologia dello sviluppo

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Ultrasuono ad alta frequenza per l'analisi dello sviluppo fetale e placentare In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

Il mio topo è incinta? Valutazione ecografico ad alta frequenza

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

Metodi per studiare i contributi uterini all'instaurazione della gravidanza in un modello murino ovariectomizzato

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modello del ratto dell'ipoperfusione lieve intrauterina con stenosi Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Neuroscienze

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Ecografia in indagini sperimentali riproduttive sui ratti

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Development of a Murine Model for Femoral Artery Anastomotic Stenosis

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent postoperative complication, primarily caused by surgery-induced vascular injury, intimal hyperplasia, and inflammatory responses. The mouse femoral artery anastomosis model is widely used to investigate the mechanisms of anastomotic restenosis and vascular repair. Microscopically guided end-to-end femoral artery anastomosis allows precise simulation of vascular injury and repair processes following surgery, providing a reliable experimental tool for studying the pathological mechanisms related to restenosis. This study focuses on refining the surgical technique for femoral artery anastomosis in mice. Through refinements in surgical techniques and optimization of technical details, we have achieved a marked increase in the success rate and reproducibility of the model. Specific improvements include refined vascular handling techniques during surgery, the selection of suture materials, and the optimization of suturing methods to minimize anastomotic leakage and postoperative occlusion. The study also emphasizes the observation of intimal hyperplasia, vascular remodeling at the anastomotic site, and long-term vessel patency. Through this research, we provide a concise and efficient operational guide for performing mouse femoral artery anastomosis, offering reliable technical support for experimental studies in vascular surgery. This work lays a solid foundation for subsequent investigations into related mechanisms and evaluations of therapeutic intervention.

Here we present a murine model for femoral artery anastomosis, offering researchers a valuable animal model to study and simulate vascular anastomotic stenosis. This development is crucial for advancing our understanding of the pathophysiology underlying this condition and facilitating more accurate and effective research into vascular diseases.

Sviluppo di un modello murino per la stenosi anastomotica dell'arteria femorale

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent ...