The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le normative UK Home Office e sono approvati dalla Ethical Review Panel Cambridge. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Impostare accoppiamenti cronometrate con 8-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 topi con maschi adulti (fino a 2 femmine per ogni maschio) nel pomeriggio. Verificare la presenza di tappi vaginali come segno di copulazione prime ore del mattino nei giorni seguenti. La presenza di un plug nella mattina marchi gd0.5. </li><li> Su gd9.5, eutanasia dell&#39;animale da dislocazione cervicale e aprire la cavità addominale. Si noti che l&#39;eutanasia da CO 2 può causare vasodilatazione. </li><li> Utilizzare il filo interdentale per legare delicatamente le arterie uterine (Figura 1, frecce tratteggiate). Legare il filo intorno alle arterie sulla punta di ogni corno uterino, prossimale alle ovaie, così come intorno alla cervice. Nota: Non rompere i vasi in quanto ciò potrebbe causare arterie crollate. </li> &lt;li&gt; sezionare il utero rapidamente utilizzando forbici dissezione, ablazione del tutto utero distale ai tre punti legatura sulla punta delle corna uterine e la cervice. </li><li> Posizionare l&#39;utero su un pezzo di polistirene preparato in modo che entrambe le corna sono allineati lungo il medesimo asse lungo in direzioni opposte dalla cervice. Allungare delicatamente e pin in posizione 25 con 2-3 aghi G. </li><li> Immergere il polistirolo in un tubo da 50 ml preparati. Top fino a 50 ml con formalina al 10%. Fix per 5-6 ore a temperatura ambiente. </li><li> Scartare la soluzione di formalina e sostituire con 50 ml 1x tampone fosfato salino (PBS) per 5 min. </li><li> Accise le due corna uterine prossimale al punto legatura a ciascuna estremità prossimale e al collo dell&#39;utero, nel centro, tagliare l&#39;eventuale eccesso di grasso intorno ai siti di impianto e lavare due volte in PBS per 5 minuti per rimuovere le tracce di formalina. </li><li> Conservare i campioni in etanolo al 70% a 4 ° C (per due settimane) fino all&#39;elaborazione. ATTENZIONE: EthAnol è altamente infiammabile. </li><li> Utilizzare un sistema di trattamento automatizzato utilizzando i parametri indicati in tabella 1. Incorporare le corna singolarmente in paraffina modo che possano essere tagliati lungo il piano perpendicolare all&#39;asse lungo dell&#39;utero. Questo assicura che l&#39;area massima di ogni sito implantologico verrà esposta per analisi nel mezzo del blocco (Figura 2A). OPTIONAL: Questo è un punto di tempo comodo per randomizzazione dei blocchi se lo si desidera. </li><li> Utilizzando un microtomo, tagliare sezioni seriali di 7 micron di spessore dai blocchi. Macchia una sezione ad ogni intervallo di 49 micron con ematossilina e eosina (H &amp; E, vedere paragrafo 2.1). Conservare le restanti sezioni a temperatura ambiente per SMA colorazione e altre applicazioni a valle. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Soluzione </td><td style="width:43px;"> Orario<html></td><td style="width:97px;"> Temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Impostazioni per la lavorazione dei tessuti automatizzata Panoramica di regolazione usate per la lavorazione di tessuto uterino 2. SterValutazione eological <ol><li> H &amp; E colorazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack scorrevole in un bagno di xilene 100% per 10 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: xilene è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Questo lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante, utilizzando i dispositivi di protezione individuale (DPI). </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in 50% Gill Nessuna soluzione ematossilina 3, diluita con acqua purificata, per 5 min. ATTENZIONE: ematossilina è nociva per ingestione e contatto per gli occhi. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Lavare i vetrini in una vaschetta di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> Immergere i vetrini in 1% soluzione di acido / alcol (1% di acido cloridrico al 10 M in etanolo 70%) per 10 sece lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente. </li><li> Immergere i vetrini in soluzione eosina per 30 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, sequenzialmente immergere i vetrini in bagni contenenti 70% di etanolo, 95% di etanolo e 100% etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio. </li></ol></li><li> Valutazione stereologica della nave Dimensioni e Rimodellamento Stato <ol><li> Per ogni sito di impianto, determinare in quali sezioni sono vicini al punto di midsagittal. L&#39;attaccamento corioallantoidea tra il feto e la placenta in via di sviluppo costituisce un buon indicatore del punto midsagittal. </li><li> Selezionare 3 sezioni a 49 micron intervalli vicine al punto midsagittal per l&#39;analisi. Scansione diapositive selezionate. Per evitare incvene Luding, che hanno dimostrato di essere più perifericamente situato nei siti di impianto 16, limitare l&#39;analisi sul centrale 2/4 di ogni sito d&#39;impianto (Figura 2A). </li><li> Per valutare dimensione del lume, disegnare intorno all&#39;interno dei vasi e registrare l&#39;area di questa forma. Per la dimensione totale del vaso, disegnare attorno alla parete esterna del recipiente, comprese le cellule endoteliali, e leucociti periciti intramurali. Nota: Il rapporto tra dimensione totale nave a lume è un proxy per lo stato ristrutturazione di una nave. Come i vasi bobina attraverso il piano che la sezione è stato tagliato lungo, vi possono essere più sezioni della stessa arteria una diapositiva. Evitare di misurare la stessa arteria più volte. </li><li> Registrare le misure delle 5 navi in ​​ciascun sito di impianto con le più grandi e più rotondi lumen. Misurare ogni sito di impianto in triplicato (tre sezioni distanziati 49 micron l&#39;uno dall&#39;altro). La media di questi 15 misurazioni represeNTS il diametro medio dei vasi più grandi. </li><li> Per evitare overrepresentation dei vasi grandi in alcuni campioni, misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. </li></ol></li></ol> 3. qualitativa valutazione utilizzando immunoistochimica <ol><li> Deparaffinizzazione e reidratazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack heatproof scivolare in un bagno di xilene 100% per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% etanolo e 70% e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol><li> Preparare un 10 mM tampone citrato di sodio in acqua depurata e regolare a pH 6 con 10 M di acido cloridrico. </li><li> Riempire un contenitore resistente al calore che può contenere 600 ml con 400 ml di sodio citrato e luogo di buffer in una pentola a pressione interna contenente wat sufficienteer a sommergere la metà del contenitore. Liberamente fissare il coperchio della pentola a pressione e calore fino a ebollizione. </li><li> Porre il vetrino cremagliera nel buffer citrato di sodio e fissare saldamente il coperchio della pentola a pressione. Una volta pressurizzato, far bollire per 3 minuti. </li><li> Depressurizzare la pentola a pressione e rimuovere il contenitore interno. Lasciare raffreddare i vetrini nel tampone citrato di sodio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in un bagno contenente acqua purificata per 5 min. </li><li> Circondare la sezioni usando una penna barriera idrofobica. </li><li> Lavare i vetrini immergendo in PBS per 5 min. </li></ol></li><li> Blocco endogena perossidasi e legame non specifico <ol><li> Incubare sezioni con 3% di perossido di idrogeno diluito in acqua purificata in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il perossido di idrogeno è altamente irritante per gli occhi, la pelle e per ingestione. Indossare appropriati DPI. </li><li> Toccare off soluzione di perossido d&#39;idrogeno in eccesso e lavare slides due volte immergendo in soluzione fisiologica tamponata Tris (TBS) per 2 minuti ciascuna. </li><li> Incubare sezioni con il mouse immunoglobulina bloccando reagente dal mouse sul corredo del mouse preparato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per 2 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Immunolocalizzazione di actina del muscolo liscio <ol><li> Preparare la soluzione diluente anticorpale (fornito nel kit) e incubare con sezioni per 5 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Diluire 1: actina muscolo liscio 100 topo anti-umano (DAKO m0851) in soluzione diluente. Diluire il mouse IgG2a controllo isotipico in soluzione diluente, assicurando che la concentrazione finale immunoglobulina è equivalente in entrambe le soluzioni. </li><li> Toccare off soluzione diluente e coprire le sezioni in eccesso sia con soluzioni di controllo degli anticorpi o isotipo diluiti. Incubare in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per2 min ciascuno. </li><li> Diluire anticorpo secondario anti-topo biotinilato e incubare sezioni per 10 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini una volta con TBS e PBS per 2 min, rispettivamente. </li><li> Preparare la soluzione 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) in base alle istruzioni del produttore. Coprire sezioni con soluzione DAB e incubare fino a 4 min, assicurando a monitorare le sezioni al fine di evitare lo sviluppo del colore in eccesso. ATTENZIONE: DAB è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Immergere i vetrini in acqua depurata una volta raggiunta l&#39;intensità desiderata di colorazione. </li><li> Controcolorare con il 50% di Gill n ° 3 ematossilina per 20 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente fino a quando l&#39;acqua è pulita. </li></ol></li><li> Disidratazione e montaggio <ol><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, in sequenza immergere i vetrini in bagni contenenti il ​​70% ethAnol, etanolo al 95% e il 100% di etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. 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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui presentata è progettato per fornire un metodo riproducibile che per valutare le modifiche vascolari che sono necessarie per gravidanza. Critico per il successo di questa valutazione è la qualità delle sezioni di tessuto. Sia determinare con precisione l&#39;età gestazionale dei siti di impianto, così come affidabile legando le arterie uterine sono passi cruciali. Le variazioni di parametri quali il tempo di fissazione, protocollo tessuto-processing, ecc possono influire sul risultato. Per una valutazione stereologica imparziale, è importante misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. Si raccomanda di misurare 5 navi per sito di impianto e ogni sito di impianto in triplice copia. La media di queste misurazioni 15 rappresenta la dimensione media delle 5 più grandi vasi. A seguito dei dati da Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - mice mostrate qui, abbiamo trovato questo protOcol utile per una serie di modelli di inadeguata funzione immunitaria materna, tra cui una delle cellule NK inibiti 14. Difetti di rimodellamento arterioso hanno anche dimostrato in modelli di alterata trofoblasto dell&#39;invasione 18 e le tecniche qui descritte possono essere utili per valutare la vascolarizzazione in questi casi. Abbiamo ottimizzato e validato questo protocollo per la ricerca di deciduali rimodellamento vascolare a metà della gestazione nel topo, ma è anche ipotizzabile, ad adeguare il protocollo di lavorare in altri sistemi modello (ad esempio ratti) o anche in altri organi. Mentre troviamo che il rimodellamento NK-dipendente può essere robustamente valutata a gd9.5, esso può essere modificato per altri momenti, come gd12.5, quando il sistema vascolare materno è completamente ristrutturato. A questo punto di tempo, trofoblasto endovascolare invasione è profondo 16 e questo punto di tempo potrebbe essere più adatto per le indagini del ruolo di trofoblasto per cambiamenti vascolari. Se si desiderano ulteriori letture quantitativi,gli investigatori possono anche aumentare il numero di sezioni colorate per la SMA e valutare la percentuale di navi parzialmente ristrutturato all&#39;interno di ogni sito dell&#39;impianto. Un limite di questo protocollo è la natura descrittiva degli esami istologici. Saggi funzionali, tuttavia, sono solo lentamente diventando disponibili (come ecocolordoppler 19). Queste tecniche richiedono competenze tecniche e costi molto più elevati per l&#39;acquisizione e la manutenzione delle apparecchiature, ma hanno il vantaggio di fornire una lettura longitudinale in vivo per l&#39;effetto delle variazioni osservabili istologicamente. Un possibile svantaggio di tutti gli esami stereologici è la soggettività degli investigatori. A tal fine, con due esaminatori indipendenti che analizzano tutti i campioni in modo indipendente può contribuire ad evitare questo problema. Mentre il protocollo descritto qui fornisce una visione in quanto sangue può raggiungere l&#39;interfaccia feto-materna, può essere vantaggioso combinare con il complapproccio ementary di valutare la quantità totale di sangue in un dato momento nel sistema vascolare attraverso la plastica getta 16. La forza di questo protocollo è che combina due approcci indipendenti. Cambiamento vascolare viene prima quantitativamente valutata stereologia e il risultato viene poi convalidato qualitativa, utilizzando l&#39;immunoistochimica. L&#39;affidabilità dei risultati può essere ulteriormente rafforzata dalla randomizzazione dei campioni. I campioni preparati per questo protocollo può essere facilmente utilizzato per studiare anche altri parametri di gravidanza, come decidualisation, lo sviluppo dell&#39;aggregato linfoide mesometrial di gravidanza (MLAP) o immunolocalizzazione di cellule di interesse, di valutare con rigore un fenotipo gravidanza a midgestation. Rimodellamento arteriosa è un passaggio fondamentale per le gravidanze senza complicazioni nelle donne e il fallimento di questi cambiamenti è alla base delle grandi sindromi ostetriche (GOS), vale a dire pre-eclampsia, restrizione della crescita fetale enati morti. Vi presentiamo qui le tecniche per valutare attentamente un fenotipo gravidanza in modelli murini che imitano alcune caratteristiche della fisiopatologia del GOS.

Lo scambio di sostanze nutritive, gas e prodotti di scarto durante la gestazione eutherian è mediato dalla placenta. Nel tratto riproduttivo femminile, le arterie uterine sono i principali condotti di sangue verso l&#39;utero. Dopo l&#39;impianto, questi ramo in vasi specializzati chiamati arterie spirali che avvolgono attraverso le basale decidua verso l&#39;unità fetoplacentare. Diametro e l&#39;elasticità di queste arterie spirali, che sono circondate da leucociti, in particolare uterina natural killer (Unk), le cellule, dettare il volume e la velocità di sangue a disposizione alla placenta 1,2. Modificazioni emodinamiche corretti come risultato di rimodellamento delle arterie spirali sono fondamentali per il successo della gravidanza. Mentre i meccanismi sottostanti differiscono in dettaglio tra umano e murino gravidanza, il risultato finale del processo di rimodellamento in entrambe le specie è dilatato, alta conduttanza vascolare che perde il suo strato di muscolatura liscia. Nei topi, l&#39;interferone Zio derivato dalle cellule (IFN-) γ è necessario per indurre questi cambiamenti a intorno a metà della gestazione 3-5. I topi che mancano sia le cellule NK o componenti della via di segnalazione di IFN-γ non riescono a subire questi cambiamenti e questo è associato ad una ridotta crescita fetale 6,7, sottolineando l&#39;importanza di un adeguato apporto di sangue per l&#39;unità fetoplacentare. Durante la prima gravidanza umana, l&#39;invasione interstiziale ed endovascolare di trofoblasto extravilloso e la loro interazione con le cellule unk sono importanti per indurre alterazioni vascolari e di promuovere la crescita del feto 8-10. Lo Zio cellule possono orchestrare invasione trofoblasto umano attraverso chemochine e citochine 11, come granulociti e macrofagi - fattore stimolante le colonie (GM-CSF) 12. Shallow invasione trofoblasto è associato con ridotte rimodellamento arteriosa e complicazioni durante la gravidanza come la pre-eclampsia 9. Questo protocollo si basa sul lavoro pionieristico di Anne Croy che ha descritto l&#39;importanteruolo del sistema immunitario e in particolare NK-IFN-γ derivato per il successo rimodellamento vascolare attraverso immunoistochimica e di trasferimento eleganti esperimenti 5,13. Qui si descrive un modo veloce ed economico per valutare lo stato di rimodellamento delle arterie a spirale. Anche se il nostro laboratorio valuta regolarmente presente a metà della gestazione (giorno di gestazione (GD) 9.5) 14, il processo di rimodellamento avviene tra gd8.5 e 12,5 15. L&#39;avvento di scanner per diapositive automatizzati ha notevolmente facilitato la valutazione delle aree nave e lume dalle sezioni e abbiamo trovato che questo è un approccio più riproducibile di misurare i diametri dei vasi. L&#39;aggiunta di rilevazione immunoistochimica di SMA consente una semplice validazione dei risultati ottenuti dalla valutazione stereologica. Come per tutte le tecniche di stereologici, si raccomanda di eseguire la valutazione come un esperimento in cieco da almeno due esaminatori. A tal fine, un passo randomizzazione può essere introdotto quando serialmente tagliareting i campioni in modo che gli investigatori valutare le diapositive non sanno da quale gruppo sperimentale i campioni provengono. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire uno strumento affidabile per valutare attentamente la ristrutturazione delle arterie spirali nei topi con genotipi materni e paterni definiti, nel contesto di modelli murini per le complicazioni legate alla gravidanza. I risultati sottolineano la dipendenza da cellule Zio di questo processo, che è essenziale per la normale crescita fetale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - mice mancano tutti i linfociti maturi, comprese le cellule NK 17, e le loro arterie uterine non riescono a subire i cambiamenti vascolari osservati in di tipo selvatico congenic C57BL / 6 (WT) topo intorno a metà della gestazione 5,14. Come risultato di questo ridotto rimodellamento Rag2 - / - IL2RG - / - topi mostrano aree significativamente più piccole luminali di superficie, indicativi dei vasi globale più piccoli che possono essere visualizzati su sezioni H &amp; E-colorati e quantificate stereologically (Figura 2). Inoltre, lo spessore della parete relativa (vaso rapporto lumen) è maggiore nelle arterie spirali in questi topi, suggerendo ridotto apporto di sangue e di velocità del sangue superiori. Questa valutazione quantitativa è stata confermata con la rilevazione immunoistochimica della SMA. E &#39;caratteristico per topi WT a perdere la maggior parte della SMA nei media vascolaredelle arterie a spirale entro la metà di gestazione. Se questo processo cellule NK-driven non avviene, SMA rimane in media dei vasi e può essere facilmente rilevato immunoistochimiche come anelli intorno ai vasi sanguigni (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: utero mouse a gd9.5, riassunto schematico disegno che mostra le posizioni relative della corna uterine, cervice uterina (blu) e principali arterie uterine (rosso).. Indicati sono l&#39;asse delle corna uterine (frecce) ed i punti di legatura (frecce tratteggiate). Le sezioni per immunoistochimica sono tagliate lungo il piano di vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Valutazione stereologica di rimodellamento arterioso a metà della gestazione (A) Esempio assessment di luminale e superfici totali delle navi su sezioni H &amp; E macchiato dalle femmine WT nella centralissima 2/4 delle basalis decidua (delimitata dalla nera verticale linee tratteggiate) a gd9.5. Nelle navi in ​​alto ingrandimento, la linea rossa tratteggiata delimita un&#39;area totale nave, linea gialla tratteggiata delimita un&#39;area lumen. Bar = 500 micron (a sinistra), 50 micron (a destra). L&#39;asse lungo dell&#39;utero è una linea orizzontale in questo orientamento. (B) Quantificazione delle aree luminali (pannello di sinistra) e rapporto di area luminale all&#39;area nave totale (pannello di destra) da WT (C57BL / 6) e Rag2 - / - IL2RG - / - topi (su C57BL / 6 background). Ogni punto di dati rappresenta la media di 15 misurazioni (5 misure per sezione, 3 sezioni per ogni sito dell&#39;impianto). Barre rappresentano in media, n = 11-13 siti di impianto da 4 gravidanze per gruppo; p-value da una a due code, spaiato test di Mann-Whitney. WT: tipo selvatico. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Rilevazione immunoistochimica di actina muscolo liscio nelle basale decidua Rappresentante SMA colorazione su WT (in alto) e Rag2 - / - IL2RG - / - mice (su C57BL / 6 sfondo, fondo) a gd9.5. Bar = 100 micron. WT: tipo selvatico.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K Views.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

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Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

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A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Un uso novello di tridimensionale ad alta frequenza l'ecografia per la caratterizzazione di gravidanza precoce nel topo

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...