This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.

1. Preparazione di materiali di prova NOTA: Per preparare i biochip per il test, diversi palloni confluenti di cellule RTgill-W1 deve essere pronta. Una buona stima del numero di flaconi necessari è uno confluente pallone T175 per 16 biochip per essere seminati. <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni in un armadietto II classe biologica di sicurezza (biohood) con tecnica asettica. Utilizzare etanolo al 70% per la disinfezione del biohood e qualunque materiale poste nel cappuccio. <ol><li> Preparare substrato fibronectina per i biochip fluidiche da scongelamento un flaconcino 1 mg di fibronectina e diluendo in 100 ml di sterili L-15 supporti per una concentrazione di 10 ug / ml. Congelare in 40 ml aliquote in 50 ml provette coniche polipropilene sterili a -20 ° C. Scongelare a temperatura ambiente diverse ore prima di semina i biochip. Una volta scongelato, non ricongelare. </li><li> Preparare mezzi di coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di 200 mM un sup L-alanil-L-glutamminacomplemento, e 5 ml di una soluzione di penicillina / streptomicina (10.000 unità di penicillina / ml e / ml 10.000 mg di streptomicina) stock a 500 ml di L-15 media. Questo produrrà 560 ml di terreni di coltura delle cellule che contengono il 9% di siero. Refrigerare. Nota: Questo sarà il supporto completo di coltura cellulare utilizzato per le fiasche di coltura e dei biochip. </li></ol></li><li> Polvere media Fiale <ol><li> Preparare prima del tempo fiale 0,1 dram snap-cap contenenti 60 mg ± 0,5% di polvere di L-15ex utilizzando un dosatore di polvere automatizzato. Etichettare le fiale con la data della polvere è stata erogata e fiale refrigerare (in quantità di 50) in poli sacchetti richiudibili metallizzati; ciascuno contenente tre pacchetti essiccazione di gel di silice 1 g. Nota: le fiale L-15ex multimediali in polvere possono essere fatte e conservate per un massimo di 9 mesi di anticipo di test. </li></ol></li><li> Fare una soluzione di 100 ml di 20% di candeggina diluendo candeggina con acqua deionizzata (DI). Stima che saranno necessari 5 ml di soluzione di candeggina per ogni biochip. </li><li> Fare assemblee tubi biochip tagliando 27 sezioni di tubo mm biocompatibile autoclavabile (2 sezioni per ogni biochip per essere seminati) e montare entrambe le estremità del tubo con raccordi luer policarbonato antiscivolo. Mettere assemblaggi di tubi in un sacchetto autoclavabile e autoclave per 8 minuti a 134 ° C. Anche i tappi autoclave biochip (2 per biochip) in un sacchetto a parte con le stesse impostazioni. </li><li> acqua deionizzata Autoclave per 30 minuti at121 ° C. Nota: Questa acqua verrà utilizzata per il risciacquo biochip dopo la semina. Stimano che saranno necessari 10 ml per ogni biochip. Nota: Il volume effettivo di ciascun canale biochip è di 2 ml, ma 5 ml di acqua sterile viene risciacquato attraverso ciascun canale dopo la rimozione della soluzione di candeggina. </li><li> Fare assemblee tubi iniezione siringa tagliando 27 sezioni mm di tubi biocompatibile e allegando maschi raccordi slittamento luer ad entrambe le estremità del tubo. Posizionare assiemi tubi in un sacchetto di sterilizzazione carta termosaldabile ed autoclave per 8 minuti a 134 &amp;# 176; C. </li></ol> 2. Procedura Biochip Semina Fluidic Nota: Eseguire tutte le procedure in cui le biochip o dei media è gestito in un armadio di sicurezza biologica di classe II con tecnica asettica. <ol><li> Ventiquattro ore prima della semina in programma, rimuovere i biochip da imballaggio produttore al biohood e mettere in custodie di plastica sterilizzati. </li><li> Sterilizzare i biochip utilizzando una soluzione di candeggina al 20% come segue Nota: Storicamente, questa procedura di sbiancamento ha impedito la crescita di funghi nei biochip durante la conservazione a lungo termine nel caso in cui la sterilizzazione al plasma dei biochip fatte dal produttore non è stato efficace. <ol><li> Utilizzando a 20 ml siringa sterile con un tubo di iniezione la siringa attaccata e lavorare nella biohood, iniettare 2 ml della soluzione di candeggina 20% in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip a sedere per 1 ora con la soluzione di candeggina. </li><li> Dopo un&#39;ora, asp vuotoirato la soluzione di candeggina da entrambi i canali utilizzando un montaggio slittamento luer maschio sterile attaccato al tubo di aspirazione a vuoto. Utilizzare uno dei gruppi di tubi biochip come uno scarico quando il risciacquo i biochip. </li><li> Usando una siringa sterile 20 ml collegata ad un gruppo di iniezione siringa sterile, lavare ogni canale del chip con 5 ml di acqua sterile, permettendo all&#39;acqua in eccesso di defluire in un contenitore in biohood. Poi il vuoto-aspirato l&#39;acqua come appena descritto per la candeggina e posizionare i biochip nuovamente dentro le custodie in plastica e lasciare nel biohood fino seminati con cellule il giorno seguente. </li></ol></li><li> Sessanta minuti prima semina i biochip, iniettare 2 ml della / soluzione fibronectina ml 10 mg in ciascun canale del biochip. Lasciare i biochip nella biohood per 60 minuti, e poi aspirare aspirare al largo della fibronectina (come descritto al punto 2.2.3) prima della semina il biochip con le cellule. Mettere due sezioni delle assemblee tubi biochip sterili (vedisezione 1.4) sulle porte dei biochip. </li><li> Trypsinize un confluenti RTgill-W1 pallone T175 per ogni 16 biochip utilizzando procedure descritte nella American Type Culture Collection (ATCC) prodotto descrizione foglio 16. <ol><li> Aspirare fuori il supporto dal pallone confluenti (s) di cellule. </li><li> Risciacquare lo strato di cellule con 15 ml di PBS e quindi aspirare via. </li><li> Aggiungere 6 ml di tripsina / EDTA per lo strato di cellule in ogni contenitore T175 e consentono alle cellule di trypsinize per ~ 5 min. </li><li> Aggiungere 15 ml di completo supporto L-15 coltura cellulare per ogni pallone per fermare tripsinizzazione. </li><li> Combinare le sospensioni cellulari in un contenitore sterile monouso. Nota: le dimensioni del contenitore può variare da 150-500 ml, a seconda del numero di biochip essere testa di serie. Stima che saranno necessari 5 ml di sospensione cellulare per biochip. </li></ol></li><li> Rimuovere ~ 1 ml di sospensione cellulare e posto in una provetta per il conteggio. Utilizzando un microscopio campo chiaro con una oggettivazione 10Xve e un emocitometro, conteggio un&#39;aliquota 10 microlitri di cellule e calcolare il volume di completa mezzi di coltura delle cellule L-15 necessario per raggiungere una sospensione cellulare di 2,5 x 10 5 cellule / ml. Nota: Se si utilizza la sospensione cellulare alle sementi fiaschi di continuare la cultura, questo sarebbe il punto di farlo. Regolare la concentrazione di sospensione cellulare utilizzando completo supporto L-15 coltura cellulare. </li><li> Utilizzando una sterile 20 ml syringeattached ad un complesso di tubo di iniezione siringa sterile (vedi paragrafo 1.6), iniettare 2,5 ml di sospensione cellulare nella porta esterna di ciascun canale del biochip (cioè, le porte che non hanno il tubo allegato), permettendo alcuni di sospensione cellulare in più per defluire dal tubo in un contenitore per rifiuti nel biohood. Nota: Questo farà sì che l&#39;intero canale e il tubo attaccato sarà pieno di sospensione cellulare. <ol><li> Creare un ciclo chiuso per ogni canale biochip inserendo l&#39;estremità libera del tubo con le rac luerng nelle porte esterne per ogni canale. </li><li> Pulire tutti i supporti in eccesso fuori dei circuiti chiusi con un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70% e posizionare i biochip nella scatola di plastica in un incubatore a 20 °. Dare ad ogni biochip un numero di identificazione univoco. </li></ol></li><li> Nei giorni 4 e 7, rimuovere i biochip dalla C incubatore 20 ° e ricostituire i mezzi di comunicazione in tutti i biochip con completa mezzi di coltura cellulare L-15 a temperatura equilibrata. Seguire la stessa procedura descritta nella fase 2.6, tranne l&#39;uso solo L-15 coltura cellulare multimediale, invece (senza sospensione cellulare). Mettere i biochip di nuovo in C incubatore 20 ° dopo l&#39;alimentazione giorno 4. <ol><li> Dopo l&#39;alimentazione giorno 7, rimuovere ed eliminare i tubi dai chip e inserire i tappi di scarico autoclave nei biochip. </li><li> Mettere i biochip in una scatola in un incubatore a 6 ° fino a quando utilizzato per il test. Nota: I chip possono essere conservati a temperature di refrigerazione per un massimo di 9 mesi e sono ancora vitali per il test in i lettori ICE. </li></ol></li></ol> 3. Test ECIS con Biochips <ol><li> Preparare i prodotti chimici di test se si utilizza. (Vedere Brennan, et al. 2012 7 per la preparazione di prodotti chimici di prova). </li><li> Rimuovere il lettore ECIS e forniture di test dalla custodia. Rimuovere un biochip preparata dalla C incubatore 6 °. Posizionare il biochip su un tovagliolo di carta. Accendere il lettore ECIS. </li><li> Utilizzando 10 ml siringhe, erogare 10 ml di acqua di controllo in un 0,5 once barattolo di controllo di plastica trasparente con etichetta e 10 ml di campione in esame in un 0,5 once barattolo di prova di plastica trasparente con etichetta. Nota: 1) Assicurarsi di rimuovere le bolle per una misurazione accurata. 2) Le siringhe e barattoli sono codificati a colori; blu per il controllo e rosso per test. </li><li> Rimuovere due fiale di media in polvere dai sacchetti di alluminio. Aprire una delle fiale di media in polvere (strumento multiuso uso, se necessario) e versare tutto il contenuto di una fiala dentro il barattolo con l&#39;acqua di controllo, lasciando cadere l&#39;intero flacone insoluzione pure. Ripetere questa procedura con il vaso di prova. Cap e agitare i vasi per assicurare che la polvere è sciolta. </li><li> Riempire ciascuno dei colori da 10 ml siringhe con 9 ml di uno di controllo (blu siringa) o il test (siringa rossa) soluzioni di rispettive fiale. Rimuovere le bolle d&#39;aria dalle siringhe. </li><li> Rimuovere i tappi dai porti biochip e collegare lo scarico. </li><li> Posizionare il biochip nel vassoio di plastica estraibile nel lettore ECIS e chiudere il coperchio. </li><li> Fissare riempite alle porte biochip esterni e collegare lo stantuffo della siringa. </li><li> Dalla schermata principale, selezionare &quot;NEXT&quot; per avviare pre-test. Nota: il software Reader controllerà impedenze. Se impedenze sono nel raggio d&#39;azione impostata dall&#39;utente (in genere tra 1.000 e 3.000 ohm) lo schermo registrerà &quot;Cartuccia Passed&quot; come indicato nella figura 3, e richiedere all&#39;utente di selezionare &quot;Avanti&quot; e il software procedere al punto 3.10). Se le impedenze non rientranola gamma insieme a causa di un biochip difettoso o collegamento difettoso del biochip al lettore (di solito a causa di un disallineamento degli elettrodi), poi lo schermo registrerà &quot;Cartuccia non riuscita&quot; e l&#39;utente avrà la possibilità di uno &quot;Abort&quot; o &quot;Verifica&quot; il test. <ol><li> Selezionare &quot;Abort&quot; per tornare al punto 3.9). Selezionare &quot;Verifica&quot; per passare al punto 3.10) dopo aver ricevuto un messaggio &quot;Cartuccia Passed&quot; e selezionando &quot;Avanti&quot;. Nota: Si consiglia di prendere il biochip fuori ed esaminarlo per difetti o perdite se un &quot;Cartuccia non riuscita&quot; messaggio viene ricevuto prima di procedere con un nuovo biochip visivamente. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Figura 3:. ECIS Reader Schermata di un biochip con letture di impedenza accettabili La schermata mostra le letture dell&#39;impedenza iniziali in ohm di ciascuno dei 4 coelettrodi ntrol (CE) e 4 elettrodi campione (SE) all&#39;interno del biochip fluidica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="10"><li> Quando viene richiesto da parte del lettore, inserire informazioni campione utilizzando una tastiera virtuale e quindi selezionare &quot;Accetto&quot; quando hai finito. Nota: il software di lettura ECIS si stampare automaticamente ogni insieme di dati con la data, l&#39;ora e altre informazioni inserite dall&#39;utente; quali il numero biochip, e il tipo di chimica e concentrazione. Due minuti di dati di impedenza saranno raccolti dal biochip inserito e il tempo di un timer sullo schermo conterà verso il basso. </li><li> Dopo due minuti, quando richiesto da istruzioni su schermo che vengono a lampeggiare entro una scatola rossa, premere &quot;Next&quot;. Quando viene richiesto da una casella verde lampeggiante a &quot;iniettare campioni ora&quot;, iniettare il controllo e mezzi di prova dalle siringhe attaccate contemporaneamente nella chann biochipEls. Lasciare le siringhe in atto sui biochip una volta terminato. Nota: valori di impedenza saranno raccolti una volta al minuto per 60 min. Se il software di lettura ECIS determina che il canale di trattamento è statisticamente diverso dal canale di controllo in qualsiasi punto tra 10 e 60 minuti dopo l&#39;inizio della prova, quindi la visualizzazione su schermo indica che il campione è &quot;contaminato&quot;. Se il trattamento non è diverso dal canale di controllo, lo schermo indicherà &quot;No Contaminazione Detected&quot; alla fine della prova. </li><li> Registra i risultati dei test come contaminati o meno contaminati per ogni campione. </li><li> Alla fine del test, rimuovere ed eliminare il biochip. Risciacquare e aria asciugare le siringhe, fiale di prova e vassoio di plastica estraibile che ospitava il biochip durante le prove. Nota: Il lettore ECIS dispone di 4 GB di memoria integrata per il software operativo, modelli di controllo ei file di test generati da esecuzione di un test. Ciò consente vari thfile di test ousand per essere memorizzati sul lettore. I file possono essere recuperati con un salto di unità USB e trasferiti a un computer per ulteriori analisi a scopo di ricerca, se desiderato. </li></ol>

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Opinions, interpretations, conclusions, and recommendations are those of the authors and are not necessarily endorsed by the U.S. Army. Citations of commercial organizations or trade names in this report do not constitute an official Department of the Army endorsement or approval of the products or services of these organizations. Authors Linda M. Brennan and Mark W. Widder, both of the US Army Center for Environmental Health Research, declare that they have no competing financial interests. Michael Mayo, Michael McAleer and Alex Greis are employees of Nanohmics that produces the disposable biochips and instruments used in this Article.10251980

La tecnologia ECIS eseguito bene in un ambiente di laboratorio ed è stato in grado di rilevare potenziali contaminanti in concentrazioni che sono rilevanti per la salute umana. La portabilità e il confezionamento della tecnologia rende favorevole per l&#39;uso sul campo. passaggi critici nel protocollo per il successo della tecnologia sono i seguenti: 1) mantenere condizioni asettiche durante la coltura, la semina, e l&#39;alimentazione dei biochip, 2) Tenere i biochip seminati in condizioni refrigerate fino pronto per il test in quanto le cellule RTgill-W1 non sopravviverà molto lungo una volta che sono sottoposti a temperature superiori ai 25 ° C, 3) pesare la L-15ex nelle fiale multimediali polvere e misurare accuratamente i campioni di acqua per evitare di produrre falsi positivi, che possono essere causati da un cambiamento nella osmolalità dei media piuttosto che la tossicità del campione, 4) Seguire le istruzioni utente sullo schermo ECIS per eseguire i test. Il software nel lettore avvisa l&#39;utente se un biochip è inaccettabile per il test (basato su letture dell&#39;impedenza iniziali) quando il biochip viene dapprima inserita nel lettore. Se i livelli di impedenza sono inaccettabili per il test, il software non consente all&#39;utente di procedere con il test fino a quando si utilizza un nuovo biochip. Motivi per letture dell&#39;impedenza inaccettabili solito a causa di un leggero disallineamento degli elettrodi biochip con piedini del lettore ECIS o perdite di liquido lungo uno dei bordi di incollaggio del biochip. Ci sono alcuni limiti di questa tecnologia, perché il sensore ECIS è stato testato solo con acqua potabile e non con le acque di superficie. Le cellule RTgill-W1 che si trovano sul biochip non possono tollerare il congelamento o temperature molto al di sopra di 25 ° C per lunghi periodi di tempo (periodo di tempo può essere da ore a giorni dipende dalla temperatura. I biochip funzionano meglio in un range di temperatura da frigorifero a temperatura 7. sono pronti per l&#39;uso immediato, tuttavia, subito dopo essere rdell&#39;uso e rimossi dalle celle frigorifere. contenitori freddo portatili sono attualmente utilizzati da personale dell&#39;esercito nel campo delle forniture sensibili alla temperatura. Questi stessi contenitori possono essere utilizzati per il trasporto biochip seminata. Un altro limite di questa tecnologia è che anche se è un sensore di tossicità a larga banda, non risponde bene, se non del tutto, a composti di inibizione della colinesterasi, come alcuni pesticidi. Per colmare questa lacuna capacità, il sensore ECIS è progettato per essere utilizzato in combinazione con un saggio test rapido pesticidi disponibile in commercio quando il test campioni di acqua al fine di fornire all&#39;utente una gamma più ampia di prove di tossicità. Il kit è un test enzimatico rapida progettato per rilevare organofosfati e carbammati pesticidi entro 30 min. Il sensore ECIS integra la wqas-PM (Analisi dell&#39;acqua Sistema di Qualità - Medicina Preventiva) sistema di test d&#39;acqua campo, attualmente utilizzato da personale militare medicina preventiva per rilevare, Arsenic, piombo, o cianuro in un campione di acqua potabile. Anche se il sensore ECIS non identificare ciò che il contaminante è, indicherà se sono presenti alcuni metalli o composti organici, che indica che l&#39;acqua non può essere adatto per il consumo umano. I risultati del test ECIS sono disponibili all&#39;interno di un ora. I campioni di acqua possono essere inviati per ulteriori analisi per l&#39;identificazione del contaminante se vi è un risultato positivo. Come descritto sopra, il lettore ECIS è progettato per essere parte di un sistema che include un kit ACE enzimatica separata per coprire un ampio spettro di rilevamento contaminanti. Entrambi questi lettori vengono confezionati in una robusta valigetta per il trasporto di campo per l&#39;uso sul campo da parte dei soldati.

L&#39;obiettivo generale era quello di sviluppare un metodo per la semina delle cellule, stoccaggio e verifica dei biochip fluidici nel biosensore ECIS. L&#39;obiettivo per lo sviluppo di questo biosensore è stato quello di soddisfare le specifiche Army per un dispositivo portatile di campo che potrebbe rilevare possibile contaminazione di acqua potabile utilizzata dai soldati. I requisiti per il sensore di tossicità erano che potrebbe rilevare un ampio spettro di composti tossici industriali rapidamente (entro un&#39;ora) a concentrazioni rilevanti per la salute umana, che il dispositivo sia campo portatile e componenti biologiche avrebbe una shelf-life di almeno nove mesi. Refrigerazione, ma non gelida, di componenti deperibili era accettabile. Storicamente, campo portatili tecnologie di controllo dell&#39;acqua con una componente biologica a loro (come gli anticorpi, enzimi, o acidi nucleici) sono stati 1-3 specifico analita. Lo svantaggio di questi tipi di biosensori è che essi ONLy rilevare un tipo di sostanza chimica alla volta. I sensori multipli sono necessari se si sospetta che più di un chimico è presente. Se un sensore specifico non è nel repertorio di prova, contaminanti chimici nell&#39;acqua potrebbe facilmente passare inosservato. I sensori di tossicità ad ampia base, d&#39;altra parte, hanno il potenziale per colmare questo divario tecnologico. Questi hanno solitamente un componente cellulare a loro 4-8. I vantaggi di biosensori tossicità ampia base sono che possono rilevare la presenza di una vasta gamma di contaminanti chimici, comprese miscele e incognite, in un periodo relativamente breve di tempo 5,9,10. Il concetto di utilizzare la misura della impedenza elettrica di monostrati cellulari come possibile sensore tossicità, che è noto anche come elettrico cellula-substrato impedenza di rivelazione (ECIS), è stato descritto da Giaever e Keese 11. Negli ultimi due decenni si è dimostrato essere un indicatore sensibile di viab celluleility e citotossicità. Fondamentalmente, il monostrato cellulare che viene fatto aderire agli elettrodi sui biochip è esposto ad elevata frequenza e bassa tensione e amperaggio alternata segnale corrente. Il monostrato confluente di cellule impedisce il flusso di elettroni. Quando l&#39;integrità del monostrato cellulare è compromessa (ad esempio quando viene introdotto un composto chimico), il sensore ECIS registra una variazione della impedenza elettrica 11-14. La figura 1 illustra il principio di ECIS rispetto al monostrato di cellule sul biochip . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Figura 1:.. Principio di ECIS Illustrazione di un monostrato di cellule su un biochip con lettore di ECIS semplificato schema elettrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 12. Queste cellule non erano pratici per l&#39;uso in campo, tuttavia, perché richiedevano modifiche di supporto frequenti, aveva una shelf-life limitata, e richiesto un ambiente artificiale CO 2 ed una temperatura di incubazione C 37 °. Si è scoperto che una linea cellulare disponibile in commercio derivato da cellule epiteliali trota arcobaleno Gill (RTgill W-1 cellule) potrebbe essere testato a temperatura ambiente a CO ambiente 2, formato un monostrato confluente in biochip, potrebbero essere conservati a temperature di refrigerazione, e avuto una risposta rapida (1 ora o meno) per un ampio spettro di sostanze chimiche a concentrazioni rilevanti per la salute umana 12. Applicazioni di cellule RTgill-W1 in tossicologia, nonché nella ricerca di base, vengono esaminati da Lee et al. 15 Metodi per la semina, stoccaggio e verifica dei biochip fluidici contenentimonostrati di cellule RTgill-W1 su biochip fluidici in un biosensore ECIS sono descritte qui. I biochip fluidici possono essere conservati per un massimo di 9 mesi in uno stato refrigerato e possono essere spediti in un contenitore di stoccaggio a freddo, per la prova di acqua potabile supplies.The che accompagnano i lettori ECIS, o unità di prova, vengono spediti separatamente. I biochip hanno due componenti a loro; uno strato superiore in policarbonato con due canali fluidi separati, e uno strato inferiore elettronico che contiene quattro elettrodi per canale per il rilevamento di impedenza. Ci sono 10 elettrodi di lavoro per blocco; ogni elettrodo è di 250 micron di diametro. I biochip assemblati hanno collegamenti elettrodo d&#39;oro per l&#39;acquisizione di letture di impedenza quando viene inserito nell&#39;unità di test ECIS. Ciascuno dei due canali a forma di U fluidici allegate terrà 2 ml della sospensione cellulare RTgill-W1. Figura 2 mostra un biochip fluidico nel lettore ECIS con un ingrandimento di un cellule confluenti su un singolo elettrodo di rilevamento. Figura 2:.. Biochip Fluidic in ECIS Reader area ingrandita mostra un monostrato confluente di cellule RTgill-W1 su un singolo elettrodo di rilevamento <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td>
			<td>16000-085</td>
			<td>Store @ -20 &#176;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, bovine plasma</td>
			<td>EMD Millipore Corp.&#160;&#160; www.emdmillipore.com&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>341631-1 mg</td>
			<td>Store @ -20 &#176;C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 &#176;C in aliquots. Use as substrate for biochips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 media without L-glutamine</td>
			<td>Lonza&#160; www.lonzabioscience.com</td>
			<td>12-700F</td>
			<td>Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 &#176;C.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>L-15ex powdered media with phenol red</td>
			<td>US Biological&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.usbio.net</td>
			<td>L1501</td>
			<td>Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 &#176;C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca++ or Mg++</td>
			<td>Lonza&#160; www.lonzabioscience.com</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Trypsin, EDTA</td>
			<td>Lonza&#160; www.lonzabioscience.com</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Store @ -20 &#176;C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.&#160;</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td >T175 culture flasks</td>
			<td >Fisher Scientific 
			www.fishersci.com</td>
			<td >12-565-30</td>
			<td >Used for culturing RTgill-W1 cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Chlorox&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.chlorox.com</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>70 % ethyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)&#160;</td>
			<td>American Type Tissue Culture Collection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.atcc.org</td>
			<td>CRL-2523</td>
			<td>Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM</td>
			<td>Lonza&#160; www.lonzabioscience.com</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Store at room temperature.&#160; Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td>
			<td>Lonza&#160; www.lonzabioscience.com</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>Store @ -20 &#176;C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing</td>
			<td>U.S. Plastic Corp.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.usplastic.com</td>
			<td>57317</td>
			<td>Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies</td>
			<td>Value Plastics&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>MTLS210-9</td>
			<td>Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>20 mL syringes, slip-tip</td>
			<td>VWR Scientific&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; us.vwr.com</td>
			<td>BD302831</td>
			<td>Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>0.1 dram snap-cap polypropylene microvials</td>
			<td>Bottles Jars and Tubes, Inc.&#160;&#160; www.bottlesjarsandtubes.com</td>
			<td>30600</td>
			<td>Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>60 mil Lexan fluidic ECIS biochips</td>
			<td>Nanohmics, Inc.&#160;&#160;&#160; www.nanohmics.com</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Autoclavable Plastic Instrument Box 
			17 1/2&#34; x 7 3/4&#34; x 2 3/8&#34;</td>
			<td >Medi-Dose EPS&#160;&#160;&#160;&#160; medidose.com</td>
			<td >IB701</td>
			<td >Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper heat-seal sterilization pouches, 7 &#189;&#8221; x 13&#8221;</td>
			<td>CardinalHealth&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.cardinalhealth.com</td>
			<td>90713</td>
			<td>Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Quantos automated powder dispenser</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.mt.com</td>
			<td>QB5</td>
			<td>Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>ECIS reader</td>
			<td>Nanohmics, Inc.&#160;&#160;&#160; www.nanohmics.com</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags</td>
			<td>Uline&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.uline.com</td>
			<td>S-16893</td>
			<td>Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Leatherman squirt ps4</td>
			<td>Amazon&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.Amazon.com</td>
			<td></td>
			<td>Used to open powdered media vials.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>1 gram silica gel desiccant packets&#160;</td>
			<td>Uline&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.uline.com</td>
			<td>S-3902</td>
			<td>Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles</td>
			<td >Fisher Scientific 
			www.fishersci.com</td>
			<td >09-740-25C or E</td>
			<td >Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Plugs for biochips</td>
			<td>Nanohmics, Inc.&#160;&#160;&#160; www.nanohmics.com</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drains for ECIS biochips</td>
			<td>Nanohmics, Inc.&#160;&#160;&#160; www.nanohmics.com</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.&#160; Allows for excess media to drain from channels during test injections.&#160;</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td >Fisher Scientific 
			www.fishersci.com</td>
			<td >S17040</td>
			<td >Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.</td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Brightfield microscope w/ 10X objective</td>
			<td>Leitz Labovert</td>
			<td></td>
			<td>Any brightfield microscope is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.</td>
		</tr>
		
		<tr >
			<td >Microcentrifuge tubes, 0.6 mL</td>
			<td >Fisher Scientific 
			www.fishersci.com</td>
			<td >02-681-311</td>
			<td >Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells.</td>
		</tr>
	
		<tr >
			<td >Slip 10 cc red syringes</td>
			<td >Procedure Products, Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.procedureproducts.com</td>
			<td >S/49S 30-R</td>
			<td >Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip.</td>
		</tr>
		
		<tr >
			<td >Slip 10 cc blue syringes</td>
			<td >Procedure Products, Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.procedureproducts.com</td>
			<td >S/49S 30-B</td>
			<td >Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip.</td>
		</tr>
		
		<tr >
			<td >&#189; oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps</td>
			<td >SKS Bottle &#38; Packaging, Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; www.sks-bottle.com</td>
			<td >0605-30</td>
			<td >Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing.</td>
		</tr>
		
		<tr >
			<td >50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td >Fisher Scientific&#160;&#160;&#160;&#160; www.fishersci.com</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td >Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and testing of impedance-based fluidic biochips with rtgill-w1 cells for rapid evaluation of drinking water samples for toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

La tecnologia ECIS descritto in questo documento sottoposto ai test presso la US Environmental Protection Agency (EPA) -sponsored tecnologia di test e Evaluation Program (TTEP). Tredici prodotti chimici sono stati selezionati per testare come rappresentanti di un ampio spettro di composti industriali tossici che potrebbero essere possibili contaminanti di acqua potabile. Durante il test, 9 dei 13 sono stati rilevati da ECIS all&#39;interno di un ora a concentrazioni che sono rilevanti per la salute umana 8. La tabella 1 illustra i risultati di questo test contaminante. Figura 4 è rappresentativo di ciò che un risultato &quot;contaminato&quot; sarà simile a lo schermo del lettore ECIS. Per la maggior parte, impedenze cellulari diminuiti per campioni contaminati rispetto ai controlli. Occasionalmente, alcuni composti possono causare un aumento di impedenza. Anche riassunti nella Tabella 1 </sTrong&gt; è il test di acqua pulita. Quaranta campioni di acqua pulita sono stati eseguiti e nessuna contaminazione è stata rilevata in nessuno dei campioni (vedi figura 5) per una schermata rappresentante di &quot;nessuna contaminazione rilevata&quot;. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Figura 4: ECIS Reader Schermata di un &quot;contaminati&quot; Campione d&#39;acqua Un esempio di grafica impedenza normalizzati e risultati da un campione d&#39;acqua che è stata contaminata.. Le linee blu rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi di controllo; linee rosse rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Figura 5: ECIS Reader Schermata di una &quot;contaminazione rilevata&quot; Campione d&#39;acqua Un esempio di grafica impedenza normalizzati e risultati da un campione d&#39;acqua che non è stato contaminato.. Le linee blu rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi di controllo; linee rosse rappresentano impedenze normalizzate di ciascuno degli elettrodi campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Categoria </td><td> contaminante </td><td colspan="3"> Concentrazione testata (mg / L) 1 </td><td colspan="2"> Rilevato ≤1 ora n = 4/4 chip </td></tr><tr><td rowspan="8"> pesticidi </td><td> aldicarb </td><td colspan="3"> 0,17 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> Arsen<html> ic (arsenite di sodio) </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Azide (sodio azide) </td><td colspan="3"> 46.7 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> fenamifos </td><td colspan="3"> 0.56 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> metamidofos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> metil parathion </td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Il paraquat (dicloruro) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> Pentaclorofenato (sodio) </td><td colspan="3"> 71,9 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td rowspan="5"> Prodotti chimici industriali </td><td> Ammoniaca </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Rame (rame II solfato) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Cyanide (sodio) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Mercurio (cloruro) </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> toluene </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> sì </td></tr><tr><td> Clean Water 2 </td><td> nessuna </td><td colspan="3"> N / A </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 concentrazioni testate sono gli stessi come nel manoscritto di Widder, et al. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 campioni di acqua pulita sono stati eseguiti senza contaminazione. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: contaminanti nei campioni di acqua rilevati da ECIS.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity at JoVE.com

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

preparation-testing-impedance-based-fluidic-biochips-with-rtgill-w1

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Views.  U.S. Army Center for Environmental Health Research. This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described. 

Video: Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. Unfortunately, traditional benthic larval sampling methods, such as the dip-net, can be time-consuming and expensive. An alternative protocol involves collection of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Chironomidae is a species-rich family of flies (Diptera) whose immature stages typically occur in aquatic habitats. Adult chironomids emerge from the water, leaving their pupal skins, or exuviae, floating on the water&#8217;s surface. Exuviae often accumulate along banks or behind obstructions by action of the wind or water current, where they can be collected to assess chironomid diversity and richness. Chironomids can be used as important biological indicators, since some species are more tolerant to pollution than others. Therefore, the relative abundance and species composition of collected SFPE reflect changes in water quality. Here, methods associated with field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of chironomid SFPE are described in detail. Advantages of the SFPE method include minimal disturbance at a sampling area, efficient and economical sample collection and laboratory processing, ease of identification, applicability in nearly all aquatic environments, and a potentially more sensitive measure of ecosystem stress. Limitations include the inability to determine larval microhabitat use and inability to identify pupal exuviae to species if they have not been associated with adult males.

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Uso di Chironomidae (Ditteri) pupa esuvie come Rapid Bioassessment protocollo per i corpi idrici-galleggiante Surface

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most experiments examine only two or a few levels of CA concentration and a single soil type, but if CA can be varied as a gradient from subambient to superambient concentrations on multiple soils, we can discern whether past ecosystem responses may continue linearly in the future and whether responses may vary across the landscape. The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility applies a 250 to 500 &#181;l L-1 CA gradient to Blackland prairie plant communities established on lysimeters containing clay, silty clay, and sandy soils. The gradient is created as photosynthesis by vegetation enclosed in in temperature-controlled chambers progressively depletes carbon dioxide from air flowing directionally through the chambers. Maintaining proper air flow rate, adequate photosynthetic capacity, and temperature control are critical to overcome the main limitations of the system, which are declining photosynthetic rates and increased water stress during summer. The facility is an economical alternative to other techniques of CA enrichment, successfully discerns the shape of ecosystem responses to subambient to superambient CA enrichment, and can be adapted to test for interactions of carbon dioxide with other greenhouse gases such as methane or ozone.

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility creates a 250 to 500 &#181;l L-1 linear carbon dioxide gradient in temperature-controlled chambers housing grassland plant communities on clay, silty clay, and sandy soil monoliths. The facility is used to determine how past and future carbon dioxide levels affect grassland carbon cycling.

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; Gradiente di concentrazione strumento per il test di CO<sub&gt; 2</sub&gt; Arricchimento e del suolo Effetti sulla Prateria Ecosistema Funzione

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and enables to perform rapid, automated and simple SPE. The pre-concentrated solution is compatible with analysis by immunoassay, with a low organic solvent content. A method is described for the extraction and pre-concentration of natural hormone 17&#946;-estradiol in 100 ml water samples. Reverse phase SPE is performed with octadecyl-silica sorbent and elution is done with 200 &#181;l of methanol 50% v/v. Eluent is diluted by adding di-water to lower the amount of methanol. After preparing manually the SPE column, the overall procedure is performed automatically within 1 hr. At the end of the process, estradiol concentration is measured by using a commercial enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). 100-fold pre-concentration is achieved and the methanol content in only 10% v/v. Full recoveries of the molecule are achieved with 1 ng/L spiked de-ionized and synthetic sea water samples.

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l&#39;analisi immunologiche di piccole inquinanti

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

L&#39;utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may be treated with simple systems designed to promote sorption of contaminants to vegetation and soils and promote infiltration. Two example systems are described: a bioswale treatment system for urban stormwater treatment, and a vegetated drainage ditch for treating agriculture irrigation runoff. Both have similar attributes that reduce contaminant loading in runoff: vegetation that results in sorption of the contaminants to the soil and plant surfaces, and water infiltration. These systems may also include the integration of granulated activated carbon as a polishing step to remove residual contaminants. Implementation of these systems in agriculture and urban watersheds requires system monitoring to verify treatment efficacy. This includes chemical monitoring for specific contaminants responsible for toxicity. The current paper emphasizes monitoring of current use pesticides since these are responsible for surface water toxicity to aquatic invertebrates.

This article summarizes the design attributes and the effectiveness of treatment systems that treat urban stormwater and agriculture irrigation runoff to remove pesticides and other contaminants associated with aquatic toxicity.

Sistemi di trattamento vegetale per la rimozione dei contaminanti associati alla tossicità dell&#39;acqua superficiale nell&#39;agricoltura e nella rottura urbana

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Estrazione di pesticidi di organochlorato da pellicole di plastica e analisi di tipo plastico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity testing has been demonstrated. Overall, the sensitivity of the species to toxic compounds is in the range with, or higher than, that of other model species.
This work describes protocols for acute, chronic, and multigenerational bioassays of single and combined stressor effects on N. furzeri. Due to its short maturation time and life-cycle, this vertebrate model allows the study of endpoints such as maturation time and fecundity within four months. Transgenerational full life-cycle exposure trials can be performed in as little as 8 months. Since this species produces eggs that are drought-resistant and remain viable for years, the on-site culture of the species is not needed but individuals can be recruited when required. The protocols are designed to measure life-history traits (mortality, growth, fecundity, weight) and critical thermal maximum.

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

In this work, we describe an acute, chronic and multigenerational bioassay to study the effects of single and combined stressors on the Turquoise killifish Nothobranchius furzeri. This protocol is designed to study life-history traits (mortality, growth, fecundity, weight) and critical thermal maximum.

Protocollo per acuto e prove di ecotossicità cronica del turchese Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...