Gli autori ringraziano Tom Robinson per la lettura delle bozze del manoscritto, C. Bärtschi e H. Benz per la realizzazione del sistema di controllo della pressione custom-built. Vorremmo inoltre ringraziare l&#39;uso della funzione stanza pulita prima e la microscopia ottica Center (LMC), sia presso l&#39;ETH di Zurigo. Il lavoro è stato finanziato dalla Merck Serono e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell&#39;ambito del 7 ° Programma Quadro (ERC Starting Grant, progetto n. 203.428, nμLIPIDs).

1. SU-8 master Fabrication Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a. <ol><li> Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazione). </li><li> Spin wafer a 500 rpm per 10 sec (estenderebbe l&#39;resistere sull&#39;intero wafer). </li><li> Spin wafer a 1.750 rpm per 30 sec (definisce l&#39;altezza del resist a 20 micron). </li></ol></li><li> Rimuovere resistere dal bordo del wafer con acetone (utilizzare un tampone) poiché ciò altrimenti aderire alla piastra nella fase successiva. Trasferire il wafer ahotplate a 95 ° C e calore per 4 min. Dopo la softbake, esporre il resist attraverso un fotomaschera attaccata al vetro sodalime in un allineatore maschera con luce UV (150 mJ / cm 2, misurata a 365 nm). </li><li> Dopo l&#39;esposizione, riscaldare il wafer di nuovo a 95 ° C per 5 min su una piastra. Raffreddare il wafer di RT e poi immergerlo in un bagno di SU-8 sviluppatore per 4 min. Agitare delicatamente per rimuovere impressionate SU-8. Lavare il wafer con clean-room grado isopropanolo e asciugare con azoto. Controllare al microscopio se lo sviluppo ha avuto successo (soprattutto le trappole cellulari). Se le trappole cellulari sono completamente sviluppati, il riflesso del wafer di silicio dovrebbe essere visibile. Se necessario, sviluppare nuovamente il wafer per alcuni minuti. </li><li> Cuocere il wafer in stufa per 2 ore a 180 ° C per rimuovere tutto il solvente residuo. Controllare l&#39;altezza dei canali con un profiler passo. Se l&#39;altezza differisce dalla altezza desiderata, ripetere questo protocollo partendo dal punto 1.1 con una nuova wafer ecambiare lo spin-velocità (fase 1.1.3). Finalizzare la fabbricazione di stampo master silanizzante la cialda con 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silano in un essiccatore durante la notte. </li></ol> 2. Fabrication Master stampa microcontact <ol><li> Per preparare maestri stampi per la stampa microcontact, disidratare un wafer di silicio per 10 min a 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS su questo wafer a 7.500 rpm per 30 sec (resist aderisce meglio alla superficie silanizzata). Spin-cappotto 2 ml di AZ1518 positivo resistono con questo protocollo: <ol><li> Erogazione statica del resist al wafer. </li><li> Spin wafer per 5 secondi a 500 giri al minuto. </li><li> Spin wafer per 60 sec a 4000 giri. </li></ol></li><li> Dopo un secondo softbake 50 a 100 ° C su una piastra, esporre il resist di luce UV (21 mJ / cm 2 a 365 nm) attraverso una fotomaschera ed un allineatore maschera. Sviluppare il resist in un bagno di AZ 726 per 75 sec. Sciacquare il wafer sviluppato con acqua demineralizzata e colpo dry con azoto. Rimuovere il solvente residuo riscaldando il wafer a 115 ° C per 50 sec. Silanizzazione wafer sottovuoto durante la notte. </li></ol> 3. Realizzazione della Microfluidic Chip Un disegno dispositivo a due strati viene utilizzato per questi esperimenti. I due strati sono preparati separatamente e sono legati insieme, prima che il chip viene finalmente incollato su un vetrino (Figura 3b). Questo passaggio descrive la produzione dei PDMS strati e il timbro PDMS per la stampa microcontact. <ol><li> Preparare una miscela di PDMS 10:01 e agente indurente. Preparare circa 80 g di PDMS in totale (usando le nostre idee, questo si tradurrà in 10 gettoni). Mescolare le due parti vigorosamente e degassarla PDMS finché il composto è bolla libera (~ 30 min). </li><li> Posizionare il wafer con lo strato di controllo all&#39;interno di una capsula di Petri e nastro sul fondo. Successivamente, versare ~ 50 g di PDMS sulla parte superiore e mettere il wafer per almeno 2 ore in un forno a 80 ° C per assicurare la completaindurimento delle PDMS. Ripetere la stessa procedura per il wafer stampa microcontact, per questo è necessario ~ 20 g PDMS. </li><li> Spin-coat PDMS sul wafer con lo strato fluidico ad una velocità di rotazione di 2.000 rpm per formare uno strato di circa 40 micron alta PDMS. Curare le PDMS in un forno per almeno 1 ora a 80 ° C. </li><li> Quando entrambe le parti sono guariti, rimuovere lo strato di controllo dal wafer e tagliato a pezzi con una lama di rasoio. Perforare connessione pressione utilizzando una biopsia perforatore ad 1 mm. Per lo stoccaggio, si consiglia di mettere un pezzo di nastro sui canali. </li><li> Per legare i due strati, prendere l&#39;ostia spin-rivestito e la parte superiore e metterli in un pulitore del plasma 23. Dopo il trattamento al plasma, allineare rapidamente entrambe le parti sotto un microscopio con grande distanza di lavoro. Aggiungere alcuni pezzi di PDMS intorno alle parti superiori collocati. Questo passaggio non è obbligatorio, tuttavia facilita la rimozione dei PDMS dal wafer. Posizionare il wafer in un forno a 80 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Utilizzare un bisturi per rimuovere con attenzione le PDMS dal wafer e tagliare i microchip. Punch fori di accesso per i collegamenti fluidici con biopsia perforatore 1,5 millimetri. </li><li> Il chip PDMS è terminata e può essere conservato per mesi. Facoltativo: Se il chip è utilizzato con un serbatoio, tagliare la parte superiore di una punta di pipetta 200 microlitri e utilizzare alcune ricambio, PDMS semi-indurito per incollarla sopra. Mettere il chip in forno nuovamente a 80 ° C per almeno 1 ora. </li></ol> 4. Bonding per vetrino Per utilizzare il dispositivo per saggi enzimatici diretti, l&#39;unico passo necessario dopo l&#39;incollaggio è il blocco di superfici. Per questo protocollo, procedere ad A. Tuttavia, per utilizzare il chip microfluidica per test immunologici o ELISA, si prega di fare riferimento al protocollo B per limitare i siti di legame solo al vetrino (vale a dire per la microscopia TIRF o SPR). Se questa limitazione non è importante, fare riferimento ad A, ma utilizzare coniugati biotinilato in fase 4.3 e continuare con la fase 4.8nel protocollo B per creare una superficie completamente funzionale. Prima di eseguire protocollo A e B: Si consiglia di filtrare tutte le soluzioni proteiche utilizzato prima di introdurli nel chip. Detriti e aggregati proteici possono altrimenti bloccare trappole cellulari, riducendo così il numero di camere che possono essere utilizzati per l&#39;analisi. A questo scopo, utilizzare un nonprotein unità filtro assorbente per filtrare tutte le soluzioni prima di introdurli nei canali. Protocollo A (saggi enzimatici) <ol><li> Per finalizzare il dispositivo microfluidica, legare le parti PDMS su un vetrino. Per fare questo, prima pulire un vetrino con sapone, acqua distillata ed etanolo. Essiccare vetrino utilizzando un flusso di azoto. Pulire la parte PDMS con lo scotch. </li><li> Mettere la parte PDMS e il vetrino pulito nel pulitore plasma per 45 sec a 18 W. Per garantire un legame stretto, mettere il chip su una piastra calda (100 ° C) per 5 min. </li><li> Dopo l&#39;incollaggio, riempire il chip con fLUID. Un modo semplice per raggiungere questo obiettivo è quello di utilizzare la forza centrifuga. Tagliare la parte inferiore della punta di 200 microlitri pipetta. Per i canali fluidici, riempirli con la soluzione di saturazione (albumina di siero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicole polietilene innestato (0.05% w / v) e posizionare le punte nelle prese. Riempire le insenature livello di controllo con acqua o con una soluzione isosmotic, ad esempio PBS. Posizionare il chip nella centrifuga (800 xg) per 5 min. I canali dovrebbero essere ora pieni di liquido completamente. In caso contrario, ripetere questo passaggio. </li><li> Incubare la soluzione di saturazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare la soluzione di strato di fluido con PBS ad una portata di 10 microlitri / min utilizzando una pompa a siringa. Il dispositivo è ora pronto per esperimenti sulle cellule. </li></ol> Protocollo B (i dosaggi) Per una panoramica completa della modifica della superficie dal punto 4.7 in poi, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. <ol start="5"><li> InPDMS cubate Stamp per la stampa microcontact con una soluzione bBSA / BSA (es 1-100). Dopo 30 min, pulire i francobolli accuratamente con acqua distillata e asciugare il timbro in corrente di azoto. Introdurre rapidamente i francobolli su un vetrino pulito (Figura 4). </li><li> Esporre il vetrino con il timbro insieme alla parte superiore del chip microfluidica di plasma di ossigeno per 45 sec a potenza massima (18 W) e un detersivo plasma. Dopo il trattamento al plasma, rimuovere il timbro e allineare la superficie stampata sotto le microchambers del dispositivo. Posizionare il chip per 30 min su una piastra calda a 50 ° C. </li><li> Per bloccare la rimanente superficie, introdurre soluzione filtrata sterile BSA (4% (w / v) in PBS) nel chip con una centrifuga (vedi fase 4.2). Incubare per 1 ora e lavare la soluzione fuori dello strato di fluido con PBS (vedi passo 4.3). Il chip può essere utilizzato direttamente o conservata fino a 2 settimane a 4 ° C in un contenitore umido. </li><li> Per un tensioattivo vincolante completamente funzionalee, introdurre avidina (0,025% (w / v) in PBS) nel serbatoio. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per 30 min a ritirare la soluzione avidina attraverso i canali del fluido. Successivamente, lavare PBS per 10 min. Sciacquare accuratamente il serbatoio. </li><li> Successivamente, aggiungere proteine ​​G (0,0025% (w / v) in PBS) e filo per altri 30 min. Lavare con PBS per altri 10 min dopo. Successivamente, aggiungere l&#39;anticorpo di interesse (0,0001% (w / v) in PBS) per 10 min. Dopo 10 minuti, fermare il flusso per 15 minuti per consentire il legame. Successivamente, lavare con PBS per 10 min. </li></ol> 5. Esperimenti cellulari Il protocollo è scritto in termini generali, a causa della varietà di possibili saggi. Come esempio i reagenti necessari per il saggio di tossicità G6PDH sono dati. La cella cattura efficienza iniziale del dispositivo è di circa 2,5%, vale a dire 5 di 200 cellule saranno intrappolati. L&#39;occupazione finale delle trappole cellula dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata, il protocollo di sospenderela linea cellulare e il tempo le cellule sono irrigati attraverso il canale. Per le cellule naturalmente crescono in sospensione (ad esempio U937), singole cellule possono essere trovati in circa il 75% delle camere dopo pochi minuti. Le altre camere non sono o pieni, o occupati da due o più celle. In generale, l&#39;occupazione cella singola è minore per linee cellulari aderenti. Quando si utilizza il protocollo di sospensione piuttosto mite qui presentato, la percentuale diminuisce a circa il 30% (HEK, cellule MLT). L&#39;occupazione singola cellula può essere migliorata mediante trattamento con tripsina delle cellule, ma puo anche alterare i risultati degli esperimenti. A seconda della molecola bersaglio, adsorbimento o assorbimento di PDMS possono influenzare i risultati. Adsorbimento può essere ridotta bloccando le superfici con BSA o PLL-g-PEG. L&#39;assorbimento è improbabile che la maggior parte delle biomolecole idrofile, ma dovrebbe essere controllato per (piccoli) componenti cellulari lipofile. <ol><li> Preparare le cellule secondo il protocollo specifico (ad esempio </em&gt; tossicodipendenza). Per cellule in sospensione, aggiungere celle direttamente al chip. Per linee cellulari adesive, utilizzare tampone dissociazione senza enzima per produrre una sospensione cellulare. Filtrare le cellule prima di introdurle al chip per ridurre la quantità di gruppi di cellule. </li><li> Caricare le cellule sul chip mediante una pompa a siringa e portata avanti, piuttosto che di ritirare la sospensione cellulare. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per linee cellulari sospensione e portate maggiori di 10-20 ml / min per le cellule adesive da ridurre attaccamento aspecifica delle cellule sulle pareti del canale. </li><li> Quando le trappole sono pieni, chiudere le camere. Se molte cellule aderiscono non specifico alla superficie, cercare di lavarli via con tampone di dissociazione cellulare ad una portata di 10-30 ml / min. </li></ol> Protocollo A (saggi enzimatici) <ol start="4"><li> Prelevare tampone di lisi attraverso il chip. Per questo esempio, questo buffer è un buffer hypoosmolar con aggiunta di Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1% (v / v) di Tween 20). Per lisi, camere rapidamente aprire e chiudere (cioè 500 msec per portate di 10-50 ml / min 7,21). Per il saggio G6PDH, aggiungere 2 mM di glucosio-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml diaforasi e 0,3 mM resazurin al tampone di lisi. Avviare il monitoraggio della cinetica di reazione subito dopo la lisi. </li></ol> Nota: Scegliere una tampone che è adatto per il test, ma nudo in mente che detergenti aggressivi (come Triton, SDS), le cellule Lisare immediatamente e porterà ad una perdita di analita durante l&#39;apertura della camera. Protocollo B (i dosaggi) Per una breve descrizione degli esperimenti ELISA cellulari (le portate, stato da camera, ecc), si prega di fare riferimento alla Tabella 1. <ol start="5"><li> Per ELISA, aggiungere il reagente di rilevamento richiesto (es anticorpo secondario, antigene marcato) direttamente al tampone di lisi. Il presente documento ha aggiunto Tween 20 riduce l&#39;adsorbimento non specifico. Lisare le celle in base al punto 5.4. Incubare la miscela per 10-15 minuti per consentire la rilegatura (tempo di incubazione a seconda dell&#39;antigene utilizzato e anticorpo). </li><li> Coniugati anticorpo enzimatico che adsorbiti aspecifico alle pareti del canale possono portare ad una conversione del reagente di rilevamento già all&#39;interno del serbatoio e canali. Per ridurre i problemi di questa adsorbimento, lavare un inibitore permanente dell&#39;enzima rilevamento utilizzato attraverso il chip durante il tempo di incubazione (camere chiuse, prima di aggiungere il reagente di rilevamento). Per HRP, usare HCl 20 mM in acqua per inattivare gli enzimi aspecifico definitivamente assorbiti. </li><li> Dopo il tempo di incubazione, introdurre il reagente di rilevamento (es Amplex rosso e perossido di idrogeno per HRP) al chip. Aprire le camere di nuovo brevemente per lavare l&#39;anticorpo secondario nonbound distanza e aggiungere il reagente di rilevamento. Avviare il monitoraggio della reazione cinetica immediatamente. </li><li> Calibrazione: Immobilizzarel&#39;anticorpo contro il bersaglio di interesse. Chiudere camere. Preparare diverse concentrazioni di analita in tampone o in lisato cellulare off-chip. Applicare una concentrazione al chip e scambiare rapidamente il volume all&#39;interno delle camere (500 msec tempo di apertura). Questo tempo di apertura è sufficientemente breve per evitare un ulteriore accumulo si verifica da analita lavaggio, e solo un numero specifico di molecole dal volume della microcamera vengono rilevati. Dal noto concentrazione dell&#39;antigene all&#39;interno della soluzione e il volume della camera (625 pl), calcolare la quantità all&#39;interno della camera. Successivamente, continuare con il passo 5.5 e introdurre la parte di rivelazione. </li></ol>

<ol>
	<li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays.">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li><li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+single+cell+analysis.">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li><li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+single+cell+analysis:+from+promise+to+practice.">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li><li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel.">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li><li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+enzyme+concentrations,+kinetics,+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays.">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li><li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis.">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules.">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li><li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li><li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells:+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines.">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).</li><li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+polarity,+stem+cells+and+cancer.">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology.">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li><li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR.">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li><li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells.">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li><li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion.">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li><li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping.">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+(G6PD):+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress.">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l&#39;analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi cit...

Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all&#39;interno di una vasta popolazione di cellule 1-3, in particolare segnalazione elabora 4 o la quantità di biomolecole come proteine ​​intracellulari 5,6, metaboliti e cofattori 7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l&#39;adattamento delle cellule e l&#39;evoluzione 9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro 10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi studi rivelano le diverse risposte delle cellule dopo trattamento con sostanze chimiche bioattive. Negli ultimi anni, molte piattaforme analitiche sono state sviluppate che facilitano l&#39;analisi di cellule viventi singole o la composizione chimica del contenuto cellulare. Mentre fluorescente delle cellule attivate (FACS) è l&#39;oro stAndard per analisi molto alto-capacità di singole cellule viventi, il metodo non può essere impiegato per la quantificazione di composti intracellulari o secrete. L&#39;emergere di piattaforme microfluidica ha promesso nuove strategie analitiche per il posizionamento, il trattamento e l&#39;osservazione delle singole cellule. Una pietra miliare nella microfluidica è stato raggiunto con l&#39;integrazione di PDMS valvole flessibili realizzate da Quake e collaboratori 14,15. Queste valvole sono utili poiché possono isolare regioni sul chip, ad esempio separare due culture 16. Inoltre, sono particolarmente applicabile per l&#39;analisi di singole cellule e quindi contribuire a ridurre i problemi di diluizione degli analiti. La potenza di questo approccio per l&#39;analisi singola cellula è stato recentemente dimostrato da Hansen e colleghi, che hanno analizzato l&#39;espressione genica da centinaia di singole cellule in parallelo 17. Quando il targeting proteine ​​e metaboliti, l&#39;analisi è molto difficile a causa della mancanza di un adeguatometodi mplification, il gran numero di diversi composti presenti, e le loro variazioni di natura chimica. Inoltre, la maggior parte delle biomolecole intracellulari dovrebbero essere presenti in basso numero di copie nell&#39;ordine di qualche decina di migliaia 18, da cui il metodo analitico utilizzato deve avere una elevata sensibilità. Saggi più potenti come immunosaggi e immunoenzimatici (ELISA) sono difficili da integrare in dispositivi microfluidici quanto richiedono vari lavaggi e le fasi di incubazione e immobilizzazione superficie. A causa di questi problemi, non è sorprendente che solo alcuni esempi sono stati riportati in cui le proteine ​​o metaboliti sono stati quantificati a livello di singola cellula. Per esempio, studi sulla secrezione di composti fluorescenti sono stati segnalati 19,20. Recentemente, l&#39;implementazione con ELISA è stata presentata per l&#39;analisi di secrete (non fluorescente) proteine ​​da una coltura cellulare (cellule THP-1) 21 e singolo (immune) cellule 10. Targeting proteine ​​intracellulari, Shi et al. Sviluppato un dispositivo microfluidico che ha facilitato l&#39;identificazione di proteine ​​intracellulari per l&#39;analisi delle vie di segnalazione nelle cellule tumorali mediante un immunodosaggio 11. Tuttavia, solo quantità relative di proteine ​​sono stati determinati e nessuna amplificazione enzimatica è stato utilizzato per aumentare il segnale per le proteine ​​a bassa abbondanza. Recentemente, siamo stati in grado di combinare una cella singola cattura Microdevice con saggi di fluorescenza 8 e immunoassays 22 (Figura 1). Le cellule sono passivamente intrappolati in strutture ostacolo microsized, che permettono di alimentazione e (rapido) scambio di medie e di altri agenti chimici senza alcun movimento delle cellule. Una valvola ad anello attorno a ciascuna trappola consente l&#39;isolamento della cella in un volume molto piccolo (&quot;microcamera&quot;). Questa valvola viene attivata subito dopo aver introdotto una cella-lisi (hypoosmolar) tampone, eglince prevenire molecole intracellulari o molecole secrete a diffondere via. Ancora più importante, a causa delle ridotte dimensioni del volume (625 pl) è evitata grande diluizione delle molecole. Inoltre, poiché lisi e analisi vengono eseguite nella stessa posizione nel chip, non vi è alcuna perdita di analiti dovuti al trasporto. La progettazione di chip qui descritto comprende 8 righe alterne di 7 o 8 microchambers, per un totale di 60 microchambers. Le camere sono azionati in file, in modo che la contaminazione incrociata lungo una linea è preclusa. La piattaforma può essere utilizzata in combinazione con saggi di fluorescenza e test immunologici (Figura 1D). Per questi ultimi, abbiamo stabilito protocolli per l&#39;immobilizzazione degli anticorpi, che sono compatibili con la produzione di chip e processo di assemblaggio. Quindi la piattaforma apre la strada a test sensibile, affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l&#39;analisi di ienzimi ntracellular e secrete (quantificazione relativa da saggi enzimatici), cofattori intracellulari, proteine ​​e piccole molecole (quantificazione assoluta mediante saggi endpoint o ELISA). Nel seguito si descrive il processo di fabbricazione di chip mediante multistrato litografia morbida e protocolli per patterning degli anticorpi tramite stampa microcontact e chimica di superficie. Inoltre, alcuni esempi di utilizzo del chip e le operazioni sono dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All&#39;attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l&#39;alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l&#39;analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l&#39;analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.

La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine ​​(figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (201...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells at JoVE.com

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l&#39;analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  ETH Zurich, Switzerland.  In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici. 

Video: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Un Microfluidic basato Trappola idrodinamico per particelle singole

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Il Chip Multi-organo - Una piattaforma Microfluidic per lungo termine co-coltura Multi-tessuto

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...