Questo metodo aiuta a capire come i tassi di secrezione cambiano nel tempo e come le cellule rispondono ai segnali solidi variabili nel tempo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che il suo basso costo richiede poca formazione e la configurazione del sistema di profusione può essere adattata per nuovi esperimenti. Iniziare riempiendo una siringa con una soluzione di fondo e caricarla nella prima pompa della siringa.
Riempire un'altra siringa con una soluzione tracciante e caricarla nella seconda pompa della siringa. Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie utilizzando connettori luer. Chiudere il rubinetto alla soluzione di fondo e pompare la soluzione tracciante nel rubinetto fino a quando non gocciola fuori dalla porta aperta.
Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa. Assicurarsi che la barra mobile delle pompe a siringa sia spinta verso l'alto contro gli stantuffi della siringa in modo che il flusso inizi immediatamente all'avvio della pompa. Chiudere il rubinetto alla soluzione tracciante e pompare la soluzione di fondo nel rubinetto fino a quando tutta la soluzione di tracciante residua non è stata scaricata dalla porta aperta.
Arrestare la pompa e non regolare ulteriormente la siringa. Impostare il componente del sistema di flusso desiderato per l'analisi RTD. Inserire l'estremità in un distributore di punta della pipetta e pompare la soluzione di sfondo attraverso il componente fino a quando non è completamente riempito.
Impostare la pompa per la soluzione tracciante sulla portata desiderata. Chiudere il rubinetto alla soluzione di sfondo e avviare il flusso della soluzione tracciante. Allo stesso tempo, avviare il collettore di frazioni.
Continuare il flusso della soluzione tracciante per un breve periodo di tempo per approssimare un input di impulso del tracciante. Una durata dell'impulso di 10 minuti è raccomandata per gli RTD ad una portata di un millilitro all'ora. Arrestare la pompa della soluzione tracciante alla fine del periodo di impulso della soluzione tracciante.
Chiudere rapidamente il rubinetto alla soluzione tracciante e avviare il flusso della soluzione di fondo alla stessa portata. Lasciare che la soluzione di fondo fluisca e raccolga le frazioni fino a quando tutto il tracciante non è passato attraverso il sistema e nelle frazioni raccolte. In condizioni sterili, inserire i tappi con aghi nelle colture di piastre del pozzo con gli aghi tirati su.
Dopo che il tappo è in posizione, abbassare gli aghi all'altezza desiderata per la perfusione poiché l'altezza dell'ago di uscita determina il livello stabile del liquido. Tappare gli aghi con tappi di luer maschio e tenere l'intera piastra del pozzo in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius fino all'uso. Preparare i due mezzi da utilizzare per la perfusione, etichettando il mezzo che verrà erogato prima come uno e l'altro mezzo due.
Per ogni coltura da perfusare, riempire una siringa con una media per durare l'intera durata della sua erogazione più un volume sufficiente per riempire inizialmente il sistema di perfusione. Riempire una seconda siringa con due medie per durare per tutta la durata della sua erogazione. Collegare entrambe le siringhe a due delle tre porte di un rubinetto a quattro vie.
Può essere necessaria una lunghezza di tubo per collegare le siringhe ai rubinetti. Preparare i rubinetti chiudendo il rubinetto per il mezzo uno e distribuendo il mezzo due nel rubinetto fino a quando non inizia a gocciolare fuori dalla porta aperta. Quindi chiudere il rubinetto per il mezzo due ed erogare il mezzo uno nel rubinetto fino a quando tutto il mezzo residuo due non è stato espulso dalla porta aperta.
Collegare il tubo a monte alla porta aperta del rubinetto utilizzando un connettore femmina a barb luer. Inserire un connettore maschio a barbo sull'altra estremità del tubo. Erogare il mezzo uno dalla siringa fino a quando il tubo a monte non viene riempito con il mezzo e procedere con la preparazione del tubo a valle come dimostrato in precedenza.
Inserire un connettore luer maschio a barbo in un'estremità del tubo a valle e tapparlo con un cappuccio luer femmina. Portare con cura tutti i tubi preparati, le siringhe e la piastra del pozzo nell'incubatore che verrà utilizzato per la perfusione. Posizionare la pompa della siringa e il collettore di frazione nelle posizioni desiderate vicino all'incubatore.
Posizionare la pompa della siringa sopra o vicino all'incubatore e posizionare il collettore di frazione accanto all'incubatore vicino al porto. Caricare le siringhe nella pompa. Raggruppare le estremità coperte di tutti i tubi a monte e a valle e spingerli dall'esterno dell'incubatore verso l'interno attraverso la porta.
Inserire le estremità aperte dei tubi a valle nelle punte delle pipette di erogazione del distributore multitesta del collettore di frazione. All'interno dell'incubatore, tirare il più possibile i tubi a monte nell'incubatore per massimizzare la lunghezza del tubo attraverso il quale il mezzo che scorre può ricevere calore e anidride carbonica. Per ogni pozzetto collegato, scollegare rapidamente gli aghi e i tubi a monte e a valle per quel pozzo, quindi collegarli insieme ai loro connettori luer.
Una volta collegate tutte le parti, far scorrere brevemente la pompa della siringa a una velocità relativamente elevata per assicurarsi che tutti i flussi scorrano correttamente. A questo punto, se si desidera iniziare l'esperimento con i tubi a valle pieni del mezzo, continuare a far funzionare la pompa fino a quando tutti non sono pieni, altrimenti, fermare la pompa. Impostare la portata della pompa della siringa per il medio uno e la frequenza di raccolta delle frazioni e avviare entrambe le macchine contemporaneamente per iniziare l'esperimento.
Quando è necessario sostituire la sorgente media, arrestare rapidamente la pompa della siringa per quella media. Ruotare il rubinetto chiuso a medio uno e avviare la pompa della siringa per il mezzo due. Se lo si desidera in seguito, riportare la sorgente a quella media in modo simile.
Raccogli le frazioni per la durata dell'esperimento desiderata. Le concentrazioni di traccianti nelle frazioni di due esperimenti di RTD sono state misurate e immesse nell'RTD dallo script MATLAB di dati per produrre i due RTD. Tubi singoli e più pezzi di tubi in serie si adattano bene a un singolo modello di dispersione assiale e l'aggiunta di una piastra di 48 pozzetti perfusi in linea ha causato una deviazione trascurabile che consente sia all'RTD del tubo di un metro che all'RTD dell'intero sistema di adattarsi alle funzioni di dispersione assiale.
Un esempio di scarsa aderenza al modello è stato dimostrato utilizzando il modello di dispersione assiale montato sui dati RTD del tubo di un metro ed è stato tracciato insieme ai dati. Le ipotesi dei parametri iniziali sono state modificate per produrre un buon adattamento del modello in cui tau era approssimativamente uguale al volume del sistema di perfusione diviso per la sua portata volumetrica. Un impulso di 90 minuti di TNF-alfa è stato definito come il segnale di ingresso al sistema ed è stato coinvolto con l'RTD del tubo di un metro per determinare il segnale TNF-alfa all'ingresso della piastra del pozzo.
Il segnale di ingresso è stato anche coinvolto con l'RTD dell'intero sistema per determinare il segnale TNF-alfa all'uscita del sistema nelle frazioni raccolte. Le cellule HEK 293 sono state progettate per secernere GLuc guidato da un promotore contenente l'elemento di risposta NF-kappaB. L'esperimento ha rivelato un significativo aumento dell'espressione e una lenta diminuzione dell'espressione di GLuc guidata da NF-kappaB dopo l'esposizione al TNF-alfa.
Le variazioni del sistema sono descritte nel documento di accompagnamento, inclusa una configurazione più semplice per gli esperimenti che non richiedono l'immissione di segnali e l'esposizione delle cellule a profili di soluto connettivo pharma-hu.
