Name: phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli
Uploaded: 2016-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli at JoVE.com

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dalla Fondazione Bettencourt Schueller a sostegno della squadra di Parigi Bettencourt iGEM. Ringraziamo l&#39;unità di ricerca INSERM U1001 e Chantal Lotton per l&#39;assistenza tecnica e consulenza. Fagemidi Litmus28i_J23115-B0032-GFP è stato fornito da Monica Ortiz e Drew Endy della Stanford.

1. Progettazione e Costruzione di fagemide Vettori cuscinetto sRNA Silencing Cassette <ol><li> De Novo Progettazione di Srna silenziatori cassette 8 <ol><li> Identificare la sequenza completa del mRNA per essere silenziato utilizzando un database di sequenze di DNA. Per generare la sequenza bersaglio, si noti il primo 24 bp della sequenza codificante, dalla posizione 1-24 a partire dal codone di inizio (ad esempio, ATG). Nota: silenziamento è meno efficiente quando altri siti o segmenti di mRNA sono mirati 8. </li><li> Prendere il complemento inverso della sequenza bersaglio per produrre la sequenza GUIDA per la cassetta sRNA. Vedi Tabella 1 per esempi di Target e guida sequenze per cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). </li><li> Per progettare il 292 bp espressione sRNA completa cassetta, organizzare Pr promotore, sequenza GUIDA, Hfq proteina dominio di legame e T1 / TE sequenze di terminazione di trascrizione in serie (Tabella 2). </li><li> Aggiungere ulteriori siti di clonazione di scelta per facilitare la clonazione della cassetta sRNA nel vettore di destinazione. </li><li> Ottenere la cassetta completa sRNA attraverso la sintesi del gene commerciale o un metodo simile e clonarlo in ogni vettore fagemidi con una origine di replicazione f1 funzionale 11. Vedere informazioni di supporto per la sequenza completa del vettore fagemide finale. </li></ol></li><li> Alterare la sequenza di mira da un cassetto sRNA Expression esistente utilizzando Site PCR-based Directed Mutagenesi 12 <ol><li> Identificare la sequenza GUIDA 24 bp in una cassetta di espressione sRNA esistente. Nota: Il plasmide pAB.001 annotato, utilizzato in questo lavoro, è disponibile come file di sequenza supplementare. </li><li> Progettazione primer con brevi regioni di omologia alla cassetta sRNA esistente che fiancheggia la nuova sequenza GUIDA 24 bp in avanti e indietro. Ottenere i primer attraverso la sintesi di oligonucleotidi commerciale. Nota: progettazione Primer per mutagenesi sito-diretta è depicTed in Figura 2. sequenze di modelli di primer esatta sono riportati nella Tabella 3. </li><li> Preparare una cultura 5 ml di E. coli che trasportano il fagemide modello sRNA espressione. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. </li><li> Estrarre e purificare l&#39;espressione fagemide modello sRNA dalla coltura batterica 5 ml utilizzando un kit miniprep DNA o metodo simile 12. </li><li> Preparare due reazioni PCR utilizzando il fagemide template sRNA espressione e alta fedeltà polimerasi, una con l&#39;avanti e uno con il primer reverse (Tabella 4). Utilizzare condizioni di PCR come raccomandato dal fornitore polimerasi (Tabella 5). Aumentare la concentrazione modello per 10-50x superiore ad una reazione normale per tenere conto del fatto che la reazione singolo innesco non produce l&#39;amplificazione esponenziale. </li><li> Unire le due reazioni PCR di cui sopra in una provetta. Annealitro, i prodotti di riscaldamento a 98 ° C in un bagno di acqua bollente. Immediatamente dopo aver piazzato la provetta nel bagno d&#39;acqua, rimuovere la fonte di calore e lasciare il bagno per tornare lentamente alla temperatura ambiente per 1-2 ore. </li><li> Per eliminare l&#39;immutata modello sRNA espressione fagemidi, aggiungere 1 ml. DpnI enzima di restrizione al composto e incubare a 37 ° C per 1 ora, o il tempo raccomandato dal produttore per completa digestione. Nota: DpnI digerisce siti bersaglio solo denaturato, che sono presenti sul fagimidi host replicato, ma non i prodotti di PCR. </li><li> Transform acquistati o preparati 13 chimicamente competente E. coli con 1-5 ml di prodotto PCR ricotto. Isolare singole colonie del ceppo trasformato dalla placcatura selettiva su piastre di agar LB contenenti antibiotici appropriati. </li><li> Per verificare l&#39;incorporazione della sequenza GUIDE corretta, schermare le colonie risultanti da colonia PCR. Usando una punta della pipetta 200 microlitri, collect una piccola quantità di cellule da una singola colonia trasformata. Marco e preservare la colonia originale per l&#39;uso a valle dopo la verifica. </li><li> Aggiungere le cellule raccolte a 50 ml di acqua priva di nucleasi in una provetta. Mescolare pipettando su e giù. </li><li> Utilizzando un termociclatore banco o un bagno di acqua bollente, lisare le cellule mediante riscaldamento a 95 ° C per 2 min. </li><li> PCR-amplificare la regione fagemide usando 1 ml di cellule calore lisati come uno stampo di DNA. Condizioni di PCR e protocolli Thermocycler sono forniti nelle Tabelle 6 e 7. Vedere il file di sequenza pAB.001 supplementare per le sequenze di verifica di primer. </li><li> Sequenziare il prodotto di PCR per verificare l&#39;incorporazione della sequenza GUIDE corretta. </li><li> Inoculare una cultura 5 ml di E. clone coli che trasportano l&#39;espressione sRNA fagemide sequenza verificato. Crescere le cellule notte a 37 ° C con agitazione, in terreni selettivi LB. </li><li> Preparare uno stock di glicerolodel clone sequenza verificato. Aggiungere 750 ml di cultura durante la notte a 250 ml di 60% glicerolo in una provetta crio tappo a vite. </li><li> Conservare lo stock di glicerolo a -80 ° C a tempo indeterminato. Il resto della cultura durante la notte può essere utilizzato come fonte per l&#39;espressione fagemide sRNA nel passaggio 2. </li></ol></li></ol> 2. Produzione e raccolta di titoli fagemide M13-confezionati <ol><li> Preparare una cultura 5 ml di E. coli che trasportano l&#39;espressione fagemide sRNA. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. Nota: L&#39;espressione fagemidi sRNA può essere ottenuto attraverso la clonazione de novo come descritto al punto 1.1.5, o modificato da un fagemide esistente e raccolta in fase 1.2.16. </li><li> Analogamente preparare una coltura 5 ml di E. coli che trasportano l&#39;assistente plasmide M13KO7. Crescere le cellule notte a 37 ° C con agitazione, in terreni selettivi LB. </li><li> Estrarre e purificare il expressio sRNAn fagemidi e plasmide helper utilizzando un kit di estrazione del DNA o un metodo simile 12. </li><li> Cotransform acquistato o preparato 13 chimicamente competenti di E. coli con 1 ml ciascuno di sRNA espressione fagemide e plasmide helper. Selezionare per cotransformants dalla placcatura in LB agar con antibiotici selettivi per entrambi i costrutti. </li><li> Preparare una cultura 10 ml da una singola colonia del ceppo cotransformed in LB con antibiotici selettivi. Incubare a 37 ° C con agitazione per 8-12 ore o durante la notte. </li><li> Centrifugare la coltura a 3.300 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron. Attenzione: in caso di fuoriuscita di supporti, pulire l&#39;area con diluito candeggina (0,5%) per distruggere particelle fagiche infettive. </li><li> Conservare il filtrato fagemide confezionato a 4 ° C. Nota: I campioni possono essere mantenuti per giorni o settimane, senza perdita di attività. </li></ol> 3. Preparazione di cellule F + obiettivo per tacere <ol><li> Determinare se le cellule devono essere mirati per tacere esprimono il pilus F 14. Se il pilus F è già presente, passare al punto 4. Nota: ceppi di laboratorio comuni di E. coli annotati come F + o F &#39;per indicare la presenza del pilus F nel loro genoma o su un plasmide. </li><li> Ottenere un ceppo F + di E. coli quali TOP10F &#39;. Nota: Assicurarsi che il ceppo bersaglio porta un marcatore di resistenza unica al fine di essere separato dal donatore F-plasmide dopo coniugazione. </li><li> Per introdurre F pilus da coniugazione con un ceppo F +, preparare 5 ml culture sia del ceppo bersaglio e donatore di F-14 plasmide. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. </li><li> Il giorno seguente, diluire entrambi i ceppi 1: 100 in 5 ml di LB selettiva e continuare la coltura a 37 ° C con agitazione. </li><li> Determinare la fase di crescita delle cellule misurando la optDensità iCal della cultura a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro da banco. Coltivare le cellule per circa 2 ore, fino un OD 600 di 0,3 è raggiunto, indicando fase di crescita logaritmica 15. </li><li> Preparare le reazioni 3 coniugazione in provette da microcentrifuga: 0,5 ml F-plasmide ceppo donatore + 0,5 ml di destinazione, 0,5 ml F-plasmide donatore + 0,5 ml LB supporto (controllo negativo) e 0,5 ml di destinazione ceppo + 0,5 ml LB supporto (controllo negativo). Lasciare che la coniugazione di procedere per 2 ore a 37 ° C con agitazione. </li><li> Piastra 100 ml di ogni reazione di coniugazione sul selettivo agar LB con antibiotici specifici per l&#39;F-plasmide (tipicamente tetraciclina) e ceppo bersaglio. Piastra le reazioni di controllo negativo per confermare che né donatore o ricevente ceppo esprimono entrambe le resistenze agli antibiotici. </li></ol> 4. L&#39;infezione da fagimidi confezionato per tacere <ol><li> Inoculare una singola colonia di cellule bersaglio F + in una cultura 5 ml di LB mediuna con antibiotici appropriati. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione. </li><li> Il giorno seguente, diluire le cellule bersaglio F + 1: 100 in 5 ml di terreni selettivi LB e continuare a coltura a 37 ° C con agitazione. </li><li> Determinare la fase di crescita delle cellule misurando la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro da banco. Coltivare le cellule per circa 2 ore, fino un OD 600 di 0,3 è raggiunto, indicando fase di crescita logaritmica 15. Nota: L&#39;espressione della pilus e l&#39;infezione efficienza F è più alta in fase di log. </li><li> Aggiungere i fagimidi M13-confezionati (dal punto 2.6) alle cellule bersaglio in un rapporto in volume di 1: 100 per ottenere l&#39;infezione quasi il 99% della popolazione target. Lasciare che l&#39;infezione di procedere a 37 ° C con agitazione per 30-60 min. </li><li> Analizzare i fenotipo sRNA-silenziamento secondo il metodo di scelta. Nota: Per un bersaglio proteina fluorescente, l&#39;effetto di silenziamento può essere quantificatodirettamente fluorimetria 10. In alternativa, saggi fenotipici possono essere utilizzati per osservare le conseguenze fenotipiche di silenziamento genico 8. </li><li> Preparare uno stock di glicerolo per il sRNA esprimono ospite fagemidi seguendo i passaggi 1.2.14-1.2.16. Nota: il fagemide si propaga nel ceppo ospite indefinitamente e può essere mantenuto con antibiotico simile ad un plasmide convenzionale. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il presente metodo ha raggiunto riduzione del 80% dei livelli di fluorescenza mKate rispetto ai controlli mirati. Ciò è in linea con altri metodi di knockdown RNA, dove completa silenziamento non si osserva ed efficienza 50-90% è tipico 16,17. A livello fenotipico, atterramenti CAT mirati sono stati in grado di attenuare in modo significativo la resistenza cloramfenicolo, ed eliminarlo in alcune condizioni. Il fenotipo knockdown era rilevabile a livello di popolazione dopo poche ore post-infezione (Figura 3B). Questo illustra una caratteristica importante della consegna fago-based: una frequenza atterramento elevato può essere ottenuto direttamente in coltura batch senza previa modificazione genetica. A differenza di modificazioni genetiche convenzionali che utilizzano la trasformazione plasmide o l&#39;integrazione genomica, l&#39;infezione fagi non richiede che una popolazione sia nuovamente cresciuto da una singola colonia isolata. Questo permette gli effetti delle infezioni fago siano explorEd in popolazioni con dinamiche spaziali complessi 11, con strutture spaziali pre-esistenti, come biofilm 18, o in popolazioni naturali geneticamente misti 19. Un punto critico di questo metodo è la produzione di fagemide impaccato ad alto titolo. L&#39;onere metabolico associato alla produzione di fago di particelle può portare ad alto tasso di mutazioni o perdite plasmide nel ceppo produttivo fagemide. Si raccomanda che il fagemide ceppo produttivo essere coltivato direttamente da una singola colonia cotransformed e non refrigerati, congelati o sub-coltura prima del raccolto fago. Una scarsa efficienza di co-trasformazione può anche essere osservato nell&#39;introdurre il fagemide e helper plasmide di E. coli contemporaneamente. In questo caso, maggiori efficienze possono essere ottenuti trasformando il plasmide helper, poi la preparazione di cellule competenti recanti il ​​plasmide helper per la successiva trasformazione con il fagemide. Phainfezione gemid o l&#39;espressione sRNA impone anche un onere metabolica rilevabile sulle cellule bersaglio, e può comportare qualche perturbazione fenotipica. Per esempio, una riduzione mKate2 fluorescenza è stata osservata anche quando le cellule sono state infettate con un fagemide di targeting CAT (Figura 3). L&#39;infezione da M13 non è pensato per innescare risposte allo stress sistemici in E. coli 20, ma può alterare i modelli trascrizionale indirettamente. In alternativa, i marcatori GFP o di resistenza ampicillina inclusi sul fagemide possono competere per le risorse cellulari, riducendo espressione e di crescita 9 mKate2. Infine, la cassetta sRNA si può modificare a livello globale profili di espressione genica titolando la proteina Hfq, o tramite fuori bersaglio mRNA silenziamento. Bersaglio Effetti Off sono comuni in in vivo RNAi mira 21-23, ma hanno ancora essere indagato in modo sistematico per questo sistema. Una limitazione di questo metodo è che l&#39;effi infezionecienza è inferiore al 100%, consentendo alcuni batteri non infetti di persistere nella popolazione. I risultati di questo lavoro e di lavoro precedente 10 suggeriscono che le cellule non infette rappresentano il 1-10% della popolazione finale, e sono responsabili per la maggior parte dei fenotipi nonsilenced osservati. Una varietà di rotte per M13-resistenza sono noti, con il più comune è la perdita mutazionale di espressione pilus 24. Alla luce di queste limitazioni, i controlli devono essere utilizzati per confermare alti tassi di infezione e l&#39;efficienza atterramento. Un&#39;altra limitazione potenziale per alcune applicazioni è il trasferimento occasionale di contaminare helper fago. Sebbene M13K07 contiene un segnale di confezionamento mutato, può essere confezionato in fago capside a bassa frequenza e trasferito alle popolazioni infetti, con conseguente cellule competenti per la produzione di fago e la continua diffusione del fago oltre l&#39;evento infezione iniziale 25. Le modifiche al fago helper si sono dimostrati efficacia riduzione degli imballaggi non specifico, anche se a volte a costo di produzione ridotto fago 26. Batteriofago Engineered sono diventati uno strumento indispensabile per E. biologia sintetica coli, consentendo la consegna rapida di nuovi geni di una popolazione in crescita. Un recente lavoro ha prodotto circuiti di comunicazione intercellulare 11 o espresso fattori di trascrizione per sopprimere la resistenza agli antibiotici vie di diffusione 27. Il protocollo presentato qui aggiunge una crescente collezione di strumenti che permettono il controllo della fisiologia batterica attraverso RNA programmati. Nucleasi CRISPR-Cas, quando mutati per eliminare l&#39;attività nucleasi, hanno dimostrato di reprimere la trascrizione di geni a bersagli di RNA-guida 17,28. Al contrario, sRNA silenziamento funziona a livello traduzionale e non richiede l&#39;espressione della proteina esogena. biotecnologie di nuova generazione possono unire controllo trascrizionale e traslazionale con consegna fago mediata da programmare fenotipo complessotipi in tempo reale.

atterramenti geni RNA-mediata procedere in due fasi. Innanzitutto, una molecola di RNA viene introdotto ad una linea cellula o organismo di studio. In secondo luogo, endogeni RNA-binding proteins facilitare il riconoscimento di RNA-target e produrre l&#39;effetto di silenziamento. Tutte le tecnologie RNA knockdown beneficiano natura personalizzabile sRNAs sintetici, che può essere facilmente realizzato per corrispondere a un target specifico di interesse. Tuttavia, i dettagli molecolari di RNA assorbimento e silenziamento variano ampiamente tra sistema modello, vincolando dove e come abbattimenti di RNA possono essere applicati. In nematodi, RNA a doppio filamento (dsRNA) molecole può essere introdotto direttamente nei media o alimentando i vermi, con una popolazione di dsRNA che esprimono E. coli 1,2. In Drosophila, RNAi possono essere raggiunti microinjecting embrioni con dsRNA 3, o attuare linee cellulari semplicemente aggiungendo dsRNA al mezzo di coltura 4. In linee cellulari di mammifero,sintetici piccoli RNA interferenti (siRNA) possono essere consegnati alle cellule viventi mediante elettroporazione 1,2,5, confezionato in liposomi 3,6, o espressi da plasmidi DNA 4,7. Una volta che le specie di RNA raggiunge citosol, il percorso RNAi basa sul complesso RISC per elaborare dsRNA, agevolare il riconoscimento antisenso del bersaglio, e catalizzare la repressione traduzionale, degradazione dell&#39;mRNA, o la formazione di eterocromatina, in base all&#39;host. A causa di questi requisiti, classica RNAi può essere eseguita solo in organismi che occupano l&#39;RNA esogeno in modo efficiente ed esprimono RISC o un&#39;attività RISC-like. In particolare, questo esclude il modello batterio E. coli, che manca il percorso RNAi. Tuttavia, i recenti progressi nel campo della biologia sintetica forniscono gli strumenti per risolvere sia il problema di consegna e il problema silenziamento. In questo protocollo, costrutti Srna sono espressi in E. coli da un vettore DNA consegnato a LiVing cellule utilizzando il sistema fagemide / helper M13. Un fagemidi è un qualsiasi plasmide con un&#39;origine f1 fago-derivati ​​di replica. Un plasmide helper, in questo caso M13KO, porta tutti i macchinari necessari per produrre particelle virali, ma non si è competente per la replicazione e l&#39;imballaggio. Quando un fagemide e plasmide helper sono co-trasformati, il fagemide solo si replica all&#39;origine f1, confezionato e secreto. Il fagemidi vettorizzati è quindi competente per infettare dal vivo E. coli tramite il pilus F. In questo sistema, l&#39;effetto di silenziamento è prodotto da cassette Srna personalizzata combinando una sequenza ponteggio con una sequenza bersaglio vincolante. La sequenza bersaglio vincolante è di 24 paia di basi antisenso ad un target mRNA, in genere presso il sito ribosoma vincolante (RBS). La sequenza di impalcatura, sviluppato da Na e colleghi 8, contiene un motivo Hfq vincolante estratto da MICC, un piccolo RNA normativo endogena di E. coli. La proteina stimola Hfq RNA-RNA binding e la degradazione dell&#39;mRNA, che serve un ruolo in questo sistema simile a RISC in RNAi. La figura 1 illustra uno schema completo per abbattimenti Srna fago-mediata, compresa la struttura sRNA cassetta, vettorializzazione fagemidi, e il meccanismo di tacere. Come metodo per modulare l&#39;espressione genica in E. coli, sRNA silenziamento è semplice, rapida e versatile. Il E. mirato coli non è gravata di là di moltiplicazione del fagemide ed esprimendo la sRNA. Questo può essere rilevante nel contesto della biologia sintetica o di ricerca di base in cui l&#39;espressione di costrutti eterologhi più grandi può sforzare le risorse cellulari 9. Fagemidi nuovi bersagli possono essere prodotti con una singola PCR e raccolte un giorno dopo la trasformazione fagemide. Infine, quasi ogni mRNA può essere mirata. La regolazione cassette sRNA (su un plasmide standard) ha dimostrato di lavorare su una varietà di bersagli nel metabolismo con livelli tipici repressione&gt; 90% 8. 10. Innanzitutto, un fagemide confezionato viene introdotto ad una cultura lotto di E. coli e utilizzati per mettere a tacere l&#39;espressione della proteina fluorescente mKate2. cambiamenti di fluorescenza successivi sono monitorati in tempo reale. In secondo luogo, abbattendo il gene CAT è indicato per ridurre fenotipica resistenza al cloramfenicolo su piastre di agar. In entrambi i casi, il fagemide sé porta un marcatore GFP, permettendo tasso di infezione da misurare indipendentemente l&#39;efficienza knockdown.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F&#039; Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

atterramenti RNA-mediata sono ampiamente utilizzati per controllare l&#39;espressione genica. Questa famiglia versatile di tecniche fa uso di breve RNA (sRNA) che può essere sintetizzato con qualsiasi sequenza e progettato per integrare qualsiasi genica mirata per silenziamento. Poiché sRNA costrutti possono essere introdotte per molti tipi di cellule direttamente o utilizzando una varietà di vettori di espressione genica può essere repressa in cellule viventi senza modificazione genetica laborioso. L&#39;RNA più comune tecnologia atterramento, l&#39;interferenza dell&#39;RNA (RNAi), si avvale della endogena di riconoscimento sequenza di RNA-induced silencing complex (RISC) di mediare e scissione del mRNA bersaglio. Le applicazioni di questa tecnica sono quindi limitati a organismi RISC che esprimono, in primo luogo eucarioti. Recentemente, una nuova generazione di biotecnologi RNA hanno sviluppato meccanismi alternativi per il controllo dell&#39;espressione genica attraverso RNA, e così reso possibile atterramenti geni RNA-mediata nei batteri. Qui si descrive un metodo per mettere a tacere Expres genesione in E. coli che assomiglia funzionalmente RNAi. In questo sistema un fagemide sintetica è progettato per esprimere sRNA, che può ad indirizzare qualsiasi sequenza. Il costrutto di espressione viene consegnato ad una popolazione di E. coli con non-litico M13 fago, dopo di che è in grado di replicare stabilmente come un plasmide. Riconoscimento antisenso e silenziamento del mRNA bersaglio è mediata dalla proteina Hfq, endogena di E. coli. Questo protocollo include metodi per progettare la sRNA antisenso, la costruzione del vettore fagemide, il confezionamento del fagemide in Fago M13, la preparazione di una popolazione di cellule dal vivo per l&#39;infezione, e l&#39;esecuzione l&#39;infezione stessa. La proteina fluorescente mKate2 ed il cloramfenicolo acetiltransferasi gene di resistenza agli antibiotici (CAT) sono mirati a generare dati rappresentativi e di quantificare l&#39;efficacia atterramento.

Silenziamento del mKate2 fluorescenza in mezzi liquidi La figura 1 illustra lo schema per abbattimenti sRNA-mediate descritti in questo lavoro, tra cui la progettazione sRNA cassetta, vettorializzazione fagemidi, e il meccanismo di silenziamento. A seguito di protocollo 1.2, il tacere cassette sRNA di plasmide pAB.001 è stato modificato per indirizzare mKate. La cassetta è stata sRNA sintetizzato e clonato in fagemidi Litmus28i_J23115-B0032-GFP, un dono di Monica Ortiz e Drew Endy 11. Questo fagemidi porta marcatori di espressione GFP e resistenza alla kanamicina, permettendo infezioni di successo per essere monitorati. scorte fagemidi confezionati sono stati preparati seguendo il protocollo 2. Un derivato di E. coli K12 MG1655 portando una, marcatore mKate2 cromosomicamente integrato costitutivamente espresso è stato preparato per l&#39;infezione fagi per coniugazione<html> con un ceppo plasmide donatore F seguente protocollo 3. Le cellule sono state coltivate per fase registro medio e il fagemide introdotto seguente protocollo 4. Dopo l&#39;infezione fagemidi, 200 microlitri culture sono stati trasferiti in un lettore di piastre a fluorescenza e fluorescenza è stata monitorata continuamente per 24 ore. La figura 3 mostra l&#39;effetto di silenziamento sRNA mediata sull&#39;espressione mKate2. Il ceppo infettati con un fagemidi anti-mKate2 non ha mostrato alcun rilevabile fluorescenza mKate2 su sfondo. Al contrario, questo ceppo ha fatto esprimere il marcatore GFP, che indica l&#39;assorbimento di successo del fagemide. cellule di controllo non infettate prodotte mKate2 fluorescenza, ma non GFP. Un ulteriore controllo, in cui il dominio di targeting anti-mKate2 è stata sostituita con una sequenza di targeting CAT, non ha avuto effetto sulla mKate2 fluorescenza. Mettere a tacere di resistenza al cloramfenicolo su piastre di agar contenuti &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A seguito di protocollo 1.1, una cassetta tacere sRNA è stato prodotto per indirizzare CAT Un derivato di E. coli K12 MG1655 portando un costitutivamente espresso, marcatore CAT cromosomicamente integrato è stato preparato per. infezione fagi mediante coniugazione con un ceppo donatore F-plasmide seguente protocollo 3. le cellule sono state coltivate a fase log media e il fagemide introdotto seguente protocollo 4. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C, le cellule infette sono stati diluiti e piastrate alla intervallo di concentrazioni cloramfenicolo. piastre sono state incubate durante la notte, e la percentuale di cellule resistenti a ciascuna concentrazione cloramfenicolo è stato determinato contando unità formanti colonie (CFU) il giorno successivo. La Figura 4 mostra l&#39;effetto di silenziamento sRNA mediata sul fenotipo resistenza al cloramfenicolo. Le cellule non infette, o cellule infettate con fagemidi mira mKate2, erano resistenti alcloramfenicolo a tutte le concentrazioni testate. Al contrario, le cellule infettate con fagemidi mira CAT mostrato una ridotta sopravvivenza a basse concentrazioni di cloramfenicolo, e quasi il 99% uccidendo a concentrazioni più elevate. L&#39;aggiunta di ampicillina, per selezionare solo i batteri che trasportano il fagemide, ha ridotto la sopravvivenza cloramfenicolo a livelli non rilevabili. Ciò è coerente con il lavoro precedente che dimostra che la fuga dalle infezioni fago è un percorso comune per sfuggire a tacere 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figura 1: silenziamento genico in E. coli con sRNA espressione cassette Consegnato da M13 fagi La cassetta sRNA è composto da 4 moduli:. Il promotore pr (un promotore costitutivo derivato dal batteriofago lambda), un 24 bp mira a dominio, un dominio di legame Hfq estratto da MICC e un terminatore trascrizionale 8 </sup&gt;. La cassetta è integrato in una phagemid recante l&#39;origine di replicazione f1 M13 e confezionato in capside M13 con il M13KO7 helper fago. Fagimidi Packaged sono in grado di infettare E. coli che esprimono il pilus F, dove inizia espressione sRNA. Il sRNA poi recluta la proteina Hfq (rappresentato in rosso) e si lega un target mRNA antisenso nei pressi del sito di legame ribosoma, con conseguente repressione traslazionale e degradazione dell&#39;mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figura 2:. Progettazione Primer e mutagenesi sito-diretta del sRNA Sito di destinazione Due primer sono stati progettati con parziale omologia ad una cassetta sRNA esistente. Il primer forward contiene 20 bp omologa al promotore pR all&#39;estremità 5 &#39;, seguito da24 bp rappresenta la nuova sequenza GUIDE, quindi 18 bp omologa al dominio Hfq vincolante all&#39;estremità 3 &#39;. Il primer inverso è l&#39;esatto complemento inverso del primer in avanti, con le regioni di omologia alla cassetta sRNA esistente che fiancheggia il complemento inverso della nuova sequenza GUIDA. Sequenze di primer esatti sono riportati nella tabella 3. Singolo-primer reazioni PCR separate con l&#39;attaccante e il primer inverso producono lineare, il DNA a singolo filamento con la sequenza modificata desiderato. Ricottura del avanti e indietro prodotti di reazione, dopo clean-up come descritto nel protocollo, si traduce in DNA a doppia elica plasmide che porta la cassetta sRNA modificato desiderato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figura 3: Knockdown di un reporter cromosomicamente integrato mKate2 fluorescente. E. coli K12 MG1655 esprimere mKate2 erano o non trattata (linee rosse e bar), infettato da un fagemidi anti-mKate2 (linee verdi e bar), o infettato da un controllo phagemid mira CAT (linee blu e bar). (A) greggia E. coli cresciuto a densità di saturazione superiori, indicando un costo metabolico all&#39;infezione fago. Le linee tratteggiate indicano le deviazioni standard di 3 repliche. (B) Il segnale mKate2 stata ridotta a livelli di fondo vicino alla anti-mKate2 trattati ceppo, ma non in ceppi di controllo. Fluorescenza (C) GFP, portato anche dal fagemide, era rilevabile solo nei controlli fagemide trattati. (D, E) letture di fluorescenza finale dopo 24 ore di crescita sono stati normalizzati a OD. il segnale GFP, che indica l&#39;infezione fagemidi, era assente in controlli non trattati, ma anche sostanzialmente ridotto a seguito anti-CAT ptrattamento hagemid. Ciò può indicare effetti off-target del fagemide. Il segnale mKate2 è stato ridotto di un trattamento anti-fagemidi mKate2 rispetto ai controlli non trattati. Il fagemidi controllo CAT-mirato ha mostrato alcun effetto sulla mKate2 fluorescenza. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di 3 repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown di CAT ripristina la sensibilità cloramfenicolo ad una popolazione geneticamente resistenti E.. coli K12 MG1655 che esprime un gene CAT cromosomicamente integrato sono stati lasciati non trattati (barre rosse), trattati con un fagemide di controllo mira mKate2 (barre verdi), o trattato con un fagemide esprimere un anti-CAT Srna (barre blu). Dopo 1 ora di infezione, viabilità sulla formica indicatoibiotics è stata valutata mediante diluizioni seriali e placcatura. I ceppi trattati con anti-CAT fagemide erano significativamente uccisi (&gt; 90%) di cloramfenicolo a concentrazioni più elevate, mentre i trattamenti di controllo non sono stati influenzati. L&#39;aggiunta di ampicillina alle piastre di coltura seleziona positivamente per l&#39;infezione fagemide ed elimina le cellule non infette. In queste condizioni, non sono state osservate colonie resistenti cloramfenicolo dopo il trattamento anti-CAT. Ciò indica che la maggior parte dei sopravvissuti rappresentano un fallimento di infezione, piuttosto che un fallimento di silenziamento. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 3 repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> CAT sequenza bersaglio </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> Sequenza GUIDA CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Una sequenza esempio TARGET e guida per il CAT Gene Si noti la relazione complemento inverso. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pR promotore </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> sequenza GUIDA </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> Hfq dominio di legame </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / TE terminatore </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tabella 2:. Componenti sequenza del sRNA cassetta Ogni sequenza è scritto 5&#39;-3 &#39;. La cassetta completa è la concatenazione di questi 4 elementi in ordine e comprende 292 bp. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> forward Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDA] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> Primer Reverse </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Primer design nei Alter elementi di guida esistenti Il primer in avanti include l&#39;ultimo 20 bp del promotore pr, la nuova sequenza GUIDE, e il primo 18 bp del dominio Hfq vincolante.. La sequenza bersaglio è l&#39;esatto complemento inverso della sequenza GUIDE. Il primer inverso è l&#39;esatto complemento inverso del primer in avanti. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> plasmide template </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 micron Primer </td><td> 2,5 ml </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td> Ad alta fedeltà della polimerasi (2 U / ml) </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 5x PCR Buffer </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 4: consigliati Condizioni per il Single-Primer mutageni PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cicli </td><td> 98 ° C </td><td> 10 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td> estensione finale </td><td> 72 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Conservazione </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 5: consigliato termociclatore protocollo per il Single-Primer mutageni PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> DNA template </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 10 micron Forward Primer </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 10 micron Reverse Primer </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Taq 2X Master Mix </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> tardo priva di nucleasiR </td><td> 23 ml </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 6: Condizioni suggerita per la sequenza di verifica PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> denaturazione iniziale </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cicli </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> estensione finale </td><td> 68 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Conservazione </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 7: consigliato Termociclatore Proprotocollo per la sequenza di verifica PCR.

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l&#39;espressione genica in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.6K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Ricerca

Bioingegneria

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

CRISPR guida RNA clonazione per sistemi mammiferi

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Genetica

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Medicina

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by pathogenic and virulent bacteria of the genus Leptospira, either by direct contact with the bacteria or indirectly by exposure to contaminated water or soil. Domestic and wild animals act as reservoir hosts of infection, shedding leptospires from colonized renal tubules of the kidney, via urine, into the environment. The generation of mutant strains of Leptospira is critical to evaluate and understand pathogenic mechanisms of infection. CRISPR interference (CRISPRi) has proven to be a straightforward, affordable, and specific tool for gene silencing in pathogenic Leptospira. Therefore, the methodological details of obtaining the plasmid constructs containing both dCas9 and guide RNA, delivery of plasmids to Leptospira by conjugation with the E. coli strain &#946;2163, and transconjugant recovery and evaluation, will be described. In addition, the recently described Hornsby-Alt-Nally (HAN) media allows for the relatively rapid isolation and selection of mutant colonies on agar plates.

Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Here, the application of CRISPR interference (CRISPRi) for specific gene silencing in Leptospira species is described. Leptospira cells are transformed by conjugation with plasmids expressing dCas9 (catalytically "dead" Cas9) and a single-guide RNA (sgRNA), responsible for base pairing to the desired genomic target. Methods to validate gene silencing are presented.

Applicazione dell'interferenza CRISPR (CRISPRi) per il silenziamento genico nelle specie patogene di Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Biologia

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1 
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA
Transduction is a form of genetic exchange between bacteria that utilizes bacteriophages, or phages, a class of virus that infects exclusively prokaryotic organisms. This form of DNA transfer, from one bacterium to another by way of a phage, was discovered in 1951 by Norton Zinder and Joshua Ledererg, who termed the process &#34;transduction&#34; (1). Bacteriophages were first discovered in 1915 by British bacteriologist Frederick Twort, then independently discovered again in 1917 by French-Canadian microbiologist Felix d&#39;Herelle (2). Since then, the structure and function of these phages have been widely characterized (3), dividing these phages into two classes. The first of these classes are the lytic phages which upon infection multiply within the host bacterium, disrupting the bacterial metabolism, lysing the cell, and releasing progeny phage (4). As a result of this anti-bacterial activity and the increasing prevalence of antibiotic-resistant bacteria, these lytic phages have recently proved useful as a substitute treatment for antibiotics. The second of these classes are the lysogenic phages which can either multiply within the host via the lytic cycle or enter a quiescent state in which their genome is integrated into that of the host (Figure 1), a process known as lysogeny, with the ability for phage production to be induced in multiple later generations (4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig1.jpg" /> 
Figure 1: Infection of host cell by bacteriophage. Adsorption by the phage to the bacterial cell wall via interactions between the tail fibers and receptor (purple). Once on the cell surface, the phage is irreversibly attached to the bacterial cell using the base plate (black) which is moved to the cell wall by the contractile sheath (yellow). Phage genome (red) then enters the cell and integrates into the host cell genome.
While bacterial transduction is a naturally occurring process, using modern technology it has been manipulated for the transfer of genes into bacteria in the laboratory setting. By inserting genes of interest into the genome of a lysogenic phage, such as phage, one is able to transfer these genes into the genomes of bacteria and consequently express them within these cells. While other methods of gene transfer, such as transformation, use a plasmid for gene transfer and expression, the insertion of the phage genome into that of the recipient bacterium not only has the potential to confer new traits to this bacterium, but also allows for naturally occurring mutations and other factors of the cellular environment to alter the function of the transferred gene.
Compared to other methods of horizontal gene transfer, such as conjugation, transduction is fairly flexible in the criteria required for donor and recipient cells. Any genetic element that can fit inside the genome of the phage being used can be transferred from any strain of donor bacteria to any strain of recipient bacteria as long as both are permissive to the phage, requiring the expression of necessary phage receptors on the cell surfaces. Once this gene is moved out of the donor genome and packaged into the phage, it can be transferred to the recipient. Following transduction, it is necessary to select for recipient bacteria that contain the gene of interest have to be selected for. This could be done by use of a genetic marker, such as a FLAG-tag or polyhistidine-tag, to mark the gene of interest, or the intrinsic function of the gene, in the case of genes that encode for antibiotic resistance. Additionally, PCR could be used to further confirm successful transduction. By using primers for a region within the gene of interest and comparing signal to a positive control, bacteria that has the gene of interest, and a negative control, bacteria that underwent the same steps as the transduction reaction with no phage. While bacterial transduction is a useful tool in molecular biology, it has and continues to play an important role in the evolution of bacteria, particularly with regard to the recent rise of antibiotic resistance.
In this experiment, bacterial transduction was used to transfer the gene encoding for resistance to the antibiotic ampicillin from the W3110 strain of E.coli to the J53 strain via the P1 bacteriophage (5). This experiment consisted of two main steps. First, the preparation of P1 phage containing the ampicillin resistance gene from the donor strain. Second, the transfer of this gene to the recipient strain by transduction with the P1 phage (Figure 1). Once carried out, the successful transfer of the ampicillin resistance gene could be determined by qPCR (Figure 2). If transduction was successful, the J53 strain of E. coli would be resistant to ampicillin, and the gene conferring this resistance detectable by qPCR. If unsuccessful, there would be no detection of the ampicillin resistance gene and ampicillin would still function as an effective antibiotic against the J53 strain.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig2.jpg" /> 
Figure 2: The confirmation of successful transduction by qPCR. By comparing the Cq values detected for the gene of interest from the transduction reaction and the negative control reaction, and normalizing these values against a housekeeping gene, one was able to confirm that bacterial transduction was successful.

Phage Transduction: Transferring Ampicillin Resistance in E. coli

La trasduzione batterica tramite fagi: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina da una cellula donatore di E. coli ad una ricevente

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Didattica

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Biologia avanzata

Microbiologia

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

Placcatura dell'RNAi per l'alimentazione di C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione del dsRNA bersaglio in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l'espressione genica in

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