Questo metodo consente di creare facilmente plasmidi di espressione dell'RNA guida per esperimenti facilitati da CRISPR. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la clonazione può essere effettuata in un singolo passaggio e gli RNA guida accoppiati possono essere creati utilizzando plasmidi di espressione dell'RNA a guida singola. Per iniziare questo protocollo, diluire i primer lyophilizzati in tampone 1X TE a una concentrazione finale di 100 micromolari.
Aliquota una quantità uguale di primer avanti e indietro in tubi a strip cap PCR. Vortice da mescolare. Quindi, spin giù per la guida RNA oligonucleotide miscele a 100 volte G per 15 secondi.
Incubare la reazione a temperatura ambiente per cinque minuti prima di impostare la legatura. Aggiungere da uno a cinque microgrammi del vettore di espressione guida PSB700 selezionato a BSNB1 utilizzando 0,5 microlitri di BSNB1 per un microgrammo di vettore. Aggiungere acqua distillata fino a quando il volume totale è di 40 microlitri e condurre la digestione per un'ora a 55 gradi Celsius.
Eseguire i prodotti per la digestione su un gel di agarosio a bassa fusione dell'1,5%. Ritagliare la banda dorsale vettoriale digerita che corrisponde a un frammento di circa 9 kilobase di dimensioni. Trasferire questa fetta di gel su un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Utilizzando un kit commerciale di purificazione del gel, estrarre il DNA dal gel di agarosio secondo le istruzioni del produttore. Quindi diluire il DNA in 10-15 microlitri di tampone TE per ottenere un eluto concentrato. Quando sei pronto per eseguire la legatura aggiungi 15 microlitri di acqua distillata a una fiala.
Aggiungere 1 microlitro degli oligonucleotidi di RNA guida precedentemente ricotti, un microlitro del vettore di espressione guida PSB700 digerito BSNB1 e 2 microlitri di tampone di reazione ligasi del DNA 10XT4. Quindi mescolare questa soluzione vortice. Aggiungere di nuovo un microlitro di dna ligasi e vortice.
Far girare la soluzione a 100 volte G per 15 secondi. Incubare le reazioni a temperatura ambiente durante la notte assicurandosi di includere una reazione di controllo negativo senza inserto che abbia un vettore digerito BSNB1 da solo senza un inserto oligoto di RNA guida ricotto. Per iniziare, rimuovere E.coli dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e scongelarlo sul ghiaccio per 5-10 minuti.
Aggiungere 0,5 microlitri della miscela di reazione preparata a otto microlitri di E.coli competente. Mantenere la miscela sul ghiaccio per 30 minuti. Shock termico della miscela a 42 gradi Celsius per 45 secondi.
Quindi lasciare riposare la miscela sul ghiaccio per due minuti. Utilizzando uno shaker rotante, recuperare la coltura in 250 microlitri di supporti SOC utilizzando le condizioni qui elencate per NEB DH5a o NEB Stables. Successivamente, placcare 80 microlitri della coltura su un'appropriata piastra di brodo di licogenia di resistenza agli antibiotici.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius per NEB DH5a o a 30 gradi Celsius per le stalle NEB. Per iniziare, utilizzare lo speciale protocollo PCR Phusion GC per creare il frammento necessario come delineato nel protocollo di testo. Eseguire questo prodotto PCR su un gel di agarosio dell'1% e verificare che una banda sia vista a circa 490 coppie di basi.
Utilizzando un kit di estrazione del gel tagliare ed estrarre questo prodotto PCR. Quindi aliquota un mix master 1X preparato in tubi PCR. Utilizzo di una pipetta multicanale per aggiungere un microliter del prodotto PCR ad una concentrazione di 40 femtomoli per microlitro.
In un microlitro del vettore PSB700 aggiungere una concentrazione di 40 femtomoli per microlitro. Includere un controllo senza inserto utilizzando un microlitro di acqua al posto degli oligonucleotidi dell'RNA guida. Digerire il vettore e ligarare gli inserti in una reazione usando il protocollo Golden Gate delineato nel protocollo di testo.
Dopo la reazione iniziale del golden gate aggiungere altri 0,5 microlitri dell'enzima BSNB1 ad ogni reazione. Continuare la reazione a 55 gradi Celsius per un'ora. Quando la reazione del golden gate è completa, procedere al processo di trasformazione E.coli precedentemente descritto.
In questo studio, i vettori di espressione dell'RNA a guida singola vengono creati con successo utilizzando due metodi. Nel primo metodo, la dorsale vettoriale è pre-digerita e legata in una serie di oligonucleotidi corti. Il secondo metodo utilizzava la clonazione del Golden Gate per digerire e ligar simultaneamente in un'unica reazione.
L'RNA guida accoppiato che esprime vettori, ognuno guidato dal proprio promotore indipendente, viene creato con successo clonando un frammento PCR personalizzato. La clonazione riuscita per uno di questi metodi comporterà la comparsa di un numero significativamente maggiore di colonie per trasformazioni con il DNA inserito appropriato rispetto alla piastra di controllo senza inserto. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di non includere controlli di inserimento nel passaggio di clonazione.
Seguendo questa procedura, altri metodi come l'ingegneria dell'epigenoma possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande come quali effetti hanno le firme di cromatina sull'espressione genica.
