Mi chiamo Jarlath Nally, e faccio parte del team di ricerca qui al National Animal Disease Center di Ames, Iowa, e lavoriamo sulla leptospirosi. La leptospirosi è una malattia trascurata. È una malattia globale.
E in realtà, abbiamo una comprensione molto limitata di come questi gruppi unici di batteri causano infezioni. Quindi la presentazione di oggi riguarda la fornitura di una panoramica di un nuovo strumento disponibile per facilitare la valutazione dei meccanismi patogeni della leptospirosi silenziando specificamente geni specifici espressi da leptospira, utilizzando una tecnica chiamata interferenza CRISPR. Tuttavia, la capacità di selezionare le colonie di newton dipende molto dal fornire i migliori mezzi di crescita per questi fastidiosi leptospira.
Quindi, prima di tutto, vi presenteremo Rick Hornsby, che è stato brevemente introdotto un nuovo supporto per diffondere questi batteri fastidiosi. E poi vi presenteremo Louis Fernandez, che parlerà della metodologia di interferenza CRISPR per silenziare i geni bersaglio all'interno del leptospira. Ciao, sono Rick Hornsby.
Dalla loro identificazione da parte di Anada oltre 100 anni fa, i leptospira sono stati tipicamente isolati e propagati a 29 gradi Celsius, una temperatura che non riflette né l'ambiente né la temperatura corporea ospite dei mammiferi. 10 anni fa, l'USDA ERS ha iniziato a ricercare miglioramenti sui supporti a leptospira e da questa ricerca è stato sviluppato il supporto Hornsby-Alt-Nally. Utilizzando questi mezzi, medici e ricercatori sono stati in grado di isolare e propagare più rapidamente i leptospiras dai casi di campo e nella ricerca in vitro a temperatura e in un ambiente che emula più da vicino l'ospite di mammiferi.
Continuiamo a ottimizzare questi media, ma allo stato attuale, l'HAN ha dimostrato il potenziale per migliorare significativamente gli isolamenti clinici veterinari e umani nella ricerca in vitro e lo sviluppo di vaccini più efficaci per la prevenzione della leptospirosi. Ciao, sono Louis Fernandez. Finora, la patogenesi della leptospirosi è rimasta sotto-esplorata, principalmente a causa della mancanza di tubi genetici efficaci e facili da eseguire.
Qui descriveremo una nuova tecnica chiamata interferenza CRISPR o CRISPRi. E questa tecnica è molto semplice perché abbiamo solo bisogno di esprimere due componenti, una proteina legante il DNA chiamata Cas9 morto, o dCas9, e una molecola di RNA chimerico chiamata RNA a guida singola. E il complesso dCas9 e l'RNA guida renderanno l'accoppiamento di base al nostro gene bersaglio e quindi ridurranno o addirittura bloccheranno la trascrizione.
Anche usando i nuovi media HAN, potremmo ridurre drasticamente i tempi di formazione delle colonie per un recupero mutante. Il primo passo è definire il protospazio che sarà contenuto nell'RNA guida. Questa sequenza comprende 20 nucleotidi che definiranno l'accoppiamento di base con gli obiettivi genetici desiderati.
Invia una sequenza nucleotidica al server web CHOPCHOP, con parametri definiti per lo streptococco pyogenes, Cas9 e il motivo adiacente del protospazio, NGG. In base ai risultati, selezionare i protospaziatori con i punteggi migliori all'interno della tendenza meno. Il motivo NGG non sarà incluso nella sequenza finale.
Abbiamo usato il promotore lipL32 per esprimere l'RNA a guida singola, che conterrà i nucleotidi variabili 20 a cinque numeri primi su un'impalcatura dCas9 conservata. Dopo aver ottenuto la cassetta verrà relegata nel PMaOri. dCas9 plasmide nel sito di restrizione Xma1.
Per la coniugazione le cellule leptospira vengono coltivate a 29 o 37 gradi celsius nei media HAN. Un giorno prima di una coniugazione, le cellule equalizzate del donatore vengono coltivate in mezzi LB integrati con acido diaminopimelico, DAP e spectinomicina. Successivamente, nel giorno della coniugazione grigliare le colture Sature E.coli in LB più DAP.
All'interno di una cappa di biosicurezza, assemblato l'apparato di filtrazione posizionando il filtro a membrana sopra la base di vetro, seguito da imbuto in vetro da 15 ML. Entrambi i pezzi sono tenuti insieme da questo morsetto a molla. Quindi collegare il vetro a una pompa per vuoto, aggiungere cinque ML di colture di leptospira all'imbuto.
Aggiungere quindi il ceppo E.Coli beta 2163 contenente il plasmide di interesse. Il volume varierà a seconda della densità ottica della coltura. Puntiamo alla pipersione cellulare uno a uno.
Gira la pompa per vuoto, ora i liquidi che otteniamo attraverso la membrana e le cellule saranno concentrate su di essa. Prendi il filtro e posizionalo sulla piastra EMJH più DAP, lato bicurier verso l'alto. Incubare le piastre a 29 gradi celsius per 24 ore.
Quindi recuperare i filtri dalle piastre e posizionarli in un tubo conico da 50 ML. Utilizzare un ML di supporti HAN liquidi per recuperare le celle dal filtro pipettando. Visualizzare le celle recuperate mediante microscopia a campo scuro.
In questa fase si possono vedere numeri equivalenti di E.coli e leptospiras. Da 100 a 200 microlitri vengono utilizzati per diffondere i batteri su piastre HAN contenenti spectinomicina. In questa fase, DAP viene omesso e E.coli non crescerà.
Le piastre vengono incubate a 37 gradi celsius e 3%CO2. Le colonie dovrebbero essere evidenti tra gli otto e i 10 giorni. Le colonie di leptospira interrogans sono un po 'difficili da visualizzare.
Qui stiamo mostrando colonie ricoperte di vegetazione per rendere più facile vederle. Aggiungere 100 microlitri di HAN liquido, a tubi da 1,5 ML per recuperare i mutanti. Si consiglia di prendere almeno tre colonie da ogni piatto.
Utilizzando una punta di pipetta, le singole colonie verranno recuperate dalle piastre. Agger dovrebbe essere preso da solo. Le colonie devono essere prelevate da piastre di controllo contenenti MTP PMaOri.
dCas9 plasmide. E piastre con leptospira contenenti plasmide sia con dCas9 che con RNA guida progettato per il gene bersaglio. Le cellule recuperate possono ora essere visualizzate sotto microscopia a campo scuro per confermare la presenza di leptospira vitali.
Dopo la visualizzazione delle leptospiras di congedo, trasferire le cellule su mezzi HAN liquidi contenenti spectinomicina. Dopo la crescita delle impostazioni cultura, le celle possono ora essere recuperate per la conferma del silenziamento e la valutazione del fenotipo. Se gli anticorpi contro le proteine bersaglio sono disponibili immunoblot è una metodologia diretta per valutare il silenziamento.
Leptospira contenenti pMAOri. dCas9 da solo, o con la guida RNA Cas sono valutati da PCR, primer di fianco in legno. Il plasmide DMT si tradurrà in una banda di circa 300 coppie di basi e un solo tipo di circa 700 viene raggiunto quando è presente la cassetta dell'RNA guida.
Le immunoblot che utilizzano estratti di cellule intere vengono eseguite per la conferma del silenziamento, l'espressione proteica lipL32 viene abolita nelle cellule contenenti plasmidi espressi in dCas9 e l'RNA guida mira a questo gene. Ed entrambi collegano a e link B sono assenti nelle cellule contenenti l'RNA guida, è specifico per entrambi i geni. Il controllo lipL41 può essere visto in tutte le corsie.
Quindi abbiamo usato l'interferenza CRISPR sulle leptospira interrogans, l'abbiamo usata anche su diverse specie patogene aggiuntive di leptospira. L'abbiamo usato per silenziare geni specifici, oltre a silenziare l'espressione di piccoli RNA non codificanti. Il nostro interesse per la ricerca è nella comprensione dei meccanismi patogeni dell'infezione, quindi in genere cerchiamo di identificare i fattori di varianza, ma ovviamente puoi mettere a tacere il tuo gene preferito e in base alla tua area di ricerca.
E per esempio, potrebbe essere motilità o comprensione di come i leptospira persistono nell'ambiente, o metabolismo. In ogni caso, dovresti essere in grado di generare un mutante specifico che ti permetterà di eseguire genomica funzionale e comprendere il significato biologico del gene in questione. Quindi da tutti noi qui al National Animal Disease Center, vi auguriamo buona fortuna per la vostra ricerca.
