Questo metodo consente la visualizzazione del cervello di Zebrafish in fasi larvali successive per consentire l'osservazione dell'architettura neuronale in modo altamente dettagliato in vivo che in precedenza non era possibile. Le cellule pigmentate, che sono emerse durante il successivo sviluppo larvale e impediscono al cervello di avere immagini chiare, non sono un problema con questo metodo perché vengono semplicemente rimosse. Con il metodo, dovrebbe essere possibile studiare i processi che si verificano nelle fasi successive durante lo sviluppo larvale del cervello, i processi che influiscono sulla plasticità sinaptica, sulla degenerazione dei neuroni o sulla loro rigenerazione.
Prima di iniziare l'esperimento utilizzare un estrattore di micropipette per preparare aghi di vetro affilati e sottili da capillari di vetro. Quindi, utilizzare una pipetta pasteur di plastica per raccogliere la larva in una capsula di Petri di 90 millimetri di diametro contenente la soluzione appropriata. Trasferire la larva selezionata in una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro contenente ACSF e posizionare un coperchio di vetro quadrato da 24 per 24 millimetri nel coperchio della capsula di Petri.
Quindi aliquotare il volume di ACSF necessario per l'esperimento in una fiala appropriata per l'ossigenazione con carbogeno. Per incorporare la larva, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la larva anestetizzata in una camera di montaggio sotto uno stereomicroscopio. Se una larva è ancora in grado di muoversi, non usare il pesce per l'esperimento fino a quando il pesce non è completamente incapace di muoversi.
Quando la larva è immobile, rimuovere con cura il mezzo in eccesso e aggiungere immediatamente almeno un millilitro di acarosio a bassa fusione sulla larva. Orienta il pesce zebra con la regione dorsale rivolta verso l'alto il più vicino possibile alla superficie dell'agarose. Se la larva verrà emersa utilizzando un microscopio invertito, dopo una solidificazione, tagliare l'agarose contenente la larva in un piccolo blocco cuboide.
Per esporre il cervello per l'imaging, tagliare via l'agarose in eccesso sulla regione di interesse del cervello se necessario e utilizzare un ago di vetro per fare una piccola incisione attraverso la pelle vicino, ma non sopra, la regione di interesse senza penetrare troppo profondamente nel tessuto. Muovendo a malapena l'ago appena sotto la superficie della pelle, continua a fare tagli molto piccoli intorno alla regione di interesse fino a quando la pelle sopra la regione di interesse può essere rimossa o spinta da parte. Quando il tessuto è stato rimosso da tutti gli embrioni, aggiungere una piccola goccia di acarosio a bassa fusione alla camera di imaging precedentemente preparata di un microscopio invertito e utilizzare una piccola spatola per capovolgere il blocco di agarose cuboide di 180 gradi sulla goccia di agarose nella camera di imaging.
Quando l'agarose si è solidificato, riempire la camera di imaging con ACSF fresco e iniziare a immaginare la larva. Qui si può osservare una larva transgenica intatta di 14 giorni dopo la fecondazione con il cranio ancora intatto. Come mostrato, le cellule pigmentate all'interno della pelle sovrapposta sono distribuite su tutta la testa, interferendo con il segnale fluorescente nella regione di interesse.
Dopo l'intervento chirurgico al cranio aperto, l'area di interesse diventa liberamente accessibile per l'imaging dettagliato ad alta risoluzione. La barriera cutanea, cranica e/o emato-encefalica ostacolano anche la penetrazione di sostanze nel cervello, come illustrato dalla robusta colorazione del colorante nucleare osservata in queste cellule cerebrali solo dopo un intervento chirurgico al cranio aperto. Questi vantaggi si osservano anche a 30 giorni dopo la fecondazione.
Nei pesci transgenici contenenti una vascolarizzazione cerebrale fluorescente dovuta all'espressione della proteina fluorescente rossa, mCherry, nelle cellule endoteliali, la codifica a colori ai valori di profondità della pila di immagini dimostra che anche i vasi sanguigni profondamente sepolti all'interno del cervello a quasi 250 micron sono ancora chiaramente visibili e rintracciabili. Quando si esegue questa procedura, tenere sempre presente che si tratta di un intervento chirurgico in un animale vivente. Pertanto, richiede rispetto e una mente focalizzata.
Dopo questa procedura, la registrazione della morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche, gli eventi fisiologici e di trasporto intracellulare può essere eseguita in larve più vecchie di sette giorni dopo la fecondazione. Con questa tecnica, speriamo di fornire un approccio che consenta di studiare anche i processi cellulari nel cervello che si verificano in fasi larvali successive e che sono coinvolti nello stabilire, ad esempio, comportamenti complessi come il comportamento sociale o il processo decisionale.
