Il protocollo illustra come eseguire in vivo la microscopia a tre fotoni dei tessuti profondi nel cervello di topo e nel pesce zebra adulto. Due importanti sistemi modello nelle scienze della vita. La microscopia a tre fotoni a lunghezza d'onda lunga consente l'imaging in vivo ad alta risoluzione spaziale di tessuti o organi intatti a profondità inaccessibili dalla microscopia a due fotoni.
Questa tecnica può aiutarci a capire i meccanismi alla base delle malattie neurologiche, come l'Alzheimer e l'autismo, dove manca una comprensione completa di come la malattia colpisce il cervello. A dimostrare la procedura di imaging cerebrale del topo sarà Kibaek Choe, il ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio e a dimostrare la procedura di imaging cerebrale del pesce zebra sarà Kristine Kolkman, ricercatrice associata del Fetcho Research Laboratory. Per iniziare, accendere il laser e impostare la lunghezza d'onda centrale dell'uscita inattiva dell'amplificatore parametrico ottico non collinoso a 1, 300 o 1.700 nanometri, quindi posizionare i compressori a impulsi sul percorso della luce per pre-cinguettiare il laser a femtosecondi e ottimizzare la durata dell'impulso per l'imaging a tre fotoni.
Impostare l'angolo tra la piastra di silicio e il percorso laser all'angolo di Brewster per massimizzare la trasmissione laser, quindi ruotare la piastra di silicio per ottenere l'angolo di Brewster riducendo al minimo la riflessione. Quindi, posiziona gli specchi flipper per passare comodamente tra le linee del fascio da 1, 300 e 1. 700 nanometri. Posizionare una mezza piastra d'onda montata su uno stadio di rotazione e uno splitter a fascio polarizzatore per controllare l'intensità del laser, quindi posizionare un bloccave nel percorso di riflessione dello splitter del fascio.
Preparare una capsula di Petri con 0,5 centimetri di agar ad alto punto di fusione al 2%. Una volta che l'agar si è raffreddato e solidificato, tagliare un foro rettangolare nell'agar più lungo e leggermente più largo del pesce. Usando la cera, attaccare tubi sottili alla piastra di Petri con un'estremità nel rettangolo e un tubo di diametro maggiore sul bordo della capsula di Petri.
Successivamente, anestetizzare il pesce mettendolo in una soluzione di tricaina da 0,2 milligrammi per millilitro, quindi posizionare il pesce anestetizzato su un lato su una spugna bagnata, quindi utilizzare una microsiringa, iniettare retro-orbitalmente 3 microlitri di bromuro di pancuronio per paralizzare il pesce e posizionarlo brevemente nella soluzione di Hank per assicurarsi che sia completamente paralizzato. Quindi, posizionare il pesce dorsale nella capsula di Petri con la testa verso il tubo, quindi usando una pinza, aprire delicatamente la bocca del pesce e far scorrere il tubo in bocca. Far scorrere delicatamente il pesce verso il tubo in modo che il tubo sia nella parte posteriore della bocca del pesce.
Rapidamente, ma delicatamente, asciugare l'agar intorno al pesce e rimuovere l'acqua sopra il pesce. Immergere un piccolo pezzo di tessuto di laboratorio nella colla da laboratorio e mettere il tessuto sull'agar su entrambi i lati del pesce e sopra la schiena del pesce caudale alle branchie. Successivamente, anestetizzare la pelle del pesce posizionando una piccola goccia di bupivacaina direttamente sulla superficie della testa, quindi portare la capsula di Petri con il pesce al microscopio.
Riempire il piatto con acqua di impianto per pesci e collegare il tubo a una pompa dell'acqua per pompare l'acqua del sistema nella bocca del pesce. Assicurarsi che l'acqua sia ossigenata con un gorgogliatore e riscaldata a 30 gradi Celsius con un riscaldatore per acquari. Per l'imaging, posizionare un obiettivo a basso ingrandimento sul microscopio a tre fotoni, quindi posizionare la capsula di Petri contenente il pesce e i tubi sotto il microscopio e utilizzare una sorgente luminosa a LED per illuminare la capsula di Petri.
Dal software di acquisizione delle immagini, apri la modalità Fotocamera, fai clic su Live, scegli il canale A sul lato destro dello schermo e regola le impostazioni dell'istogramma per vedere chiaramente l'immagine. Dopo aver impostato l'impostazione del motore sul controller del motore alla base, abbassare l'obiettivo fino a quando il pesce non è visibile. Posiziona il centro della testa del pesce al centro del campo visivo, quindi sposta l'obiettivo verso l'alto e lontano dalla testa del pesce.
Sostituire l'obiettivo a basso ingrandimento con l'obiettivo ad alta apertura numerica per l'imaging a tre fotoni, quindi avvicinarlo alla testa del pesce. Impostate i valori degli assi di tutti i motori su zero. Abbassare lentamente la lente dell'obiettivo, assicurandosi che l'obiettivo non contatti fisicamente la testa.
Nel software della telecamera CCD, interrompere lo spostamento dell'obiettivo quando la parte superiore della testa è visibile e impostare le posizioni X, Y e Z su zero. Spegnere la sorgente luminosa a LED e chiudere la tenda scura attorno al sistema, quindi impostare il software di acquisizione dell'imaging sulla modalità GG multifotone per l'imaging a tre fotoni e impostare la potenza sotto l'obiettivo su meno di un milliwatt. Fare clic sul pulsante Live nel software di acquisizione delle immagini.
Apri i canali PMT e regola il guadagno PMT e il livello di sfondo in base alle esigenze. Spostare lentamente verso l'alto la lente dell'obiettivo per individuare la superficie della testa monitorando il canale THG dai grandi vasi sanguigni e dalla superficie del vetro della finestra. Dopo aver spostato la lente dell'obiettivo vicino alla finestra, applicare acqua tra l'obiettivo e la finestra cranica, quindi impostare i valori degli assi di tutti i motori su zero.
Fare clic sul pulsante Live nel software di acquisizione delle immagini. Aprire i canali PMT e regolare il guadagno PMT e il livello di fondo secondo necessità, quindi spostare lentamente verso l'alto l'obiettivo per individuare la superficie dello slittamento del coperchio monitorando il canale THG dai grandi vasi sanguigni e dalla superficie del vetro della finestra. Regola l'orientamento della finestra se necessario, quindi azzera i motori per definire la superficie del cervello.
Eseguire l'imaging e regolare il livello di potenza in base alla profondità di imaging. L'imaging ad alta risoluzione, non invasivo e profondo di neuroni geneticamente marcati nel cervello del pesce zebra adulto è ottenuto utilizzando la microscopia a tre fotoni. Si può anche osservare la distribuzione degli strati cellulari nel tectum ottico e nel cervelletto.
La funzione della fotocamera del microscopio è stata utilizzata per localizzare il pesce. Il cranio è visto nel canale THG, che aiuta a navigare nel cervello e trovare la superficie superiore. I neuroni sono distinguibili con un alto rapporto segnale-sfondo in profondità nel cervello adulto.
Qui vengono mostrate immagini multicolore a tre fotoni di neuroni marcati con GCaMP6s e vasi sanguigni marcati in rosso del Texas insieme ai segnali THG nel cervello del topo adulto. Con l'ottimizzazione della configurazione, le immagini ad alto contrasto sono state ottenute con successo fino a 1,2 millimetri dalla superficie del cervello nella regione dell'ippocampo CA1. Le tracce di attività calcistica dei neuroni marcati con GCaMP6s a una profondità di 750 micrometri per una sessione di registrazione di 10 minuti hanno mostrato un'alta fedeltà di registrazione.
Questa configurazione può aiutare a visualizzare l'attività neuronale per comprendere la funzione cerebrale. Può anche essere usato per tracciare il movimento cellulare all'interno del tessuto biologico per comprendere vari sistemi biologici. Inoltre, la velocità del flusso sanguigno può anche essere misurata per monitorare la salute dell'animale.
