We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.

1. Pulizia e sterilizzazione della Microchannel SALVI <ol><li> Sterilizzazione della Microchannel in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di soluzione acquosa al 70% di etanolo in una siringa, collegare la siringa con l&#39;estremità di entrata della SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa al termine dell&#39;iniezione. Quindi, collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando un polietereterchetone (PEEK) unione. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa per condurre la stessa procedura. Ad esempio, impostare la velocità di flusso a 100 microlitri / min. </li><li> Mantenere la microcanali SALVI riempito con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 4 ore. </li></ol></li><li> Introdurre deionizzata (DI) Acqua in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa, collegare la siringa con l&#39;ingresso di SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando un&#39;unione PEEK. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa, come indicato inpasso 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. immobilizzazione del Film di proteine ​​in SALVI <ol><li> Immobilizzare il Film di proteine ​​in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di fibronectina (10 ug / ml in tampone fosfato, PBS) soluzione in una siringa, collegare la siringa con l&#39;ingresso di SALVI, lentamente iniettare 1 ml del liquido in 10 min, rimuovere la siringa, e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando una unione PEEK. </li><li> Incubare la SALVI riempito con la soluzione fibronectina in un piatto di coltura pulito, mantiene il piatto nella cappa a temperatura ambiente per 12 ore. </li><li> Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa e collegare la siringa con l&#39;ingresso di Salvi. Iniettare lentamente 1 ml di acqua in 10 minuti, rimuovere la siringa, e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di Salvi. Nota: Se dotato di un microscopio ottico, controllare il SALVI sotto il microscopio per assicurare che la membrana peccato è intatto prima analisi ToF-SIMS. Ora il dispositivo è pronto per SALVI TOF-SIMS unANALISI. </li></ol></li></ol> 3. Installare SALVI nella Loadlock Camera TOF-SIMS Nota: I guanti devono essere indossati in ogni momento durante la manipolazione del dispositivo Salvi e installarla sul palco TOF-SIMS per evitare potenziali contaminazioni durante l&#39;analisi di superficie. <ol><li> Montare SALVI allo stage <ol><li> Posare la fase TOF-SIMS su una superficie piana e pulita. Mettere il dispositivo SALVI sul palco con il wafer di silicio e la membrana SiN rivolto verso l&#39;alto. Fissare il SALVI con quattro pezzi di fissaggio in metallo e avvitare i pezzi di metallo che tengono l&#39;angolo del dispositivo nella piastra metallica con quattro viti. </li><li> Delicatamente arrotolare il tubo PTFE collegato al canale microfluidica. Utilizzare quattro pezzi di metallo e quattro viti per tenere la parte rigida verso il basso. Assicurarsi che il dispositivo è posizionato nello spazio aperto sulla scena SIMS modo che non interferisca con il fascio di ioni primario durante l&#39;analisi. Ulteriori immagini e illustrazione del fabricat SALVIione e l&#39;installazione sono disponibili in pubblicazioni precedenti. 8,9,11 </li></ol></li><li> Montare la Coppa Faraday allo stage <ol><li> Fissare la coppa di Faraday sul palco da una vite. </li></ol></li><li> Caricare lo stage nelle TOF-SIMS Loadlock Camera <ol><li> Aprire il loadlock ToF-SIMS, tenere e impostare la fase orizzontale sulla piattaforma di carico, e chiudere la porta loadlock. </li></ol></li></ol> 4. ToF-SIMS acquisizione dati <ol><li> Accendere la pompa di aspirazione e garantire vuoto adatto (per esempio, dell&#39;ordine di 10 -6 mbar o Torr) viene raggiunto nella camera loadlock. </li><li> Spostare il SALVI nella camera principale una volta il vuoto è stabilizzata dopo circa 30 min. Nota: Il vuoto deve essere inferiore a 5 x 10 -6 mbar di vuoto nella camera principale durante l&#39;acquisizione dei dati. Altrimenti, alto vuoto è indicativo di una perdita nel sistema SALVI. </li><li> Regolare il fascio di ioni primario e analizzatore di ToF-SIMS con unrisoluzione spaziale di circa 400 nm secondo le raccomandazioni del produttore. La corrente del fascio primario è di 1.200 pA, mentre il tempo di ciclo è di 30 msec sotto la modalità DC. Nota: Questo processo segue in gran parte le raccomandazioni del produttore. </li><li> Trovare il canale microfluidica utilizzando il microscopio ottico. Utilizzare il centro ottico di immagine come riferimento e allinearlo a essere coerente con il centro dell&#39;immagine di ioni secondari. </li><li> Prima di ogni misurazione, utilizzare un 1 KeV O 2 + fascio (~ 40 nA) per eseguire la scansione sulla finestra SiN con una superficie di 500 x 500 micron 2 per ~ 15 secondi per eliminare la contaminazione superficiale. Inoltre, utilizzare un cannone inondazione elettronico per compensare la carica superficie durante tutte le misure. Utilizzare la funzione automatica della pistola inondazioni nella modalità predefinita per questo passo. </li><li> Selezionare la modalità positiva o negativa prima dell&#39;acquisizione dei dati. Utilizzare la keV Bi 3 + trave 25 come il fascio di ioni primario in tutte le misure. Nota: La procedura è simile fo acquisizioni di dati positivi e negativi. Per motivi di spazio, la modalità positiva è descritto in dettaglio qui. <ol><li> profondità Profiling <ol><li> Eseguire la scansione del fascio + Bi 3 su un&#39;area circolare con un diametro di ~ 2 micron con 32 pixel di risoluzione di 32 pixel. </li><li> Per ridurre al minimo il tempo necessario per punch-through la membrana SiN, utilizzare una larghezza di impulso lunga (cioè, 180 nsec, la corrente del fascio ~ 1,0 pA in un tempo di ciclo di 100 msec) Bi 3 + fascio. Le intensità di ioni secondari rappresentante l&#39;aumento superficie del liquido quando viene raggiunto punch-through. Il tempo di punch-through varia da 300 sec a 500 sec, a seconda del lotto di membrana SiN. Nota: Questa differenza sembra essere correlato al lotto di membrane SiN acquisite secondo la nostra esperienza. Tuttavia, il tempo di punch-through non influisce realmente l&#39;analisi dei dati. </li><li> Dopo la membrana SiN punch-through, mantenere la stessa corrente per circa 200 secondi perottenere dati sufficienti per 2D ricostruzioni di immagini. </li><li> Ridurre la larghezza di impulso di 80 nanosecondi per la raccolta dei dati per acquisire gli spettri con una migliore risoluzione di massa. Continuare questa acquisizione per circa altri 200 sec. I dati dello spettro mostrati nella Figura 1 sono ottenuti da questa regione. </li></ol></li><li> 2D Imaging e Mass Spectra <ol><li> Raccogliere il immagini 2D e dati di spettri di massa, allo stesso tempo quando si misurano i dati di profili di profondità. Lo strumento TOF-SIMS salva tutte le informazioni di ogni spot durante l&#39;esperimento. I dati sono mostrati in diverse finestre (Fpanel - Spectra, Fpanel - Profili e Fpanel - separatamente le immagini) del software di controllo digitale. Controllare i dati in ogni pannello giudiziosamente durante l&#39;acquisizione dei dati. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 5. TOF-SIMS dati Nota: L&#39;analisi dei dati è inizialmente effettuata utilizzando il software strumentale IonToF TOF-SIMS. <ol><li> Aprire l&#39;unasoftware ANALISI DELLA SIMS (Measurement Explorer) e quindi fare clic su &quot;profili &#39;,&#39; pulsanti &#39;immagine spettri&#39; e &#39;, rispettivamente per elaborare profilo di profondità, m / z spettro, e dati di immagine. </li><li> Aprire i file di dati che hanno l&#39;estensione &quot;.ita&quot;. </li><li> Selezionare i picchi di interesse, digitare il nome della specie nella casella &quot;ioni&quot;, e li etichetta con colori diversi in spettri. Utilizzare la rotellina del mouse per trascinare lungo l&#39;asse x. Utilizzare Ctrl e rotella di scorrimento per regolare altezze dei picchi e larghezze. Lettera switch &quot;L&quot; tra le modalità lineari e log lungo l&#39;asse y. </li><li> Condurre ricostruzione dei dati prima della calibrazione di massa. Altrimenti, è difficile scegliere la spaziatura tra i picchi in fase di calibrazione di massa. <ol><li> Selezionare i dati di profondità profiling di interesse e ricostruire gli spettri in base alla profondità serie temporali profilo. </li><li> Fare clic sul pulsante di ricostruzione. Nella finestra &quot;Start ricostruzione&quot;, digitare un intervallo di scansione di interest. Fai clic su &quot;OK&quot; per ricostruire i dati del profilo di profondità. </li></ol></li><li> Eseguire una calibrazione di massa. Premere il tasto &quot;F3&quot; per aprire la finestra &quot;calibrazione di massa&quot;. Scegli i picchi per la calibrazione in base al campione specifico. 21 In questo lavoro, utilizzare i seguenti picchi CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) e H 13 O 6 + (m / z 109) per il modo positivo. Utilizzare il seguente picchi CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), e C 4 H - (m / z 49) per il modo negativo. <ol><li> Selezionare un picco,fare in modo che la freccia verso il basso è puntato verso il picco nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra. Fare clic su tale picco e digitare il nome di picco nella finestra &quot;calibrazione di massa&quot;, fai clic su &quot;Aggiungi&quot;, e lo ione di interesse è compreso nella calibrazione di massa. </li><li> Infine, fare clic sul pulsante &quot;Recalibrate&quot;. Controllare se le aree dei picchi sono al posto giusto in base alla loro massa per caricare rapporti. Nel menu &quot;Spectrum&quot;, selezionare e fare clic su &quot;Applica calibrazione di massa&quot; a &quot;tutti gli spettri&quot; o &quot;spettri Selected&quot;, in base all&#39;analisi specifica condotta. </li></ol></li><li> Come selezione di picco è necessario per l&#39;analisi del campione, determinare picchi caratteristici del campione secondo la letteratura o di altri risultati precedenti. Confrontare l&#39;intensità dei picchi di interesse della m / z spettri. Se necessario, aggiungere nuovi picchi o cancellare i picchi inutili nella lista di picco. <ol><li> Aggiungi picchi. Fare clic su un picco, trovare le linee rosse nella casella in basso a sinistra. Hold il tasto &quot;Ctrl&quot;, scorrere il mouse in senso orizzontale per definire ampiezza del picco, che aggiunge un picco alla lista di picco automaticamente. Un altro modo per aggiungere un picco è quello di selezionare un picco nella finestra principale di spettro, e quindi fare clic sul pulsante &quot;aggiungi picco&quot; sopra la finestra. Se ci sono molti picchi da aggiungere, nel menu &quot;Spectrum&quot;, selezionare &quot;picchi di ricerca&quot;, verificare le specifiche connessi nella finestra appena aperta, quindi aggiungere i picchi in base alle esigenze. </li><li> Per esportare un elenco di picco, nel menu &quot;Peak List&quot;, selezionare &quot;Salva ...&quot;, la lista di picco nel formato &quot;itmil&quot;. Utilizzare i tasti Ctrl e tasto sinistro per trascinare lungo lo spettro. Nella finestra di spettri, selezionare un picco di interesse e trascinare le due linee tratteggiate a posizioni desiderabili. </li><li> Per importare un elenco di picco, nel menu &quot;Messa intervallo List&quot;, scegliere &quot;Importa ...&quot;, individuare un file di elenco di picco esistente con l&#39;estensione &quot;.ITPL&quot;. Fai clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Per utilizzare un &quot;itmil&quot; lista di picco, inil menu &quot;Messa Lista Intervallo&quot;, fare clic su &quot;Apri ...&quot;, trovare il file, quindi fare clic su &quot;Apri&quot;. </li></ol></li><li> Applicare un elenco di picco per analizzare ulteriormente i dati. Al-basso a sinistra della finestra &quot;Spectra&quot;, c&#39;è una finestra chiamata &quot;Mass Elenco Interval&quot;. L&#39;elenco di picco importato viene mostrato qui. <ol><li> Fare clic destro sul file di elenco di picco da utilizzare, applicare alla &quot;spettro attivo&quot; o &quot;tutti gli spettri&quot;. </li></ol></li><li> Visualizzare i profili di dati. Nella finestra &quot;Profilo&quot;, Usa lettera &quot;M&quot; per adattarsi alla finestra (gamma completa) e la lettera &quot;N&quot; per adattarsi al asse y. Utilizzare Ctrl e rotellina di scorrimento per regolare la larghezza del profilo. Oppure utilizzare &quot;/&quot; e &quot;*&quot; sulla tastiera per modificare l&#39;intervallo dell&#39;asse Y e l&#39;altezza. </li><li> Esportare i dati per un ulteriore tracciato utilizzando altri software di grafica dopo la prima analisi. <ol><li> Per esportare un profilo di profondità, nella finestra &quot;profilo&quot;, fare clic sul menu &quot;File&quot;, quindi selezionare &quot;Export &amp; #34 ;, quindi selezionare &quot;Salva con nome&quot; file &quot;.txt&quot;. </li><li> Per esportare un file spettro m / z, nella finestra &quot;Spectra&quot;, fare clic sul menu &quot;File&quot;, quindi selezionare &quot;Export&quot;, quindi selezionare &quot;Salva con nome&quot; file &quot;.txt&quot;. </li><li> Per esportare un file di immagine, nella finestra, stampa schermo &quot;Immagine&quot; e salvare come file immagine. </li></ol></li></ol> 6. ToF-SIMS dati tracciato e presentazione Nota: utilizzare uno strumento grafico per tracciare i dati dopo i dati SIMS vengono elaborati utilizzando il software strumentale. <ol><li> Utilizzare uno strumento grafico per importare i dati. </li><li> Fare una trama con il m / z come l&#39;asse delle ascisse e l&#39;intensità di picco come l&#39;asse y per mostrare lo spettro ricostruito. Un esempio è riportato nella figura 1. </li><li> Fare un grafico usando il tempo di polverizzazione come l&#39;asse delle ascisse e l&#39;intensità di picco come l&#39;asse y per visualizzare il profilo di profondità serie temporali ricostruito. Un esempio è dato in FiguRE 2. </li><li> Combina immagini 2D ricostruite di diversa m / z e formare una matrice per mostrare la mappatura di ioni. Un esempio è riportato nella figura 2. </li></ol>

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A. 31 (5), 050819 (2013).</li><li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins:+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns.">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li><li>Br&#252;ning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA.">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li><li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li><li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly(hydroxylethyl+methacrylate)+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SALVI è un&#39;interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l&#39;utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging mu...

L&#39;idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine ​​senza molecole d&#39;acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d&#39;acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine ​​rendono tali interazioni distinte. 4 L&#39;interazione delle proteine ​​con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti conformazionali possono verificarsi come proteina incontra una superficie. ToF-SIMS è stato concepito come la tecnica che ha il potenziale per studiare all&#39;interfaccia proteina-solido. 5-7 È importante comprendere l&#39;idratazione di proteine ​​su superfici solide, che fornisce potenzialmente una comprensione fondamentale del meccanismo della loro struttura, conformazione e biological&#39;attività al. Tuttavia, le tecniche analitiche superficie maggiore sono per lo più sotto vuoto-based e applicazioni dirette per Studi liquidi volatili sono difficili a causa della rapida evaporazione del liquido volatile in ambiente sottovuoto. Abbiamo sviluppato un vuoto un&#39;interfaccia microfluidica compatibile, sistema per l&#39;analisi presso l&#39;interfaccia Vacuum Liquid (SALVI), per consentire osservazioni dirette di superfici liquide e interazioni liquido-solido che utilizzano tempo di volo di ioni secondari spettrometria di massa (TOF-SIMS). 8- 11 Gli aspetti unici sono i seguenti: 1) la finestra di rilevamento è un&#39;apertura di 2-3 micron di diametro che permette l&#39;imaging diretto della superficie del liquido, 2) tensione superficiale è utilizzato per contenere il liquido all&#39;interno del diaframma, e 3) Salvi è portatile tra più piattaforme analitiche. 11,12 Salvi è composto da una membrana di nitruro di silicio (SiN) come area di rilevamento e un microcanale in polidimetilsilossano (PDMS). E &#39;fabricated nella stanza pulita, ei fattori di fabbricazione e di progettazione chiave sono stati dettagliatamente nei precedenti documenti e brevetti. 8-12 Le applicazioni di ToF-SIMS come strumento analitico sono state dimostrate utilizzando una varietà di soluzioni acquose e le miscele di liquidi complessi, alcuni dei che conteneva le nanoparticelle. 13-17 in particolare, SALVI liquido TOF-SIMS consente dinamica sondare l&#39;interfaccia liquido-solido dei sistemi live biologici (ad esempio, biofilm), celle singole, e l&#39;interfaccia solido-elettrolitico, aprendo nuove opportunità per in situ condensato fase studi, tra cui liquidi con l&#39;ausilio TOF-SIMS. Tuttavia, il design attuale non consente ancora interazioni gas-liquido. Questa è una direzione per lo sviluppo futuro. SALVI è stato utilizzato per studiare il film proteina idrata in questo lavoro per la prima volta. Fibronectina è un dimero proteine ​​comunemente usato, costituito da due monomeri quasi identici collegati da una coppia di ponti disolfuro, 18 che is ben noto per la sua capacità di legare le cellule. 19,20 E &#39;stato scelto come sistema modello per illustrare che il film proteina idratata potrebbe essere sondato in modo dinamico con il liquido SALVI ToF-SIMS approccio. La soluzione proteica è stata introdotta nel microcanali. Dopo incubazione per 12 ore, un film proteina idratata formata sul lato posteriore della membrana SiN. Deionizzata (DI) l&#39;acqua è stata utilizzata per risciacquare il canale dopo l&#39;introduzione di proteine. Le informazioni sono state raccolte da idrati molecole di proteine ​​fibronectina nel microcanali SALVI usando dinamica TOF-SIMS. DI acqua è stato studiato anche come controllo da confrontare con i risultati ottenuti da idratato film sottile fibronectina. sono state osservate differenze distinte tra il film proteina idratata e acqua deionizzata. Questo lavoro dimostra che l&#39;assorbimento di proteine ​​sulla superficie in ambiente liquido può essere studiato con il romanzo Salvi e liquido approccio ToF-SIMS. Il protocollo video è destinato a fornire una guida tecnica per le persone che sono interessatead utilizzare questo nuovo strumento di analisi per le diverse applicazioni di SALVI con ToF-SIMS e ridurre gli errori inutili in gestione dei liquidi, nonché l&#39;acquisizione di dati ToF-SIMS e l&#39;analisi.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>Resolution: &gt;10,000 m/&amp;Delta;m for mass resolution; &gt;4,000 m/&amp;Delta;m for high spatial resolution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>for connecting the inlet and outlet of SALVI</td></tr><tr><td>5 Axes Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Range: 100 to 1,000 ml</td></tr><tr><td>Pipette Tip</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% Denatured</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims

Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine ​​nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l&#39;analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine ​​fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l&#39;area di rilevamento SALVI. Durante l&#39;analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell&#39;ambiente liquido per la prima volta.

Un paio di risultati rappresentativi sono presentati per dimostrare i vantaggi del protocollo proposto. Utilizzando l&#39;interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primario (Bi 3 +) può bombardare direttamente sul film fibronectina idratato in acqua deionizzata. Così la mappatura chimica molecolare della superficie del liquido può essere acquisito correttamente. Figura 1a <str...

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In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

8.2K Views.  Pacific Northwest National Laboratory.  Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa. 

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Chimica

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using conventional synthesis techniques. Coupling soft landing with in situ characterization using secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS) enables analysis of well-defined surfaces under clean vacuum conditions. The capabilities of three soft-landing instruments constructed in our laboratory are illustrated for the representative system of surface-bound organometallics prepared by soft landing of mass-selected ruthenium tris(bipyridine) dications, [Ru(bpy)3]2+ (bpy = bipyridine), onto carboxylic acid terminated self-assembled monolayer surfaces on gold (COOH-SAMs). In situ time-of-flight (TOF)-SIMS provides insight into the reactivity of the soft-landed ions. In addition, the kinetics of charge reduction, neutralization and desorption occurring on the COOH-SAM both during and after ion soft landing are studied using in situ Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-SIMS measurements. In situ IRRAS experiments provide insight into how the structure of organic ligands surrounding metal centers is perturbed through immobilization of organometallic ions on COOH-SAM surfaces by soft landing. Collectively, the three instruments provide complementary information about the chemical composition, reactivity and structure of well-defined species supported on surfaces.

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of novel materials. Coupled with analysis by in situ secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), soft landing provides unprecedented insights into the interactions of well-defined species with surfaces.

In Situ SIMS e IR Spettroscopia di superfici ben definite Preparato da atterraggio morbido di ioni Mass-selezionati

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine ​​clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Valutazione del Boro Doped Diamante elettrodi Qualità e applicazioni per<em&gt; In Situ</em&gt; Modifica del pH locale da acqua Elettrolisi

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Biochimica

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine in acqua da Salvi e TOF-SIMS

Riepilogo

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Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

In Situ SIMS e IR Spettroscopia di superfici ben definite Preparato da atterraggio morbido di ioni Mass-selezionati

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Valutazione del Boro Doped Diamante elettrodi Qualità e applicazioni per

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Preparazione fisiologico delle cellule ciliate dalla sacculus del toro americana (

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

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