Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di distinguere proteine di attività simili che hanno ruoli diversi, a seconda della localizzazione in busto, stroma o membrane tilacoidi. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo faranno fatica, perché useranno piante troppo vecchie, mescoleranno la foglia per troppo tempo o non faranno abbastanza attenzione quando si sospendono i pellet di cloroplasto intatto, ma fragile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è difficile imparare il caricamento o il recupero della frazione dal percollo o nei passaggi gradiente di saccarosio.
A causa del rischio di miscelazione dei gradienti e quindi di contaminazione incrociata delle varie sotto frazioni di cloroplasto. A dimostrare la procedura saranno Imen Bouchnak, un dottorando del nostro laboratorio e Lucas Moyet, un ingegnere indoor. Per iniziare, coltiva piante di arabidopsis per cinque settimane con un ciclo di luce di 12 ore a 23 gradi Celsius nel giorno e 18 gradi Celsius nella notte, con un'intensità luminosa di 150 micromorchi per metro quadrato al secondo.
Il giorno dopo, pre-pesare un becher da cinque litri e poi posizionare sul ghiaccio. Raccogliere le foglie di arabidopsis, assicurandosi di evitare di raccogliere qualsiasi terreno. Pesare di nuovo il becher e registrare il peso del tessuto.
Trasferire le foglie raccolte in una stanza fredda. Posizionare le foglie in un frullatore contenente due litri di tampone di rettifica e omogeneizzarle miscelandole ad alta velocità tre volte per una durata di due secondi ogni volta. Posizionare quattro strati di mussola e uno strato di tex blu nylon in un colino e questo per filtrare l'omogeneato.
Spremere delicatamente le foglie miscelate all'interno della mussola e del tex blu per estrarre tutto il liquido. Recuperare il tessuto rimanente nella tazza del frullatore e ripetere il processo di omogeneizzazione utilizzando un tampone di macinazione fresco. Utilizzare da quattro a cinque strati di nuova mussola per filtrare questo nuovo omogeneato in un nuovo becher come descritto in precedenza.
Distribuire equamente l'estratto di cella grezza in sei bottiglie da 500 millilitri. Metti le bottiglie sul ghiaccio. Centrifuga le bottiglie refrigerate a 2070 G e quattro gradi Celsius per due minuti.
Dopo questo, scartare delicatamente il supernatante. Utilizzare una pompa dell'acqua per aspirare qualsiasi supernatante rimanente e mantenere i pellet, che contengono cloroplasto grezzo concentrato, sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, aggiungere tre millilitri di mezzo di lavaggio ad ogni bottiglia, assicurandosi di non utilizzare punte di pipetta fine per evitare di rompere i cloroplasti.
Quindi, utilizzare un pennello o una spatola di plastica curva per sospendere delicatamente i pellet. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere i cloroplasti ri-sospesi in un unico tubo. Invertire delicatamente il tubo per ottenere una sospensione omogenea del cloroplasto.
Per iniziare, utilizzare una pipetta da 10 millileter per caricare lentamente sei millilitri della sospensione cloroplasta sopra ciascuno dei sei gradienti percoll preparati. Utilizzando un rotore a benna oscillante, centrifugare le pendenze a 13, 300 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare una pompa dell'acqua per aspirare la fase superiore, che contiene cloroplasti rotti e mitocondri intatti.
Quindi, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per recuperare i cloroplasti intatti presenti nella fase inferiore, facendo attenzione a non aspirare i nuclei e i detriti cellulari trovati nella parte inferiore del tubo insieme ai cloroplasti intatti. Diluire la sospensione cloroplasta intatta da tre a quattro volte con mezzo di lavaggio. Conservare circa 10 millilitri di un'aliquota di frazione cloroplasta intatta per ulteriori analisi da parte di SDS-Page e Western blotting.
Centrifuga a 2070 G e quattro gradi Celsius per due minuti. Dopo questo, scartare delicatamente il supernatante. Utilizzare una pompa dell'acqua per aspirare qualsiasi supernatante rimanente e mantenere il pellet, che contiene cloroplasti grezzi concentrati, sul ghiaccio.
Per llyse i cloroplasti intatti purificati, sospendere di nuovo il pellet in mezzo ipotonico che contiene inibitori della proteasi. Trasferire i cloroplasti ri-sospesi in un tubo di falco da 10 millilitri. Preparare il gradiente di saccarosio come indicato nel protocollo di testo.
Utilizzando una pompa peristaltica, caricare lentamente tre millilitri dei cloroplasti lisciviati sopra ciascuno dei gradienti di saccarosio pre-formati. Utilizzare tampone medio ipotonico per bilanciare coppie di tubi, quindi ultra-centrifugare il gradiente a 70.000 G e quattro gradi Celsius per un'ora. Prendere un'aliquota delle proteine stromali solubili da utilizzare nella determinazione della concentrazione proteica.
Successivamente, utilizzare una pompa dell'acqua per aspirare la fase superiore rimanente del gradiente fino alla banda gialla. Utilizzando una pipetta, recuperate la banda gialla, che è la busta. Tirare le buste in un unico tubo.
Quindi, rimuovere la fase rimanente della sfumatura fino al pellet di tilacoide. Sospendere di nuovo i pellet di thylakoid nel tampone di lavaggio a membrana con inibitori della proteasi. Diluire la sospensione tilacoide e avvolgere da tre a quattro volte con mezzo di lavaggio, regolando il volume finale a 10 millilitri.
Bilancia coppie di tubi con tampone di lavaggio a membrana e ultra-centrifugali a 110.000 G e quattro gradi Celsius per un'ora. Successivamente, utilizzare una pompa dell'acqua per aspirare con cura il supernatante. Aggiungere circa 100 microlitri di tampone di lavaggio a membrana al pellet dell'involucro.
Quindi, aspirare il supernatante dal tubo tilakoide. Sospendere di nuovo i pellet di tilacoide in tre millilitri di tampone di lavaggio a membrana. Conservare i tre sottocomparti purificati in azoto liquido per utilizzarli in ulteriori esperimenti.
Dopo che le frazioni di membrana sono state recuperate, lavate e concentrate, SDS-Page viene utilizzato per quantificare le proteine e analizzare la composizione di tutte e quattro le frazioni. La proteina più abbondante dello stroma è l'RBCL, e i risultati rappresentativi mostrano il risultato atteso, che pochissima della grande subunità di questa proteina è contenuta nelle frazioni di membrana tilakoide e avvolta. Le proteine complesse che raccolgono la luce sono abbondanti componenti tilacoidi che dovrebbero a malapena contaminare le membrane dell'involucro.
Infine, il traslocatore fosfato trioso fosfato è visibile solo nella frazione dell'involucro purificato, a causa del suo forte arricchimento nella frazione dell'involucro rispetto all'intero estratto di cloroplasto. La contaminazione incrociata dei tre sottocomparti, la ruttoisomerasi chetoisomerasi solubile dallo stroma, l'involucro di cloroplasto in rame ATPasi e le proteine complesse di raccolta della luce dalle membrane tireoidi possono essere quantificate utilizzando sia l'analisi immunoblotting che l'analisi della spettrometria di massa. Mentre lo stroma di solito non è contaminato da busto o frazioni di tilacoide, le frazioni di busta purificata contengono il 3%di proteine tilacoidi e fino al 10% di proteine dallo stroma.
I thylakoidi sono scarsamente contaminati dalle proteine dello stroma, ma contengono fino al 3% delle proteine della membrana dell'involucro. I cloroplasti svolgono molte funzioni cruciali come l'assimilazione di carbonio, zolfo e azoto, così come la sintesi di metaboliti essenziali. Al fine di decifrare nuovi meccanismi regolatori che controllano la fisiologia dei cloroplasti, definire la localizzazione della surplastica delle proteine cloroplaste è fondamentale per studi super mirati.
I cloroplasti contengono diversi sottocomparti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cloroplasto, come dove si trova una proteina cloroplasta specifica all'interno dell'organelli. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di condurre tutti i passaggi di isolamento del cloroplasto a quattro gradi per rimettere la resistenza alla protea in frazioni purificate.
Seguendo questa procedura, altri metodi come gli approcci proteomici lascare possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come la composizione e la dinamica del proteoma dei valori dei sottocomparti plastidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia vegetale per esplorare molti aspetti diversi della biogenesi e della funzione dei cloroplasti utilizzando un'analisi mirata delle proteine candidate identificate all'interno dei sottocomparti plastidi. Non dimenticare che lavorare con frullatore di volume, azoto liquido, su composti specifici come gli inibitori della proteasi, richiede cure speciali.
Durante l'esecuzione di questa procedura devono sempre essere prese precauzioni come indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
