Vorremmo riconoscere il sostegno del programma del Governo del Victoria Operativa Infrastrutture di supporto, il collegamento Progetti Scheme (con Agilent Technologies) Australian Research Council, l&#39;Australian Research Centre Cooperative National Health and Medical Research Council, la banca del cervello vittoriana, per la salute mentale e il Neuroproteomics servizio, struttura.

1. Preparazione di buffer e Campioni <ol><li> Preparare 500 ml di tampone, 200 mM di nitrato di ammonio pH 7,6 - 7.8 (pH regolato con idrossido di ammonio (NH 4 OH)) con cesio (Cs) e antinomy (Sb) aggiunto ad una concentrazione finale di 10 ppb. Utilizzare cesio e antinomia come standard interni per monitorare qualsiasi deriva nella risposta di ICP-MS. tampone filtro prima dell&#39;uso attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Preparare campioni a seconda del tipo di campione: liquido, tessuti o coltura cellulare. <ol><li> Per i campioni che richiedono omogeneizzazione (ad esempio, tessuti o cellule), assicurarsi che non contengono detersivo. Utilizzare i buffer Tris per la preparazione del campione. In alternativa, utilizzare tamponi fosfato, ma possono influire negativamente sul metalloproteome nel tempo o con cicli di gelo-disgelo 12. </li><li> Omogeneizzare campioni di tessuto o di colture cellulari di Dounce manuale o sonicazione per 5 min con Tris tamponata salina (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM di cloruro di sodio(NaCl) + acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) inibitori della proteasi libere). </li><li> Chiarire omogeneizzati per centrifugazione a 16.000 xg per 5 min. Raccogliere il surnatante risultante. I campioni a 4 ° C. Nota: Tutti i campioni devono essere centrifugati prima di caricare nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) fiale per evitare che le particelle di bloccare la colonna dimensione esclusione cromatografia (SEC). </li></ol></li><li> Normalizzare la quantità totale di proteine ​​caricate sulla colonna di tutti i campioni. Determinare le concentrazioni di proteine ​​a 280 nm utilizzando un micro volume di spettrofotometro UV 13. Carico tra 20 e 150 mg di proteine. Utilizzare volumi tipici iniezione vanno da 2 - 80 microlitri seconda della concentrazione del campione. <ol><li> Pulire il braccio del campione del micro spettrofotometro volume di UV con acqua distillata prima di caricamento del campione. Il braccio del campione è dove i campioni di proteine ​​vengono caricati. </li><li> Vuoto lo strumento contro 2 ml di thtampone campione e. Poi, carico 2 ml di ogni campione sul braccio e misurare l&#39;assorbanza a 280 nm. </li><li> Determinare le concentrazioni. Per i campioni proteici grezzi, utilizzare un coefficiente di estinzione di 1 Abs = 1 mg / ml. Per determinare la concentrazione di proteine ​​nei campioni, utilizzare la legge di Beer-Lambert, A = ε xlxc, dove A è l&#39;assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, l è la lunghezza del percorso in centimetri e c è la concentrazione. </li></ol></li></ol> 2. Analisi di massa di metalloproteine ​​Standards Utilizzando plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa <ol><li> Warm-up e accordare lo strumento utilizzando i protocolli del produttore. </li><li> Una volta strumento viene riscaldato e messo a punto, eseguire massa ICP-MS. Nota: Le soluzioni madre di metalloproteine ​​purificati in genere bisogno di essere diluito prima della misurazione. La concentrazione di metallo dello standard può essere stimata dalla proteina nota: stochiometries metallo e concentrazione di proteine ​​stimatozione. Questa informazione può essere utilizzata per determinare la diluizione che sarà opportuno rientrare nell&#39;intervallo della curva standard generata. <ol><li> Diluire standard metalloproteine, tireoglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12, per garantire che rientrano nel range di 0 - 500 mg / L, con acido nitrico 1%. Per raggiungere gli standard all&#39;interno di questo intervallo, non utilizzare diluizioni superiori a 1 a 20. Effettuare diluizioni seriali in acqua per diluire le scorte prima di questo, se necessario. </li><li> Impostare l&#39;ordine di iniezioni. Innanzitutto, analizzare i sette livelli di taratura, concentrazioni comprese tra 0 - 500 mg / L, seguiti dalle norme metalloproteine. I sette livelli di calibrazione sono 0, 1, 5, 10, 50, 100 e 500 mg / L. </li><li> Selezionare gli elementi di interesse. Qui, utilizzare Fe, Cu, Zn, Co e io, in quanto sono gli elementi che le norme proteiche sono tenuti a. Selezionare gli elementi nel metodo dell&#39;acquisizione aprendo la scheda selettore di elementi e aggiungendo il eleme<html> NTS e le rispettive masse isotopi che devono essere analizzati. </li><li> Effettuare analisi campione con lo strumento e il software dello strumento crea automaticamente le curve di calibrazione per ciascuno degli elementi oggetto di analisi. Le curve di calibrazione sono create dal software tracciando il conteggi / sec del metallo rilevato contro la quantità di metallo che lo standard è destinato a contenere, in mg / L. Utilizzare le curve di calibrazione per determinare la concentrazione di metallo nei campioni sconosciuti. Nota: Usando la curva di calibrazione, il software determina la concentrazione di metallo in ciascuna soluzione standard metalloproteine. </li><li> Dai risultati delle analisi di massa, generare standard metalloproteine ​​che includono i tre elementi in tracce più abbondanti nei tessuti di mammifero usando una miscela di Cu, Zn superossido dismutasi (SOD) diluito a 200 mg / l di rame e zinco e ferritina (FTN) ad una finale concentrazione di 2.000 mg / L di ferro. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Setup HPLC del sistema e Size Exclusion Equilibration cromatografia Colonna Nota: Questa sezione deve essere eseguita in parallelo al precedente, poiché entrambi necessari circa 1-1,5 ore per completare. <ol><li> Pompe di spurgo HPLC con tampone fatta allo step 1.1 e spurgare le pompe per 5 min ad una velocità di flusso di 5 ml / min. </li><li> Una volta che il sistema viene spurgato, impostare la portata a 0,1 ml / min e collegare la colonna di esclusione dimensionale (4,6 x 300 mm, 3 micron, 150 Å). Nota: una connessione bagnata tra il tubo e la colonna evita eventuali bolle d&#39;aria intrappolate in fase durante la connessione della colonna. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta della colonna al rivelatore UV impostato per misurare l&#39;assorbanza a 280 nm usando tubo PEEK. </li><li> Aumentare gradualmente la velocità di flusso della colonna in passi da 0,05 - 0,1 ml / min fino ad una velocità di flusso finale di 0,4 ml / min è raggiunto. Anche se questo è in corso, controllare i collegamenti dei tubi alla colonna di eventuali perdite. Monitorare la pressionedel sistema per garantire che non superi i requisiti delle colonne osservando la traccia pressione sul cromatogramma nel software. </li><li> Lasciare la colonna per equilibrare alla portata richiesta in 5 - 10 volumi di colonna. Dopo che è equilibrato, collegare gli strumenti per consentire l&#39;analisi del campione a verificarsi. </li><li> Impostare il metodo HPLC alla pompa tampone A sopra la colonna a 0,4 ml / min per 15 min. </li></ol> 4. creazione e la gestione Size Exclusion - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Nota: le procedure operative possono variare tra gli strumenti e modelli. Contatta lo specialista tecnico dello strumento per ulteriori informazioni su come configurare la ICP-MS in uso. <ol><li> Posizionare la ICP - MS in modalità standby prima di cambiare l&#39;impostazione hardware. <ol><li> Una volta in modalità standby, spegnere la comunicazione per il campionatore automatico e cambiare l&#39;introduzione del campione di &quot;altro&quot;. Nota: A seconda del software e duroware configurazione selezionando &quot;HPLC&quot; come fonte di introduzione del campione può essere utilizzato. Contatta lo specialista tecnico strumento per sapere se questa opzione è disponibile. </li></ol></li><li> Utilizzare PEEK tubo (ID 0,13 millimetri) per collegare il flusso in uscita dal rivelatore UV direttamente al nebulizzatore sul ICP-MS. </li><li> Potenza backup ICP - MS e lasciare lo strumento si riscaldi per 10 - 20 min. </li><li> Dopo il plasma è acceso, collegare il cavo remoto dal ICP - MS al retro del autocampionatore HPLC. Fate questo una volta che il plasma è acceso; altrimenti il ​​sistema HPLC si spegne automaticamente dal momento che la ICP - MS non è acceso. </li><li> Modificare il metodo ICP-MS per raccogliere i dati per LC-ICP-MS. <ol><li> Modificare il metodo di acquisizione da spettro di acquisizione in tempo risolvere (TRA). </li><li> Selezionare gli elementi da analizzare, Fe, Cu, Zn, Co, I, nonché qualsiasi altro elemento di interesse, ed i tempi di integrazione impostato (tipicamente tra 0,05-0,3 sec). Dopo che gli elementi di interesse unare scelto, regolare il tempo di acquisizione in base al tempo di funzionamento per la cromatografia (ad esempio, 900 secondi per una corsa cromatografia 15 min). </li><li> sintonizzare manualmente la ICP - MS dell&#39;elio sensibilità e collisione cella (He) portate di gas con il buffer cromatografia scorre utilizzando Cs e Sb inclusi nel buffer. Le portate He sono tipicamente ~ 1 ml / min inferiore a quelli utilizzati per l&#39;analisi di massa. Una volta che i conteggi di ioni metallici sono stabilizzati e valori deviazione standard relativa (RSD) sia inferiore al 5%, il sistema è pronto per l&#39;uso. </li></ol></li><li> Fare il campione liste eseguiti sia in HPLC e programmi software ICP-MS. L&#39;elenco esecuzioni campione contiene l&#39;ordine in cui ciascuno dei campioni deve essere iniettato, così come il nome con cui salvare i dati. Controllare che il numero totale di campioni nella partita lista tra i due programmi. </li><li> Avviare il lotto di campioni per ICP-MS prima della HPLC, come l&#39;iniezione del campione per HPLC attiverà l&#39;ICP - MS per iniziare a raccoglieredati. Se questo non avviene nell&#39;ordine corretto si tradurrà in dati mancanti. </li><li> Genera punti della curva di calibrazione iniettando diversi volumi della SOD e miscela standard FTN da 200 mg / L a 6.000 mg / L iniettato su colonna per Cu e Zn e 2.000 mg / L fino a 60.000 mg / L per Fe. volumi di iniezione vanno da 1 a 30 ml. Nota: Questi intervalli di concentrazione comprendono le concentrazioni di Fe, Cu e Zn tipicamente osservati in omogenati complesse. Per i campioni che contengono solo le proteine ​​purificate la portata massima della curva deve essere regolata di conseguenza. Poiché la quantità di metallo associati con la proteina può richiedere un intervallo più piccolo o più grande poiché non vi è meno contaminazione del campione da altri fattori. </li><li> Analizzare ciascuno dei coltura di tessuti campioni sconosciuti, plasma o cellule. </li></ol> 5. Analisi dei dati, manipolazione e visualizzazione <ol><li> Memorizzare i dati di valore separati da virgola (CSV) formato di file e caricare into programmi di elaborazione, come richiesto. </li><li> Al fine di controllare per lo strumento deriva, dividere i conteggi per secondo per ogni elemento dai conti al secondo per entrambi Cs o SB. </li><li> Generare curve di calibrazione per ciascuno degli elementi. <ol><li> Determinare l&#39;area sotto il picco del metallo corrispondente al metalloprotein che essa è destinata a per ciascuna delle iniezioni eseguendo l&#39;integrazione dei picchi nel software di analisi dati preferito. </li><li> Tracciare l&#39;area sotto il picco del metallo contro l&#39;importo totale del metallo che è stato iniettato nella colonna in ciascuna prova, 200 - 6.000 mg / L per Cu e Zn e 2.000 - 60.000 mg / L per Fe. Eseguire analisi di regressione lineare secondo il protocollo software. </li><li> Utilizzare i risultati pendenza dall&#39;analisi di regressione lineare come fattore per convertire conteggi al secondo per pg / sec. Dividere ciascuno dei conteggi per punti dati secondo tutto il cromatogramma dal gradiente del valore della linea. </li></ol></li><li> Grafico i dati inpg / sec contro il tempo cromatogramma. Determinare l&#39;area sotto i picchi di interesse. L&#39;area sotto il picco rappresenta la quantità totale di metallo che la proteina è destinato a, in pg. </li><li> Generare una calibrazione basato sul peso molecolare delle metalloproteine ​​conosciuti e il momento in cui essi eluiscano. Usare questo per valutare la dimensione dei picchi di proteine ​​in campioni complessi. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Assicurare lo stato nativo della proteina significa particolare attenzione ai buffer utilizzati e sono necessarie conservazione del campione. Non tutte le tecniche di cromatografia o tecniche di preparazione dei campioni possono essere impiegate. È importante che i buffer utilizzati durante la preparazione del campione e la cromatografia sono privi di chelanti di metalli e utilizzare buffer che imitano le concentrazioni di pH e di sale fisiologico. Altre condizioni da evitare sono il riscaldamento del campione o l&#39;aggiunta di proteine ​​denaturanti (ad esempio, urea). È fondamentale per minimizzare il numero di cicli di gelo-disgelo. La capacità del buffer scelto di legare metalli bivalenti è importante e una ragione che Tris o ammonio nitrato buffer sono scelti fra i respingenti base di fosfato. La risoluzione e bassa capacità di picco della cromatografia ad esclusione sterica rispetto ad altre forme di cromatografia è un grosso limite di questa tecnica. Tuttavia, la natura gentile di dimensioni esclusione crPHY è importante mantenere lo stato nativo della proteina e quindi preservare i legami metallo-proteina relativamente deboli. Il requisito per mantenere lo stato originario delle proteine ​​richiede una particolare attenzione al trattamento dei campioni anche limitare il numero di cicli di gelo-disgelo, evitando chelanti di metalli (ad esempio, EDTA) o sali caotropici e detergenti. Questa bassa risoluzione di questa tecnica influenzano la capacità di quantificare la quantità di metallo associato con una proteina specifica se è in un campione complesso come i picchi osservati conterrà più di una proteina. Pertanto, la quantità di metallo determinato con l&#39;integrazione dei picchi sarebbe un&#39;indicazione della quantità totale di metallo associati con tutte le proteine ​​eluendo a questo punto di tempo e non solo una proteina specifica. Per superare questa limitazione della proteina di interesse dovrebbe essere ulteriormente purificato in condizioni native. Ciò consentirebbe per la quantificazione diil metallo associato a questa proteina da segnalare con un più alto grado di Certezza. Un altro potenziale limite di questa tecnica sarebbe la perdita di proteine ​​dovuta al legame reversibile non alla colonna. Al fine di determinare se questo accade un esperimento di recupero deve essere effettuata per cui la quantità di proteine ​​eluizione largo della colonna viene analizzato per determinare se questo corrisponde alla quantità iniettata. Lo stesso può essere fatto misurando il contenuto di metallo del materiale eluizione e il materiale di partenza da massa ICP-MS. Recupero colonna può variare a seconda delle condizioni utilizzate, ma è stato dimostrato che il recupero completo di proteine ​​da una colonna dimensioni esclusione è possibile 9. Pertanto è importante controllare se vi è alcuna perdita nelle condizioni operative utilizzate. Le modifiche al protocollo possono essere correlati agli standard metalloproteine ​​che vengono utilizzati, così come gli elementi analizzati. Il tipo di metalloproteine ​​standard degli Stati UnitiEd sarà diverso a seconda degli elementi che sono di interesse. Per elementi come Cu, Fe e Zn proteine, SOD e ferritina sono impiegati. Qualsiasi altro metalloprotein che hanno stoichometries noti può essere utilizzato e alcuni esempi sono stati qui mostrato. Una complicazione maggiore che può derivare dall&#39;uso di questa tecnica è la formazione di cristalli di sale nella torcia della ICP-MS. Per impedire la formazione di cristalli di sale, la torcia viene lavata con acqua distillata ogni 500 - 1,000 ml di tampone che è stato passato attraverso il sistema o quando viene determinato mediante ispezione visiva che la torcia deve essere lavato. Un altro problema che può sorgere è un rapido declino più nella pulizia dei coni campione ed estrazione. Questi devono essere puliti regolarmente seguendo i protocolli del produttore. La preparazione del campione iniziale è la fase più critica nel protocollo. Se ci sono eventuali modifiche alla proteina - il complesso metallico informazione generato non sarà valida. Questo è uno dei principali limiti della tecnica; inoltre l&#39;uso della bassa risoluzione, colonna esclusione dimensionale produce una vista dettagliata limitata della vera complessità delle metalloproteine ​​in biologia. La tecnica qui descritta permette l&#39;espansione della conoscenza del metalloproteome di un organismo. analisi Bulk dà solo un&#39;indicazione grezza di modifiche alla quantità di metallo in un campione. Oltre alle considerazioni generali che devono essere presi in considerazione, questa tecnica fornisce uno strumento che può essere usato per quantificare la quantità di metallo associati con proteine ​​e metalloproteine ​​identificazione che differiscono confrontando i tracciati ottenuti. L&#39;uso di questa tecnica può essere utilizzata per identificare le differenze tra stati di malattia. Le metalloproteine ​​identificate possono poi essere ulteriormente studiati per aiutare a determinare il ruolo che svolgono nei processi di malattia. L&#39;applicazione di un trattino ICP-MS ha una crescitafuturo per determinare il ruolo dei farmaci che hanno un eteroatomo come platino, iodio o rame come ICP-MS può essere utilizzato per identificare le proteine ​​che il farmaco si lega.

metalli essenziali svolgono un ruolo fondamentale nelle funzioni biologiche normali, tra cui percorsi di messaggistica secondarie, percorsi del metabolismo e le funzioni degli organelli. Il 30% di tutte le proteine ​​sono pensato per essere metalloproteine ​​1 e il 50% di tutti gli enzimi 2. Metalloenzimi utilizzano questi metalli in tracce come cofattori di catalizzare reazioni chimiche, stabilizzare la struttura delle proteine, e per i ruoli di regolamentazione, come messaggeri secondari. Alcuni degli oligoelementi più studiati con riferimento a neurodegenerazione sono rame, ferro e zinco 3. Si pensa di essere coinvolti in molte vie malattia in cui da dyshomeostasis può avere effetti negativi. Per esempio lo stato di metallo di superossido dismutasi (SOD) direttamente gli impatti del ciclo di vita e il fenotipo dei modelli di topi transgenici di tipo familiare di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 4. Nella malattia di Alzheimer, metalloproteomics tecniche sono state utilizzate per scoprire una diminuzione dello stato metallico di transferrina in pLasma 5. Questi studi evidenziano le importanti metalloproteine ​​ruolo possono giocare nella malattia. Lo studio di metalloproteine ​​direttamente dai tessuti biologici è un campo in via di sviluppo. Anche se alcuni metalloenzimi sono stati caratterizzati, la maggior parte rimane ancora indefinita o sconosciuti 6. Una delle principali sfide in metalloproteine ​​di misura è l&#39;obbligo di mantenere lo stato nativo della proteina 7. Classica bottom-up tecniche di proteomica si basano sulla digestione delle proteine ​​in peptidi. Questo processo interrompe l&#39;interazione non covalente di metalli e loro proteine. Quindi, nessuna informazione sullo stato di metallo di una proteina è guadagnato. Un modo per superare questo problema è quello di utilizzare la cromatografia dimensione esclusione in coppia con plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa 8,9 (SEC-ICP-MS). Questo genera informazioni sulla dimensione approssimativa della proteina così come tutti i metalli che sono assocIATED con esso 10. Inoltre, l&#39;esclusione dimensioni è una delicata tecnica cromatografica che può preservare lo stato nativo di un complesso enzimatico o proteina-proteina. Un vantaggio di utilizzare plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (ICP-MS) è la natura quantitativa della tecnologia. Utilizzando un insieme di standard metalloproteine ​​è possibile fornire quantificazione assoluta di metalloproteine ​​da campioni biologici 9,11. Questo risultato è ottenuto generando una curva standard iniettando metalloproteine ​​noti in un range di concentrazioni di metalli. Questo protocollo mostra un esempio di come questo può essere realizzato per una varietà di standard metalloproteine. In questo articolo ci proponiamo di creare curve standard per i metalli che sono in gran parte studiati nei campi biologici tra cui ferro (Fe), rame (Cu), zinco (Zn), iodio (I), e il cobalto (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

L&#39;uso di standard metalloproteine ​​consente la taratura della colonna esclusione dimensionale. Figura 1A mostra il profilo di eluizione per gli standard tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12 in base al metallo che essi sono tenuti a (Fe, Co, Cu, Zn e I). Figura 1B mostra la curva di calibrazione per la colonna esclusione dimensionale in base al peso molecolare degli standard proteine ​​e il loro tempo di eluizione, presentata nel formato di volume di eluizione (Ve) diviso per il volume vuoto della colonna (Vo). Le proteine ​​utilizzate per generare questa curva standard sono Concanavalina A, conalbumina, ceruloplasmina, ferritina, SOD e tireoglobulina. La Figura 2A mostra l&#39;eluizione di ferritina su una gamma di 2.000 - 60.000 pg di Fe iniettato su colonna e la figura 2D è l&#39;analisi di regressione effettuata utilizzando pzona eak. Figure 2B e 2C sono i profili di eluizione per Cu / Zn SOD per Cu e Zn e 2E e 2F sono l&#39;analisi di regressione generata utilizzando aree dei picchi. I risultati dell&#39;analisi di regressione sono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi / sec a pg / sec modo la quantità di metallo associati con la proteina può essere determinata quantitativamente. La conversione viene eseguita dividendo il conteggi / sec dalla pendenza della regressione lineare (ad esempio, 334,6 (conteggi / sec) x (sec / pg) di rame). Come detto, questa tecnica può essere utilizzata per identificare metalloproteine ​​in campioni biologici complessi. Il cervello umano e nel plasma sono stati sottoposti a questa tecnica e le figure 3 e 4, rispettivamente, mostrano i risultati ottenuti. Il cervello umano separati da SEC-ICP-MS è mostrato nelle figure 3A-3C, ciascuna delle quali rappresenta un metallo diverso<html> interesse (Cu, Zn o Fe). Figure 4A-4C mostrano le tracce ottenute quando plasma umano è sottoposto a questa tecnica. La complessità e l&#39;abbondanza del campione avrà un impatto sul numero di picchi che si vedono. Come previsto il plasma è dominato da un paio di metalloproteine ​​tra ceruloplasmina e transferrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figura 1. La calibrazione del Size Exclusion Chromatography - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Utilizzando noto profilo di Metalloproteine ​​(A) eluizione per gli standard di metalloproteine ​​in base alle loro rispettive metalli.. (B) della curva di taratura di peso molecolare per gli standard di proteine ​​tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbumina (iv), Cu / Zn SOD (v) e concanavalina A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figura 2. Utilizzo della ferritina e Cu / Zn SOD come metalloproteine ​​standard per determinare la quantità di Cu, Fe o Zn associati con Metalloproteine ​​in un campione biologico complesso (A) profilo di eluizione per ferritina nel range di iniezione di 2.000 -. 60.000 mg / L di ferro. (B) e (C) il profilo di eluizione per Cu / Zn SOD nell&#39;intervallo di iniezione di 200 - 6.000 mg / L rispettivamente rame e zinco,. (D), (E) e (F) mostrano i risultati dell&#39;analisi di regressione per i metalli di ferro, rame e zinco, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. Cu, Fe e Zn Metalloproteome del cervello umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione degli standard di proteine ​​per ogni metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolare, indicato sotto il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figura 4. Cu, Fe e Zn Metalloproteome per il plasma umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione delle norme proteiche per ciascun metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolaredicato sotto il grafico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

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15.1K Views.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Ricerca

Chimica

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Esame quantitativa e qualitativa delle interazioni particella-particella colloidale Uso Probe Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d&#39;esame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semi

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Misura della dimensione delle particelle di distribuzione in torbidi soluzioni da Dynamic Light Scattering Microscopia

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabbricazione e collaudo di termometri fotonici

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Applicazione di tensione nell'analisi dinamica delle particelle di dispersione della luce

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Preparation of Nanoparticles for ToF-SIMS and XPS Analysis

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, chemistry, and their potential to enable advanced materials. To effectively understand and regulate the physico-chemical properties and potential adverse effects of nanoparticles, validated measurement procedures for the various properties of nanoparticles need to be developed. While procedures for measuring nanoparticle size and size distribution are already established, standardized methods for analysis of their surface chemistry are not yet in place, although the influence of the surface chemistry on nanoparticle properties is undisputed. In particular, storage and preparation of nanoparticles for surface analysis strongly influences the analytical results from various methods, and in order to obtain consistent results, sample preparation must be both optimized and standardized. In this contribution, we present, in detail, some standard procedures for preparing nanoparticles for surface analytics. In principle, nanoparticles can be deposited on a suitable substrate from suspension or as a powder. Silicon (Si) wafers are commonly used as substrate, however, their cleaning is critical to the process. For sample preparation from suspension, we will discuss drop-casting and spin-coating, where not only the cleanliness of the substrate and purity of the suspension but also its concentration play important roles for the success of the preparation methodology. For nanoparticles with sensitive ligand shells or coatings, deposition as powders is more suitable, although this method requires particular care in fixing the sample.

A number of different procedures for preparing nanoparticles for surface analysis are presented (drop casting, spin coating, deposition from powders, and cryofixation). We discuss the challenges, opportunities, and possible applications of each method, particularly regarding the changes in the surface properties caused by the different preparation methods.

Preparazione di nanoparticelle per l'analisi ToF-SIMS e XPS

Nanoparticles have gained increasing attention in recent years due to their potential and application in different fields including medicine, cosmetics, ...