Il nostro metodo è significativo, in quanto consente al biochimico medio di determinare rapidamente se i campioni isolati utilizzando la cromatografia di affinità metallica immobilizzata sono contaminati da metalli di transizione. Il vantaggio principale è la facilità con cui il saggio può essere eseguito. Il saggio utilizza strumentazione e tecniche comuni alla maggior parte dei laboratori di biochimica e può essere implementato facilmente e rapidamente.
Mentre in questo articolo applichiamo questo metodo per campioni isolati con una colonna nichel-NTA, il metodo può essere utilizzato con qualsiasi altra resina di affinità metallica. Gli utenti per la prima volta dovrebbero provare questo metodo con una soluzione di stock di nichel di concentrazione nota. Ciò li familiarizzerà con il flusso di lavoro, i colori campione e le resine mostrate nelle modifiche spettrali.
A dimostrare la procedura sarà Cole Swain, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, accendere e riscaldare lo spettrofotometro UV-Vis. Determinare le frazioni cromatografiche da testare utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a matrice di diodi con assorbanza ottica a 280 nanometri per quantificare la proteina.
Ottenere tampone di campioni da 10 a 100 millimolare con un PH compreso tra 7 e 12, ad esempio Tris, HEPES, MOPS e tampone fosfato. Preparare una soluzione del 12% peso per volume di dispersione HNB nel tampone del campione utilizzando 120 milligrammi di reagente HNB per ogni millilitro di soluzione stock preparata. Impostare lo spettrofotometro per raccogliere dati a 647 nanometri.
Utilizzare una cuvetta al quarzo riempita con il tampone del campione per sfoltare lo spettrofotometro. Preparare una soluzione di controllo in una cuvetta contenente 50 microlitri di stock di HNB per millilitro del volume totale del saggio. Lasciare incubare il controllo per un minimo di tre minuti a temperatura ambiente.
Misurare e registrare l'assorbanza a 647 nanometri per il campione di controllo. Preparare i campioni di dosaggio mescolando 150 microlitri di stock di HNB con 2850 microlitri di frazioni proteiche opportunamente diluite con il tampone del campione. Lasciare incubare il campione per un minimo di tre minuti a temperatura ambiente.
Ripetere la registrazione dello spettro per ogni frazione da misurare. Nel caso in cui si ottiene una diluizione insufficiente, l'intera banda spettrale a 647 nanometri è sparita. Mentre si è con una diluizione troppo forte, il campione non èdistinguibile dal controllo.
Per determinare la concentrazione di metallo in ogni campione, trovare prima la differenza di ogni assorbanza del campione a 647 nanometri dal controllo HNB. Determinare la concentrazione di metallo in micromolare usando la formula in cui DF è il fattore di diluizione per la frazione di saggio, delta A-B-S 647 è il cambiamento di assorbanza a 647 nanometri, 3,65 per 10 al negativo 2 rappresenta il coefficiente di estinzione di HNB, e l è il percorso ottico di cuvette in centimetri. In questo studio, lo spettro dell'HNB libero a PH neutro negli spettri rappresentativi delle frazioni saggiate per lo ione nichel dall'isolamento di MSP1E3D1 sono mostrati qui.
È stata osservata una ridotta assorbanza a 647 nanometri rispetto al controllo HNB, che corrispondeva alla formazione di complessi HNB in presenza di un metallo di transizione. Per dimostrare l'applicazione di questo saggio, sono state analizzate due proteine dell'impalcatura a membrana is-taggata, MSP1E3D1, MSP2N2 e un nuovo, tre eme, c-type cytochrome GSU0105, da geobacter sulfurreducens. Il contenuto di proteine e ioni di nichel di ogni frazione per GSU0105 è stato significativamente spostato l'uno dall'altro, mentre le frazioni per MSP1E3D1 e MSP2N2 che contenevano la maggior parte delle proteine avevano anche il più alto contenuto di nichel.
È anche illustrato che il contenuto di metallo potrebbe non essere distribuito uniformemente tra le frazioni raccolte utilizzando una cromatografia di affinità metallica mobilizzata. È più importante mescolare in modo adeguato e coerente il vuoto in tutti i campioni e consentire tempi di incubazione uguali per il vuoto in tutti i campioni. Le frazioni proteiche di particolare interesse potrebbero essere ulteriormente analizzate con spettrometria ad assorbimento atomico o ICPMS per confermare la contaminazione dei metalli e testare gli ioni metallici proteici chelati o fortemente legati.
Oltre al rilevamento della lisciviazione dei metalli di transizione, questa tecnica può essere utilizzata per misurare le affinità di legame negli ioni metallici di transizione alle proteine. L'HNB e qualsiasi nichel presente nei campioni sono irritanti rispettivamente per gli occhi e la pelle. Durante il metodo devono essere utilizzati DPI standard tra cui guanti e protezione degli occhi.
