EMS è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH) [codice di autorizzazione R01HL120919]; l&#39;American Heart Association [codice di autorizzazione 10SDG4350046]; Università di Rochester premio CTSA dal NIH [codice di autorizzazione UL1 TR000042]; e fondi di avvio del Aab CVRI. MAT è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per l&#39;Università di Rochester Scuola di Medicina e Odontoiatria del Howard Hughes Medical Institute Med-In-Grad iniziativa; e un Istituzionale Ruth L. Kirschstein Nazionale premio di servizio di ricerca dal NIH [codice di autorizzazione GM068411].

NOTA: Tutte sperimentazione con i topi sono stati approvati dal Comitato Università per le risorse animali presso l&#39;Università di Rochester. 1. epicardico escrescenza Cultura Assay (Figura 1A) <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare 5 ml di mezzo A per l&#39;isolamento delle cellule epicardico primaria, completandolo Medium 199 (M199) con siero 5% fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (Pen / Strep). </li><li> Pre-calda media A e 100 ml Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) a bagnomaria C 37 °. </li><li> Lasciare le diapositive da camera di collagene rivestite per riscaldare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 100 microlitri medio A ciascun pozzetto del vetrino camera e ruotare delicatamente per rivestire la superficie uniformemente collagene. Ripetere per 8-12 pozzi. Rimuovere media dopo le camere di verniciatura. </li><li> Aliquota pre-riscaldato HBSS in due 10 centimetri 2 piastre contenenti 50 ml di HBSS. </li></ol></li><li> Isolare embrionali Cuori da incinta Dam a 11,5 giorni post coitum (DPC).30 <ol><li> Anestetizzare mouse con 0,5 ml di 13 mg / ml di ketamina / 0,88 mg / ml di cocktail xilazina a 1x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) tramite iniezione intraperitoneale. Verificare il corretto anestesia utilizzando un test punta pizzico. Un pizzico delicato è sufficiente per determinare se il mouse è reattivo. Ogni movimento o zampa di ritirare indica l&#39;animale non è sufficientemente anestetizzato per fare un intervento chirurgico. Eutanasia da dislocazione cervicale. </li><li> Posare il mouse di fronte alla parte ventrale e spruzzare l&#39;addome con il 70% di etanolo per ridurre la contaminazione da capelli. </li><li> Pizzicare la pelle con una pinza e tagliare una incisione laterale in addome con le forbici chirurgiche. Tenere la pelle con fermezza e poi tirare a parte in direzioni opposte verso la testa e la coda. </li><li> Pizzica il peritoneo con una pinza e tagliare con le forbici per esporre la cavità addominale. </li><li> Rimuovere con attenzione il decidua tagliando lungo la mesometrio. Trasferire il decidua sezionato di pre-riscaldato HBSS nel primo10 cm 2 piastre. </li><li> Separare la decidua tagliando tra embrioni. </li><li> Trasferire un embrione alla seconda piastra 10 cm 2 con pre-riscaldato HBSS sotto un microscopio da dissezione. Rimuovere con attenzione il tessuto e sacco vitellino extraembryonic, quindi decapitare l&#39;embrione. </li><li> Pizzicare la parete toracica con una pinza e strappare il tessuto a parte sulla linea mediana, esponendo la cavità toracica. </li><li> Posizionare la pinza dietro il cuore. Afferrare il tratto di efflusso e tirare il cuore lontano dall&#39;embrione. Separare il tratto polmonare e polmoni dal cuore, se ancora attaccato. </li></ol></li><li> Trasferire il cuore ad un singolo pozzetto del vetrino collagene rivestite e posizionarlo lato dorsale verso il basso (Figura 1B). Ripetere i passaggi 1.2.7-1.3 per ogni embrione. </li><li> Una volta che tutti i cuori sono stati trasferiti a singoli pozzetti, incubare il vetrino camera per 30 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 per consentire l&#39;aderenza sufficiente per la matrice di collagene. </li><li> aggiungere con cautela20-50 ml di pre-riscaldato medio espianto Un attorno ad ogni cuore. Importante: Non aggiungere il mezzo troppo velocemente o ad un livello sopra il cuore, altrimenti cuori possono staccarsi dal substrato collagene. </li><li> Cultura i cuori a 37 ° C, 5% di CO 2 per circa 24 ore per consentire escrescenza epicardico. Nota: escrescenze possono essere osservati fin da 3-4 ore di cultura (Figura 1C) ed è composto principalmente da cellule mesoteliali che mostrano la morfologia ciottoli, con un minimo di contaminazione delle cellule mesenchimali (figure 1D, E). Risultati rappresentativi sono stati acquisiti utilizzando un microscopio dissezione dotato di una fotocamera. </li></ol> 2. genetica ablazione e induzione di EMT in epicardici escrescenze Attenzione: maneggiare con cura adenovirus secondo le linee guida di biosicurezza approvati. <ol><li> Preparare 15 ml di mezzo B (M199 integrato con 1% FBS e 1% Pen / Strep) e pre-riscaldare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Per l&#39;asportazione dialleli floxed, preparano espianto medio B integrato con 2,5 x 10 4 pfu / ml di adenovirus che esprimono Cre ricombinasi (Ad / Cre) o virus di controllo. Nota: adenovirale sovraespressione mediata di geni candidati può anche essere effettuato per valutare guadagno di fenotipi funzionali. titoli virali devono essere determinati da parte dell&#39;utente finale. </li><li> Rimuovere con cautela cuori epicardium-impoverito da culture escrescenza con pinze. cuori Trasferire provette da 1,5 ml con 800 ml Trizol e conservare a -80 ° C per l&#39;isolamento di RNA più tardi e analisi di espressione genica. </li><li> Lavare ogni pozzetto con DPBS per rimuovere le cellule del sangue e detriti cellulari in eccesso. </li><li> Aggiungere 500 microlitri espianto medio B supplementato con adenovirus (es) per ciascuna cultura escrescenza e incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Per EMT induzione, rimuovere i supporti e ricostituire con 37 ° C di media espianto B integrato con ricombinante del fattore di crescita trasformante (TGF) -β1 [10 ng / ml] o di un veicolo (4 mm HAcido ydrochloric (HCl) contenente 1 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA)). Espianti di coltura per un ulteriore 24 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Procedere con il gene / proteina analisi di espressione o immunocitochimica come indicato nei protocolli successivi. Nota: Induzione di EMT epicardico è stato stimolato con varie concentrazioni di TGF-β1 da 0,5 ng / ml - 10 ng / ml 26,31-33. Concentrazioni più elevate di ligando possono provocare vincolante per tutti i recettori TGF-β non specifico. La concentrazione di TGF-β1 dovrebbe riflettere gli obiettivi sperimentali specifici. </li></ol> 3. Analisi di espressione genica di epicardici escrescenze <ol><li> Scongelare cuori epicardium impoverito precedentemente memorizzati in Trizol (2.2). </li><li> supporti Aspirare da culture EPDC e lavare due volte con DPBS. </li><li> Aggiungere 800 ml Trizol temperatura ambiente per espiantare culture. </li><li> Incubare cuori epicardium-impoverito e culture EPDC in Trizol per 5 minuti a camera tempe<html> ri. Pipetta su e giù dieci volte per omogeneizzare il campione lisato. Nota: I cuori possono richiedere ulteriori pipettaggio per omogeneizzare completamente. </li><li> Trasferimento lisati provette da 1,5 ml e procedere con l&#39;isolamento di RNA totale per le istruzioni del produttore. Aggiungere 10 mg di glicogeno prima di precipitazioni per aumentare il rendimento RNA. Un dato espianto produrrà circa 0,5-1,0 mg di RNA. </li><li> Rimuovere contaminazione del DNA con DNasi I e invertire trascrivere 0,5 mg mRNA secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Convalida la purezza di espianti e / o induzione di EMT con trascrizione inversa quantitativa epicardici (qRT) -PCR 34 con SYBR verde e gli indicatori descritti nella tabella 1. Livelli di mRNA Normalizzare a gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e calcolare l&#39;espressione relativa utilizzando il 2 - metodo ΔΔCt 35. I risultati tipici sono mostrati nella Figura 2A. </li></ol>titolo &quot;Proteine ​​Analisi&gt; 4. di epicardici escrescenze <ol><li> supporti Aspirare da culture EPDC e lavare due volte con DPBS. </li><li> Aggiungere 10 microlitri tampone proteico lisi ghiacciato (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM cloruro di sodio, 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico pH 8,0, 1% Triton X-100, inibitore della proteasi 1x cocktail) per ciascuna camera bene e posizionare il vetrino alloggiamento su ghiaccio. Tagliare circa ¼ del fondo su un puntale P200 e utilizzare il pezzo rimanente per raschiare le cellule fuori della diapositiva. Pipetta su e giù per le cellule epicardial Lisare e trasferire in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Sonicare espianti lisati in basso (160 W) per 5 minuti in un bagno di acqua ghiacciata con 30 cicli sec ON e OFF. </li><li> lisati di centrifugazione per 10 min a 10.000 xg, 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando un saggio proteico 36. Nota: Un dato espianto produrrà fino a 1,5 mg di proteine ​​totali. Abbiamo scoperto che pooling espianti da due cuori und carico 2 mg proteine ​​per bene è sufficiente per rilevare muscolo liscio α-actina (ACTA2) e GAPDH 9. Il rilevamento di altre proteine ​​bersaglio può richiedere riunire più campioni espianto come determinato da parte dell&#39;utente finale. </li></ol> 5. Immunocitochimica di epicardici escrescenze <ol><li> Rimuovere i supporti da culture espianto e lavare due volte con DPBS. </li><li> Delicatamente aggiungere 500 ml di 4% (v / v) paraformaldeide o metanolo ghiacciata in ciascun pozzetto e fissare espianti per 5 min a temperatura ambiente o 10 min a -20 ° C, rispettivamente. Fissare secondo le specifiche di anticorpi, come raccomandato dal produttore. </li><li> Rimuovere fissativo e lavare ogni pozzetto con DPBS tre volte per 5 min. </li><li> Permeabilize le cellule con 500 ml di 0,1% (v / v) Triton X-100 in DPBS per 5 min. </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e risciacquare con DPBS tre volte per 5 min. </li><li> Bloccare le cellule con 10% di siero in DPBS per 30 min at room temperi. </li><li> Procedere con primaria colorazione anticorpi secondo le raccomandazioni del costruttore e condizioni ottimali, come determinato da parte dell&#39;utente finale. </li><li> Rimuovere soluzione di anticorpo e sciacquare con DPBS tre volte per 5 min. </li><li> Applicare anticorpo secondario secondo le istruzioni e di contrasto del produttore con un colorante nucleare appropriata. </li><li> Rimuovere soluzione di anticorpo e sciacquare con DPBS tre volte per 5 min. </li><li> Rimuovere pareti scorrevoli della camera le istruzioni del produttore e aggiungere mezzo di montaggio acquoso direttamente alle cellule. Mettere un vetrino sulle celle e sigillare con smalto. I risultati tipici sono mostrati in Figura 2B - 2D utilizzando invertito microscopio confocale a scansione. </li></ol> 6. Ex Cultura Vivo Assay (figura 3A) <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare 12 ml ex vivo terreno di coltura con un (1: 1) miscela di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM): M199 supplementato con 10%FBS e 1% Pen / Strep. </li><li> In un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, pre-calda ex vivo terreno di coltura e 100 ml HBSS. </li><li> Aliquota 1 ml di mezzo preriscaldata in 8-12 pozzetti di una piastra ben 24. </li><li> Trasferimento pre-riscaldato HBSS per due 10 cm 2 piastre, contenente 50 ml ciascuno. </li></ol></li><li> Isolare topo cuori embrionali in HBSS (come descritto in 1.2) da dighe in gravidanza a 12.5 dpc. </li><li> Trasferire ogni cuore ad un singolo pozzetto della piastra ben 24 contenente ex vivo terreno di coltura. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 con delicata dondolo manualmente o tramite una piattaforma oscillante per prevenire l&#39;adesione. procedere immediatamente al punto 7.1. </li></ol> 7. epicardico Etichettatura e EMT induzione in Culture ex vivo <ol><li> Per etichettare il epicardium, preparare 12 ml di 37 ° C ex vivo terreno di coltura integrato con 3,0 x 10 6 pfu / ml di Ad / GFP. Per l&#39;ablazione mirata di alleli floxed, trasferimento 6 ml di Ad / GFP integrato terreno di coltura in un tubo da 15 ml. Aggiungere Ad / Cre o controllare adenovirus ad una concentrazione finale di 1,5 x 10 6 pfu / ml. Nota: guadagno di funzione analisi può essere effettuata anche con adeguata adenovirale consegna del gene mediato. </li><li> Rimuovere con attenzione il terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra 24 e con una punta P 1.000 pipetta. </li><li> aggiungere delicatamente terreno di coltura integrato con adenovirus (ES) in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C, 5% di CO 2 per 24 ore con il dolce dondolio. </li><li> Per EMT induzione, preparare 12 ml di 37 ° C ex vivo mezzo di coltura contenente 10 ng / ml di TGF-β1 e 20 ng / ml fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) -BB o veicolo (4 mM HCl contenente 1 mg / ml BSA ). </li><li> Rimuovere con cautela terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra 24 e con una punta P 1.000 pipetta. Lavare delicatamente i cuori con 1 ml di DPBS. </li><li> Rimuovere le DPBS e riempire i cuori con ex vivo cultura meDIUM contenente TGF-β1 e PDGF-BB o di un veicolo. </li><li> Incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2 con dolce dondolio. </li></ol> 8. crioconservazione e immunoistochimica delle Culture ex vivo <ol><li> Preparare i cuori per la crioconservazione. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare i cuori due volte con DPBS gelide. </li><li> Aggiungere 1 ml di 4% (v / v) paraformaldeide ad ogni cuore e fissare per 2 ore a 4 ° C con dolce dondolio. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare i cuori due volte con DPBS. Trasferire i cuori di pozzetti freschi con 1 ml di 10% (w / v) di saccarosio preparata in DPBS. Incubare la piastra di notte a 4 ° C con dolce dondolio. </li><li> Trasferire accuratamente i cuori di nuovi pozzi con il 18% (w / v) di saccarosio preparato in DPBS. Incubare la piastra di notte a 4 ° C con dolce dondolio. </li><li> Trasferire ogni cuore ad un cryomold contenente tessuto medio di congelamento. congelare immediatamente blocchi utilizzando azoto liquido e conservare a -80 &amp; #176; C. </li></ol></li><li> cuori Sezione a 5 micron utilizzando un criostato e luogo sezioni di tessuto su vetrini da microscopio con carica positiva. Conservare scivola a -80 ° C fino a colorazione. </li><li> Eseguire immunoistochimica sulle sezioni per la rilevazione della membrana basale sub-epicardico. <ol><li> Scongelare vetrini per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Reidratare sezioni lavando due volte in DPBS per 5 minuti con dolce dondolio. </li><li> sezione permeabilize con 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte in DPBS per 5 minuti con dolce dondolio. </li><li> Blot off DPBS eccesso e definire la regione colorazione con una penna di etichettatura idrofoba. sezioni di blocco con il 10% di siero in DPBS per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere blocco e applicare collagene tipo IV anticorpi (ColIV, 1: 200) diluito in blocco. Incubare per una notte a 4 ° C in una camera ad umidità controllata. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in DPBS per5 minuti con dolce dondolio. </li><li> Diluire fluorescente anticorpo coniugato secondario (1: 500) e DAPI (1: 5.000) in DPBS e applicare alle diapositive. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Scegliere un anticorpo secondario adeguato con una lunghezza d&#39;onda di emissione e di eccitazione distinto da GFP. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti con dolce dondolio. Montare i vetrini con mezzo di montaggio. </li></ol></li></ol> 9. Imaging e quantificazione delle Culture ex vivo <ol><li> Avere un&#39;immagine utente cieco e quantificare sezioni colorate. Immagine almeno cinque sezioni di tessuto non consecutive da un dato di cuore in 4-5 posizioni arbitrarie lungo il epicardio (bordo del cuore) utilizzando un microscopio a fluorescenza o confocale a 40X di ingrandimento. I risultati tipici sono mostrati nella Figura 3B usando invertito microscopio confocale a scansione. </li><li> contare manualmente il numero totale di cellule positive GFP in una data immagine. Identificare la migrazione EPDC come GFP Pocellule sitive situati all&#39;interno o al di là della membrana subepicardico seminterrato ColIV. Determinare la percentuale di GFP migrazione delle cellule come il numero di migrazione di GFP cellule positive rispetto al numero totale di cellule positive GFP in una data immagine. I risultati tipici sono mostrati nella Figura 3C-D utilizzando invertito microscopio confocale a scansione. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo metodi dettagliati per isolare cellule epicardico primaria escrescenza e monitorare la migrazione EPDC in ex vivo culture cuore. Per culture escrescenza, il momento opportuno per rimuovere il cuore dell&#39;epicardio-impoverito varia leggermente tra esperimenti. Monitoraggio periodico degli espianti, dopo una notte di incubazione si raccomanda di valutare il grado di escrescenza epicardico e per estrarre il cuore prima che appaiano i fibroblasti. Per garantire la purezza, cuori devono essere rim...

L&#39;epicardio è un singolo strato di cellule mesoteliali che riveste il cuore e impatti cardiaca sviluppo, maturazione e riparazione. Attraverso uno scambio altamente coordinato di segnali paracrini, il dialogo intimo tra il miocardio ed epicardio è indispensabile per la crescita cardiaca e la formazione di non-miociti cardiaci linee 1. Cellule epicardial-derivato (EPDC) emergono da un sottogruppo di cellule epicardici attraverso una epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT) 2, invadere lo spazio subepicardico e del miocardio sottostante, e differenziare ampiamente in cellule parietali vascolari coronariche e fibroblasti cardiaci, e ad un in misura minore, le cellule endoteliali e cardiomiociti 3-9. I meccanismi che regolano EMT epicardico e EPDC invasione sono stati attribuiti all&#39;azione coordinata di varie molecole, tra cui ligandi secrete 10-13, recettori di superficie delle cellule e molecole di adesione, 14,15 regolatori di apicale-basale polarità 16,17, piccole GTPasi 18,19, e fattori di trascrizione 2,20,21. Mentre molti degli effettori molecolari della migrazione EPDC sono stati definiti, una migliore comprensione dei segnali fisiologici che stimolano EPDC mobilizzazione nell&#39;embrione può accelerare lo sviluppo di strategie per manipolare questo processo nell&#39;adulto per migliorare riparazione cardiaca. Studi volti ad identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione si basano su di purificazione di questa popolazione di cellule o di tracciare la migrazione di singole cellule epicardici. Uno o una combinazione di geni marcatori, tra WT1, Tcf21, Tbx18, e / o Aldh1a2, è comunemente usato per identificare il epicardio del feto 1. Tuttavia, l&#39;uso di questi marcatori per tracciare migrando EPDC non è ottimale come espressione di marcatori epicardici diminuisce nel corso dello sviluppo del cuore e spesso si perde quando le cellule subiscono epicardial transdifdifferenzia- in cellule mesenchimali. L&#39;applicazione del sistema Cre / loxP, in collaborazione con i giornalisti lineage tracing, è stato utile per etichettare in modo permanente la dell&#39;epicardio e dei suoi discendenti durante lo sviluppo del cuore e dopo danno ischemico nell&#39;adulto 7,22,23. Diversi epicardici-restricted linee Cre sono stati generati e sono ampiamente utilizzate per etichettare EPDC e per il gene condizionale cancellazione strategie 1. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione dei vari lignaggi epicardici, e l&#39;identificazione di mediatori critici di EPDC motilità e differenziazione. Tuttavia, l&#39;evidenza suggerisce anche accumulando dell&#39;epicardio è una popolazione eterogenea di cellule progenitrici 4,24,25. Così, solo un sottoinsieme di cellule epicardici sarà mirata utilizzando un dato conducente Cre. Per etichettare l&#39;intera epicardio indipendentemente Cre specificità, una serie di laboratori hanno utilizzato cul escrescenzasistemi ture o ex vivo metodi di coltura di organi per isolare fedelmente o l&#39;etichetta cellule epicardici senza dipendere l&#39;espressione di un lignaggio genetico marcatori 26-28. Per ex vivo studi sulla migrazione, cuori embrionali sono isolate prima di EMT epicardico e coltivate in media integrato con una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Questo approccio consente etichettatura efficiente dell&#39;intera epicardio piuttosto che un sottogruppo di cellule mediante ricombinazione Cre-mediata. Culture cuore vengono successivamente esposte a induttori noti di EMT per stimolare la mobilitazione di EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo analisi sono integrate da colture in vitro espianto epicardici, che sono un approccio particolarmente utile per esplorare i meccanismi dettagliati di guida migrazione EPDC. Qui, descriviamo i metodi per isolare le cellule epicardial primarie per gli studi in vitro di epicardial EMT, nonché un sistema di coltura organo per ex vivo analisi di EPDC motilità. Abbiamo recentemente dimostrato l&#39;utilità e la robustezza di questo metodo modulando geneticamente il fattore myocardin legati trascrizione (MRTF) / fattore di risposta del siero (SRF) di segnalazione asse di manipolare la migrazione actina-based di EPDC 9. Mentre i nostri risultati evidenziano una via di segnalazione necessaria per regolare la migrazione EPDC, questi metodi sono adatti per svelare i meccanismi che orchestrano la migrazione collettivamente EPDC e la differenziazione. Inoltre, l&#39;ex vivo sistemi di espianto e potrebbero essere implementate in schermi funzionali per identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione per le applicazioni terapeutiche nella rigenerazione cardiaca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

Un singolo strato di linee cellulari epicardiche cuore, fornendo fattori paracrini che stimolano la proliferazione dei cardiomiociti e contribuendo direttamente progenitori cardiovascolari durante lo sviluppo e la malattia. Mentre un certo numero di fattori sono stati implicati nella cella (EPDC) mobilitazione epicardium-derivati, i meccanismi che regolano la loro successiva migrazione e differenziamento sono poco conosciute. Qui, vi presentiamo in vitro ed ex vivo strategie per studiare EPDC la motilità e la differenziazione. In primo luogo, si descrive un metodo per ottenere cellule epicardici primarie dalla cultura escrescenza dal cuore embrionale del mouse. Presentiamo anche un protocollo dettagliato per valutare la migrazione tridimensionale marcato EPDC in un sistema di coltura di organi. Forniamo la prova utilizzando queste tecniche che delezione genetica di fattori di trascrizione myocardin legati nel epicardio attenua la migrazione EPDC. Questo approccio funge da piattaforma per valutare modificatori candidati di EPDCbiologia e potrebbe essere usato per sviluppare schermi genetici o chimici per identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione che potrebbero essere utili per la riparazione cardiaca.

L&#39;epicardio può essere isolato in modo efficiente utilizzando un test cultura conseguenza, approfittando della sua posizione esterna e sfruttando la plasticità dello sviluppo e comportamento migratorio intrinseca EPDC. Cuori embrionali murini sono isolate a E11.5 prima EMT epicardico e lato dorsale coltivate sul camera di diapositive collagene rivestite con 26 (Figura 1A, B). cuori espiantati continueranno a contrarsi; tuttavia, l&#39;epicardio aderirà ...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K Views.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

Video: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusione ex vivo della placenta del roditore

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...